Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из важных особенностей вирусов явпяется высокий уровень их генетической изменчивости, обусловленный большими репродукционными потенциями этих объектов, с одной стороны, и прессом селективных факторов хозяйских организмов с другой. Виды вирусов, существующие как наборы генетически гетерогенных вариантов за счет гипервариабельности отдельных участков генома, получили название "квазивидов" (Coffin, 1995). Генетическая гетерогенность была обнаружена не только при анализе состава вирусных популяций от множества пациентов, но и при изучении вируса в пределах одного инфицированного (McNearney et al., 1992). Прежде всего такая ситуация характерна для вирусов с длительным периодом персистенции. Из всех известных в настоящее время вирусов максимальный уровень изменчивости отмечен для группы лентивирусов и, в частности, для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ): различия между штаммами этого вируса по отдельным областям генома достигают 30-40%%. Однако все это разнообразие вариантов ВИЧ-1 удалось классифицировать на ограниченное число групп. В частности, в пределах вида ВИЧ-1 выделяют, три группы субтипов: группа «О», группа «М» и группа «N» (Robertson, 2000).
Среди гипервариабельных областей генома ВИЧ-1 особый интерес представляет петля области V3, поверхностного гликопротеина gpl20, которая состоит из 33-35 аминокислотных остатков, в зависимости от штамма вируса. К настоящему времени накоплено много данных о значимости V3 петли для проявления вирусом различных биологических свойств. Данная область участвует в формировании вирусных структур, взаимодействующих с корецепторами мишеневых клеток. В связи с этим существует определенная корреляция между структурой V3 петли и преимущественным использованием того либо иного корецептора, что определяет тропизм вируса (Westerwelt et al., 1992; O'Brien et al., 1998; Dragic et a!., 2001). В составе V3 петли локализуется основная нейтрализующая антигенная летерминанта ВИЧ-1. картированная в
РОС НАЦИОНАЛЬНА* і БИБЛИОТЕК* J
2 позициях 14-21 (Clerici et al, 1991; Palker et al., 1989; Takahashi et al., 1992; Семилетов и др., 1994). Однако сведения о направленности и характере изменчивости основной нейтрализующей детерминанты в ходе развития заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов в литературе практически отсутствуют.
Одной из самых консервативных областей генома вируса является область рої, и, в частности, последовательности гена, кодирующего обратную транскриптазу (ОТ) - ключевого фермента ВИЧ-1, обеспечивающего вирусную репликацию. Изучение генетической изменчивости данной области генома является важным для практического здравоохранения, поскольку, мутации устойчивости вируса к группе лекарственных препаратов нуклеозидной и ненуклеозидной природы, широко применяемых в химиотерапии ВИЧ инфекции, расположены в последовательностях гена ОТ.
В связи с этим нами была предпринята попытка ретроспективно проследить направленность изменчивости гипервариабельной и консервативной областей в когорте ВИЧ-инфицированных, имеющих в качестве источника заражения единственного пациента «О». В качестве удобной модели для проведения исследований была выбрана популяция пациентов, сформированная в результате внутрибольничной вспышки ВИЧ-инфекции на юге России в 1988-89 гг. (Ростовско-Элистинская вспышка) (Покровский, 1991)
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования явилось изучение эволюции гипервариабельных и консервативных участков генома ВИЧ-1. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Провести определение нуклеотидной последовательности и анализ петли V3 у вариантов вируса полученных в 1991-1992 гг. и 2000-2001 гг. от пациентов Ростово-Элистинской вспышки с целью определения
направленности и закономерности эволюции данной области на популяционном уровне.
-
Создание клонотек вирусных участков генома, кодирующих область V3 от пациентов 1991-1992 гг. и 2000-2001 гг. для проведения структурного анализа и выявления закономерностей эволюционного процесса этой области генома у отдельных пациентов.
-
Провести анализ гена обратной транскриптазы области рої у вариантов вируса G субтипа Ростово-Элистинской вспышки, полученных в 1991-1994 гг., 2000-2001 гг. и 2003-2004 гг.
-
Провести анализ мутаций устойчивости, возникающих при действии азидотимидином (АЗТ), а также другими нуклеозидными (НИ) и ненуклеозидными (ННИ) ингибиторами обратной транскриптазы.
Научная новизна и практическая значимость.
-
Показано направление эволюции V3 петли на популяционном уровне у вариантов вируса при длительной персистенции в организме хозяина
-
Установлено, что уровень внутрипациентной вариабельности и направление эволюции соответствует данным, полученным при анализе популяции в целом.
-
Продемонстрировано, что изменчивость гена ОТ нарастает по мере увеличения времени персистенции вируса в организме инфицированного.
-
Установлено, что полимераза исследуемых вариантов вируса, принадлежит субтипу G ВИЧ-1.
5. Установлено, что мутации устойчивости к АЗТ, а также другим НИ
и ННИ у G субтипа не отличаются от таковых для В субтипа.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Популяционный и внутрипациентный анализ последовательностей В эпитопа V3 gpl20 ВИЧ-1 позволил установить, что основное направление эволюционных изменений выражается в реципрокных заменах L14F и F20L.
4 Эти замены обеспечивают дальнейшее изменение в «верхушке» V3 петли с GPGHaAPG.
-
Уровень изменчивости области V3 у пациентов Ростово-Элистинской вспышки возрастает по мере прогрессии заболевания и длительности персистенции вируса в организме ВИЧ-инфицированного.
-
Проведен молекулярно-генетический анализ фрагмента 87-817 н.о. гена ОТ ВИЧ-1 7 образцов 1991-1994 гг., 17 - 2000-2001 гг. и 13 - 2003-2004 гг. от пациентов Ростово-Элистинской вспышки 1989 года.
-
Различия по аминокислотному составу между субтипами в гене ОТ варьируют, в среднем, от 3% до 10%, в зависимости от функционального домена. Различия по нуклеотидному составу составляют 8% - 11 %.
-
Мутации, возникающие при терапии АЗТ у вариантов субтипа G, не отличаются от соответствующих, описанных для субтипа В. Мутации, поддерживающие устойчивость к другим НИ и ННИ у субтипа G такие же как у субтипа В.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на «10й Международной конференции СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 26-31 мая 2002 г.); на 13-ом Международном симпозиуме по ВИЧ и появляющимся инфекционным заболеваниям, (Тулон, Франция 3.06.04-5.06.04).
Объем и структура диссертации.
