Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика эпидемии ВИЧ/СПИД в мире 10
1.2. Структура генома ВИЧ-1 и вирусные белки 12
1.3. Генетическое разнообразие ВИЧ-1 21
1.3.1. Мутационная изменчивость генома ВИЧ-1 21
1.3.2. Рекомбинационная изменчивость генома ВИЧ-1 27
1.4. Филогенетическая классификация штаммов ВИЧ-1 29
1.4.1. История развития филогенетической классификации ВИЧ-1 29
1.4.2. Современная филогенетическая классификация ВИЧ -1 32
1.5. Методы определения генетического разнообразия и субтипов ВИЧ-1 39
1.5.1. Секвенирование амплифицированных фрагментов генома ВИЧ-1, полученных методом полимеразной цепной реакции 39
1.5.2. Секвенирование полноразмерных геномов ВИЧ-1 44
1.6. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 46
1.6.1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в мире 46
1.6.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в странах бывшего СССР 49
1.7. Фенотипические свойства штаммов ВИЧ-1 52
2. Материалы и методы 56
2.1. Образцы крови 56
2.2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови 57
2.3. Методы очистки ДНК 57
2.3.1. Выделение ДНК из мононуклеарных клеток периферической крови 57
2.3.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 58
2.3.3. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы 58
2.4. Стратегия аплифицирования фрагментов генома ВИЧ-1 из ДНК ВИЧ- инфицированных пациентов 59
2.5. Реакции ферментативной модификации ДНК 63
2.5.1. Полимеразная цепная реакция 63
2.5.2. Реакция лигирования фрагментов ДНК 65
2.5.3. Реакция рестрикции плазмидной ДНК 66
2.5.4. Реакция ферментативного секвенирования ДНК 66
2.6. Методы электрофореза ДНК 69
2.6.1. Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле 69
2.6.2. Препаративный электрофорез ДНК в легкоплавкой агарозе 69
2.6.3. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле 69
2.7. Микробиологические методы 70
2.7.1. Приготовление компетентных клеток Е. coli для трансформации 70
2.7.2. Трансформация клеток Е. coli 71
2.8. Компьютерные методы анализа данных 71
2.8.1. Первичный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей... 71
2.8.2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1 72
2.8.3. Анализ функциональных элементов в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях ВИЧ-1 77
2.8.4. Статистический анализ полученных результатов 79
3. Результаты 80
3.1. Изучение генетического разнообразия ВИЧ-1 80
3.1.1. Результаты амплифицирования участков генов env и gag ВИЧ-1 80
3.1.2. Результаты секвенирования участков генов env и gag ВИЧ-1 83
3.1.3. Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участков генов env и gag ВИЧ-1 88
3.1.4. Результаты анализа аминокислотных последовательностей, кодируемых участками генов env и gag ВИЧ-1 92
3.1.5. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последова тельностей участков генов env и gag ВИЧ-1 97
3.2. Клонирование и секвенирование полноразмерного генома штаммов ВИЧ-1 102
3.2.1. Результаты амплифицирования, клонирования и секвенирования фрагментов ДНК, содержащих в совокупности полный геном ВИЧ-1 102
3.2.2. Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей молекулярных клонов фрагментов генома ВИЧ-1 106
3.2.3. Реконструкция полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома штаммов ВИЧ-1 109
3.3. Анализ полноразмерного генома ВИЧ-1 111
3.3.1. Результаты анализа функциональных элементов генома ВИЧ-1 111
3.3.2. Результаты филогенетического анализа полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома ВИЧ-1 119
4. Обсуждение результатов 127
4.1. Генетическое разнообразие ВИЧ-1 в странах бывшего СССР 127
4.2. Клонирование и секвенирование полноразмерного генома вариантов
ВИЧ-1, доминирующих в странах бывшего СССР 135
4.3. Филогенетический анализ доминирующих в странах бывшего СССР вариантов ВИЧ-1 140
4.4. Характерные особенности вариантов ВИЧ-1, доминирующих в странах бывшего СССР 148
Выводы 155
Список литературы 156
- Современная филогенетическая классификация ВИЧ
- Стратегия аплифицирования фрагментов генома ВИЧ-1 из ДНК ВИЧ- инфицированных пациентов
- Результаты секвенирования участков генов env и gag ВИЧ-1
- Результаты амплифицирования, клонирования и секвенирования фрагментов ДНК, содержащих в совокупности полный геном ВИЧ-1
Введение к работе
Высокий уровень генетического разнообразия вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) является одним из основных препятствий в борьбе с эпидемией ВИЧ/СПИД. Данное свойство ВИЧ-1, типичное для всех ретровирусов, является результатом эволюции вирусного генома, обусловленной высокими частотами мутаций и рекомбинаций, высокой скоростью размножения и большим размером вирусной популяции в инфицированном организме [163,169,312]. Благодаря накоплению большого числа спонтанных мутаций в геноме ВИЧ-1, в организме зараженного человека присутствуют штаммы, потенциально устойчивые к действию иммунной системы и лекарственных препаратов [192,273]. При передаче вируса от одного человека к другому за счет индивидуальных особенностей защитных реакций организма происходит отбор новых вирусных вариантов, увеличивающий генетическое разнообразие ВИЧ-1 в человеческой популяции [219].
Основным методом изучения генетического разнообразия ВИЧ-1 является определение нуклеотидной последовательности вирусного генома или его отдельных участков. На основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей штаммов ВИЧ-1 из различных географических регионов было установлено, что они образуют три группы: М, N и О, которые соответствуют трем независимым случаям переноса вируса иммунодефицита обезьян от шимпанзе к человеку [129]. Вирусы группы М, в которую входит подавляющее большинство обнаруженных штаммов ВИЧ-1, в свою очередь могут быть разделены на подгруппы, названные "субтипами", которых на сегодняшний день обнаружено 9 [315]. Субтипы группы М ВИЧ-1 соответствуют равноудаленным друг от друга кластерам филогенетического дерева. Генетическое расстояние между нуклеотидными последовательностями наиболее вариабельного вирусного гена env разных субтипов ВИЧ-1 составляет от 15 до 25%. Геном некоторых штаммов ВИЧ-1 является результатом рекомбинации геномов разных субтипов. Такие "межсубтипические рекомбинанты" возникают при репликации генома ВИЧ-1 в организме человека, одновременно зараженного вирусами разных субтипов. Рекомбинанты, которые получили широкое распространение, называют "циркулирующими рекомбинантными формами" (ЦРФ) ВИЧ-1, которых в настоящее время идентифицировано 16 [161]. Существование отличающихся вариантов ВИЧ-1 (субтипов и ЦРФ) позволяет отслеживать их происхождение и последующее распространение в различных географических регионах и группах риска. Кроме того, создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД считается целесообразным проводить на основе генов и белков субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, распространенных в регионе, для которого эти вакцины предназначены [36].
В России и других странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются самые высокие в мире темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции, поскольку в этом регионе крупномасштабная эпидемия началась только в середине 90-х годов. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции происходит за счет инъекционного употребления наркотиков. В августе 2004 года общее число случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в России с момента начала эпидемии, составило 291512 - по сравнению с 10993 на конец 1998 года [21]. В такой ситуации для эффективной борьбы против эпидемии необходима разработка вакцины против ВИЧ/СПИД. Первым шагом в этом направлении должна быть молекулярно-генетическая характеристика циркулирующих в регионе вирусных штаммов, подразумевающая изучение их генетического разнообразия и определение доминирующих вариантов ВИЧ-1. Вторым этапом является клонирование и секвенирование полноразмерных геномов доминирующих в регионе вариантов ВИЧ-1.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования была молекулярно-генетическая характеристика штаммов ВИЧ-1, вызвавших эпидемию в странах бывшего СССР, и анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов доминирующих вариантов ВИЧ-1 для разработки отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.
Задачи исследования:
1. Определить нуклеотидные последовательности участков генов env и gag штаммов ВИЧ-1 и провести их филогенетический анализ.
2. Проклонировать полноразмерные геномы вирусных штаммов, представляющих доминирующие в регионе варианты ВИЧ-1.
3. Определить полные нуклеотидные последовательности проклонированных геномов ВИЧ-1 и провести их филогенетический анализ.
4. Проанализировать аминокислотные последовательности белков полученных штаммов ВИЧ-1 с целью предсказания их биологических и иммунологических свойств.
Научная новизна работы
Впервые секвенированием участков генов env и gag ВИЧ-1 установлено, что в различных регионах Украины среди ВИЧ- инфицированных потребителей инъекционных наркотиков доминируют штаммы ВИЧ-1 различных субтипов: штаммы субтипа В в Николаеве и штаммы субтипа А на остальной территории Украины. Обнаружен первый случай инфицирования штаммом ВИЧ-1, относящимся к циркулирующей , рекомбинантной форме CRF03-AB, в Республике Беларусь. Впервые проклонированы и просеквенированы полноразмерные геномы штамма ВИЧ-1, относящегося к циркулирующей рекомбинантной форме CRF03-AB, изолированного в Республике Беларусь, и штамма ВИЧ-1 субтипа А, изолированного на Украине. Впервые показано особое положение штаммов субтипа А из стран бывшего СССР на филогенетическом дереве ВИЧ-1, позволяющее выделить их в новый подсубтип внутри субтипа А.
Научно-практическая значимость работы
В рамках данной работы получены клонированные полноразмерные геномы двух вирусных изолятов, представляющих доминирующие в странах бывшего СССР варианты ВИЧ-1. Определены и проанализированы их нуклеотидные последовательности. Полученные результаты представляют большой интерес для молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в странах бывшего СССР и являются важным достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.
Форма выполнения диссертационной работы
Работа выполнялась в рамках финансирования АНО "Биомедицинский центр" и ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов" по проектам Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего" и Федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники", а $ также по грантам Международного центра Фогарти (FIC, AITRP, 5-D43 TWO1028-04) и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, BRHE, ST-012-0).
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 7-й-П-й Международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, Россия, 1999-2003; 3-ей Европейской конференции по экспериментальным исследованиям СПИДа, Мюнхен, Германия, 1998; 12-й и 14-й Всемирных конференциях по СПИДу, Женева, Швейцария, 1998 и
Барселона, Испания, 2002; конференциях "Вакцина против СПИДа", Филадельфия, США, 2001 и Нью-Йорк, США, 2003; 10-й конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Бостон, США, 2003; 2-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного Общества по СПИДу, Париж, Франция, 2003. По теме диссертации опубликовано 10 статей и 14 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 207 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, 31 таблицей и 4 приложениями. Список литературы содержит 411 литературных ,, источников.
Современная филогенетическая классификация ВИЧ
Существующая сегодня филогенетическая классификация штаммов ВИЧ-1 в своих основных положениях не изменилась с 1999 года и выглядит следующим образом.
ВИЧ разделяется на типы, группы, субтипы, подсубтипы, циркулирующие рекомбинантные формы (CRF - circulating recombinant form) и уникальные рекомбинанты (см. рис.І.З.А). ВИЧ первого (ВИЧ-1) и второго (ВИЧ-2) типов относятся к разным "ветвям" (англ. lineage) лентивирусов приматов и являются результатами межвидового переноса различных вирусов иммунодефицита обезьян (SIV - simian immunodeficiency virus) [45]. ВИЧ-2 произошел от "ветви" SIVsm, природным резервуаром которой являются дымчатые мангобеи {Cercocebus atys (лат.) или sooty mangabeys (англ.)), обитающие в Западной Африке [146]. ВИЧ-1 произошел от "ветви" SIVcpz, обнаруживаемой исключительно среди подвида шимпанзе Pan troglodytes troglodytes, обитающего в центральной Африке [129]. При этом перенос SIVcpz от шимпанзе к человеку происходил по крайней мере трижды, чем и объясняется существование трех открытых на сегодня групп ВИЧ-1: М, N и О (см. рис.І.З.Б) [129]. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции в мире (39 миллионов на конец 2004 года [185]) вызвано вирусами, относящимися к группе М. Всего несколько десятков тысяч случаев, в основном в Камеруне и соседних центральноафриканских странах, вызваны вирусами группы О [38,317]. Случаев заражения вирусами группы N выявлено только шесть, и все они также зарегистрированы только в Камеруне
Филогенетическая классификация ВИЧ-1. Б. Филогенетическое дерево, полученное на основании полноразмерных геномов ВИЧ-1 и SIVcpz [300]
Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции в мире (39 миллионов на конец 2004 года [185]) вызвано вирусами, относящимися к группе М. Всего несколько десятков тысяч случаев, в основном в Камеруне и соседних центральноафриканских странах, вызваны вирусами группы О [38,317]. Случаев заражения вирусами группы N выявлено только шесть, и все они также зарегистрированы только в Камеруне
Внутри группы М на сегодняшний день выделено 9 субтипов: A-D, F-Н, J и К, которые образуют примерно равноудаленные кластеры при филогенетическом анализе (см. рис.1.3.Б) [314,315]. Для описанных ранее субтипов Е и I анализ полноразмерных геномов показал их рекомбинантное происхождение [70,127,128,275], поэтому они были переименованы в "циркулирующие рекомбинантные формы" (ЦРФ) CRF01-AE и CRF04-cpx (см. рис. 1.4), соответственно. Под ЦРФ понимают такие рекомбинанты, которые ответственны за возникновение нескольких (более двух) не имеющих прямых эпидемиологических связей случаев ВИЧ-инфекции. При этом разные штаммы ВИЧ-1, принадлежащие к одной ЦРФ, должны иметь одинаковую рекомбинантную структуру и образовывать общий кластер при филогенетическом анализе полноразмерных геномных нуклеотидных последовательностей. ЦРФ обозначаются номером, соответствующим хронологическому порядку их открытия, и буквами, соответствующими родительскими субтипам ВИЧ-1. Если в геноме ЦРФ присутствуют фрагменты более двух субтипов, то в обозначении вместо букв субтипов используют сокращение "срх" (от англ. "complex"). В настоящее время обнаружено, по крайней мере, 16 ЦРФ, в образовании которых участвуют все Кроме ЦРФ существуют много примеров уникальных межсубтипических рекомбинантов [299]. Как правило, они обнаруживаются в тех географических регионах, где одновременно циркулирует несколько субтипов ВИЧ-1. Обнаружены даже два случая рекомбинации между группами М и О ВИЧ-1 [298,361]. Более того, было показано, что представители группы N ВИЧ-1 могли произойти в результате рекомбинации штамма SIVcpz и какого-то представителя группы М ВИЧ-1 [129]. Несмотря на то, что случаи двойной инфекции ВИЧ-1 и ВИЧ-2 встречаются довольно часто в эндемичных для ВИЧ-2 регионах в западной Африке [332], рекомбинаций между геномами ВИЧ-1 и ВИЧ-2 пока обнаружено не было [135,300].
Довольно часто геномы ЦРФ содержат области, для которых родительский субтип не определен, то есть при филогенетическом анализе по данному фрагменту генома ЦРФ не кластрируется ни с одним из известных субтипов. Такие области по существующей номенклатуре субтипов ВИЧ-1 принято обозначать буквой U (от англ. "unclassified"), как и штаммы, отличающиеся от представителей известных субтипов и не являющиеся их рекомбинантами, но пока не удовлетворяющие критериям для введения нового субтипа, которые требуют обнаружения как минимум трех вирусных изолятов. Например, к неклассифицированным относятся два штамма, обнаруженные в Демократической Республике Конго и претендующие на звание нового субтипа L [264].
Частным случаем неклассифицированных фрагментов ЦРФ ВИЧ-1 являются области генома CRF01-AE, для которых не обнаружен родительский нерекомбинантный штамм ВИЧ-1 субтипа Е. Строго говоря, эта ЦРФ должна называться CRF01-AU, но обозначение Е было сохранено в целях соответствия существующей литературе. В случае же "субтипа I", было решено впредь букву I не использовать, а неклассифицированные области генома CRF04-cpx обозначать буквой U [314]. Внутри некоторых субтипов группы М ВИЧ-1 обнаружены подгруппы, называемые "подсубтипами" (англ. "sub-subtypes") [314,315]. Впервые под субтипы были выявлены для субтипа F [370]. Было обнаружено, что при филогенетическом анализе нуклеотидные последовательности генов gag и env штаммов ВИЧ-1 из центральной Африки кластрировались вместе с ранее проанализированными штаммами субтипа F из Бразилии и Румынии, однако при этом образовывали два отдельных подкластера. Поскольку генетические различия между штаммами, принадлежащими к разным подкластерам, были несколько меньше различий между представителями разных субтипов, эти подкластеры субтипа F было предложено называть подсубтипами Fl, F2 и F3. При анализе полноразмерных геномов этих штаммов было показано, что штаммы, отнесенные к подсубтипу F3, на самом деле образуют новый субтип, названный К, a F1 и F2 представляют собой подсубтипы субтипа F (см. рис. 1.3) [371]. Согласно принятой филогенетической классификации ВИЧ-1, группа штаммов, претендующая на звание подсубтипа, должна образовывать отдельный кластер, имеющий общий "узел" с ранее обнаруженным подсубтипом этого субтипа, при филогенетическом анализе любого фрагмента генома [314]. На сегодняшний день общепризнанными являются три пары подсубтипов: уже упоминавшиеся F1 и F2, А1 и А2 [130], а также субтипы В и D, которые на самом деле являются подсубтипами субтипа, обозначенного на рис. 1.3 B/D, и должны были бы называться В1 и В2. Чтобы не вносить путаницу в существующую литературу, обозначения В и D были оставлены [314].
Стратегия аплифицирования фрагментов генома ВИЧ-1 из ДНК ВИЧ- инфицированных пациентов
Выделение из легкоплавкой агарозы использовали для очистки амплифицированных фрагментов ДНК после ПЦР от невключившихся дНТФ, олигонуклеотидов и продуктов неспецифической амплификации. Очистку проводили перед реакциями дотирования (см. п.2.5.2) и секвенирования (см. п.2.5.4) амплифицированных фрагментов ДНК. Электрофорез в легкоплавкой агарозе проводили как описано в п.2.6.2. Участок легкоплавкой агарозы, содержащий полосу ДНК необходимого размера, вырезали и заливали пятью объемами раствора 20 мМ трис-НС1 рН 8.0, 1 мМ ЭДТА. Смесь плавили при 65С, затем ДНК экстрагировали последовательно равным объемом фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформа с последующим осаждением этанолом. Очищенные фрагменты ДНК хранили в воде при -20С.
Амплифицирование фрагментов генома ВИЧ-1 проводили методом двухраундовой полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в п.2.5.1, сначала с "внешними", а потом с "внутренними" праймерами в различных вариантах, показанных на рис.2.1. Этот метод позволяет повысить продуктивность и специфичность реакции Праймеры для амплифицирования фрагментов генома ВИЧ-1 (см. табл.2.2) выбирали так, чтобы они располагались в наиболее консервативных участках генома, что оценивалось на основании анализа базы данных полных нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов ВИЧ-1 [206]. Выбранные таким образом праймеры позволяли амплифицировать фрагменты генома штаммов ВИЧ-1 различных субтипов. В табл.2.2 праймеры сгруппированы в соответствии с амплифицируемыми фрагментами генома ВИЧ-1, описанными в табл.2.3 и изображенными на рис.2.2.
MgCl2, 50 мМ KCl, 200 мкМ каждого из дНТФ, 200 нМ каждого из праймеров и 2.5 единицы Тод-полимеразы (Pharmacia Biotech, Швеция). В качестве матрицы в первом раунде ПНР использовался 1 мкг ДНК из МКПК, во втором раунде ПЦР - 3 мкл амплификата после первого раунда. Реакционную смесь прогревали 3 мин при 95 С для денатурации матричной ДНК. Реакцию амплификации проводили в термоциклере РТС-200 (MJ Research, США) в течение 35 следующих циклов: 1 мин при 94С, 1 мин при 55- -58С (в зависимости от температуры денатурации праймеров), 1- 3 мин при 72С (в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента). По окончании проводился дополнительный цикл для достройки образовавшихся цепей ДНК: 10 мин при 72С. Полученные амплификаты хранились при -20С.
В качестве положительного контроля при ПЦР использовали 10 пкг ( 106 копий) ДНК плазмиды pNL4-3 [28], содержащей полный геном ВИЧ-1, с 1 мкг ДНК МКПК ВИЧ-отрицательного донора. В качестве отрицательного контроля использовали 1 мкг ДНК МКПК ВИЧ-отрицательного донора.
Для контроля качества выделенной из МКПК ДНК амплифицировали фрагмент клеточного гена, кодирующего тяжелую цепь иммуноглобулина IgGl. Реакцию проводили в один раунд с праймерами IgGl-d и IgGl-r (см. табл.2.4) так же, как и в случае амплифицирования фрагментов генома ВИЧ-1. Ожидаемая длина амплифицированного фрагмента составляла 914 п.н. Во всех случаях препараты ДНК были реакционноспособны с контрольными праймерами. Реакция лигирования использовалась при клонировании амплифицированных фрагментов ДНК. Очищенные в результате выделения из легкоплавкой агарозы (см. п.2.3.3) амплифицированные фрагменты ДНК клонировали с помощью набора "pGEM Easy Vector System" (Promega, США). В данный набор входит плазмида pGEM Easy (см. рис.2.3), рестрицированная эндонуклеазой EcoRV, с достроенными 3 -выступающими дТМФ. Это обеспечивает эффективное лигирование вектора с амлифицированным фрагментом, обладающим 3 -выступающими дАМФ, достраиваемыми Гад-полимеразой во время ПНР.
Реакцию лигирования между плазмидным вектором и амплифицированным фрагментом проводили в объеме 10 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл двукратного лигазного буфера, 50 нг плазмидного вектора, 100 нг клонируемого фрагмента и 3 единицы ДНК-лигазы бактериофага Т4. Реакционную смесь инкубировали при 4С в течение ночи, затем подвергали диализу против деионизованной воды с помощью фильтра с размерами пор 0.025 мкм, после чего хранили при -20С. Рестрикция плазмидной ДНК использовалась при анализе рекомбинантных клонов, полученных при клонировании амплифицированных фрагментов (см. пп.2.5.2 и 2.7.2), на наличие требуемой вставки. Плазмидную ДНК, выделенную как описано в п.2.3.2, подвергали расщеплению эндонуклеазами рестрикции Pstl и coRI (MBI Fermentas, Литва), сайты узнавания для которых расположены около места клонирования амплифицированного фрагмента ДНК (см. рис.2.3). При обработке ферментом Pstl происходила линеаризация плазмиды, а при обработке EcoRl - "вырезание" вставки. Реакцию проводили в течение 1 часа при 37С в объеме 10 мкл в буфере R+ (MBI Fermentas, Литва): 10 мМ трис-НС1 рН 8.5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ КС1, 0.1 мг/мл БСА с 5 единицами рестриктазы и 500 нг плазмидной ДНК.
Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили ферментативным методом по Сэнгеру [331] с помощью наборов "ALFexpress AutoCycle Sequencing Kit", "ALFexpress AutoRead Sequencing Kit" и "ALFexpress dATP Labeling Mix" (Pharmacia Biotech, Швеция) no прилагающимся к ним инструкциям.
Набор "ALFexpress AutoCycle Sequencing Kit" позволял осуществлять циклическое секвенирование, используя всего 100 фмоль плазмидной ДНК или очищенного (см. п.2.3.3) амплифицированного фрагмента. Для мечения продуктов реакции секвенирования использовали меченные по 5 -концу флуоресцентным цианиновым красителем Су5 универсальные праймеры, представленные в табл.2.5. Для секвенирования амплифицированных фрагментов, клонированных с помощью плазмиды pGEM Easy, использовали праймеры Т7 и М13 Reverse, расположенные в полилинкере плазмиды по разные стороны от сайта EcoRY, а для прямого секвенирования амплифицированных фрагментов "gag" и "env" (см. п.2.4.) - праймеры М13 Universal и М13 Reverse.
Результаты секвенирования участков генов env и gag ВИЧ-1
Полученные амплифицированные фрагменты генов env и gag ВИЧ-1 очищали от олигонуклеотидов и продуктов ПЦР, возникающих при неспецифическом отжиге праймеров, с помощью препаративного электрофореза в легкоплавкой агарозе. Амплифицированные фрагменты содержали на своих концах искусственно внедренные олигонуклеотиды длиной 17-18 п.н., позволяющие секвенировать их методом Сэнгера с помощью универсальных праймеров М13 Universal и М13 Reverse (см. табл.2.5). Полученные в результате секвенирования с противоположных праймеров нуклеотидные последовательности выравнивали и комбинировали, проверяли на наличие нуклеотидных неопределенностей. Для всех амплифицированных фрагментов были получены однозначные нуклеотидные последовательности. Для дальнейшего анализа из них были удалены последовательности праймеров, использованных для амплифицирования. Полученные нуклеотидные последовательности, представленные на рис.3.3 и 3.4, были депонированы в базу данных "GenBank" под номерами AF098952, AF098953, AF100934-9, AY077629, AY766061-9.
Полученные нуклеотидные последовательности участков генов env и gag на рис.3.3 и 3.4 объединены в две группы, условно обозначенные "Nik" и "Kiev". Для каждой из групп характерен высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей. Названия групп соответствуют городам происхождения большинства штаммов ВИЧ-1 из каждой группы.
Нуклеотидные последовательности участка гена env ВИЧ-1, амплифицированного из ДНК ВИЧ-инфицированных пациентов
Обозначения: Cons-Nik - консенсусная нуклеотидная последовательность для 5 штаммов ВИЧ-1 из Николаева и одного из Могилева; Cons-Kiev - консенсусная нуклеотидная последовательность для 6 штаммов ВИЧ-1 из Киева и двух из Одессы; черным цветом вьщелены нуклеотидные замены по сравнению с соответствующей консенсусной последовательностью; для консенсусной последовательности Cons-Kiev черным цветом вьщелены нуклеотидные замены по сравнению с последовательностью Cons-Nik; штрихом обозначены делеции нуклеотидов; вопросительным знаком обозначены позиции в консенсусной последовательности, в которых определенный нуклеотид не встречается более, чем в 50% последовательностей; знаками " " и " " обозначены начало и конец соответствующих областей гена env; нумерация нуклеотидов приведена согласно консенсусной последовательности Cons-Nik..3.4 (продолжение) На основании сходства между нуклеотидными последовательностями участка гена env, как это видно из рис.3.3, штаммы 97UA0077, 97UA0081, 97UA0083, 97UA0085, 97UA0086 (Николаев) и 00BY10443 (Могилев) были объединены в группу "Nik", a 97UA0096, 97UA0097 (Одесса), 98UA0123, 98UA0127, 98UA0130, 98UA0132, 98UA0133 и 00UA0116 (Киев) - в группу "Kiev". Для каждой группы были построены консенсусные нуклеотидные последовательности; их длины составили 605 и 614 п.н. для групп "Nik" и "Kiev", соответственно. Было определено число позиций, в которых обнаруживаются замены нуклеотидов по сравнению с консенсусной последовательностью для каждой группы (см. табл.3.2). Учитывали общее число вариабельных позиций int), число неопределенных позиций (п?), обозначенных вопросительным знаком на рис.3.3, и число позиций, в которых замены встречаются только в одной из нуклеотидных последовательностей (л„). Кроме того, изучали распределение числа вариабельных позиций в различных областях гена env. Наибольшая частота встречаемости вариабельных позиций для обеих групп последовательностей была обнаружена в У4-области - 15% и 14% для групп "Nik" и "Kiev", соответственно.
Анализ нуклеотидных замен проводили отдельно для каждой группы последовательностей. Учитывали 36 однозначных вариабельных позиций (л, - п?) для группы "Nik" и 50 позиций для группы "Kiev". Было обнаружено 46 замен по сравнению с консенсусної! последовательностью в группе "Nik" и 61 замена в группе "Kiev". Чаще всего среди этих замен встречались транзиции двух типов A G и G A (см. табл.3.3), причем в группе "Nik" соотношение первого и второго типов было 21:6, а в группе "Kiev" - 14:13.
Вставки и делеции нуклеотидов были обнаружены только для двух штаммов ВИЧ-1 из группы "Nik": 97UA0077 и 97UA0086, причем эти мутации в обеих нуклеотидных последовательностях были идентичны и представляли собой вставку 18 нуклеотидов между 382-й и 383-й позициями консенсусной последовательности и делецию 15 нуклеотидов с 408-го по 422-й (см. рис.3.3).
Аналогичный анализ нуклеотидных замен был проведен и для нуклеотидных последовательностей участка гена gag. Как это видно из рис.3.4, благодаря сходству между нуклеотидными последовательностями, как и в случае участка гена env, штаммы ВИЧ-1 были разделены на две группы: "Nik" и "Kiev". В первую группу вошли 97UA0077, 97UA0078, 97UA0082, 97UA0083, 97UA0085 и 97UA0086 из Николаева; во вторую -97UA0084 из Николаева, 98UA0127, 98UA0133, 00UA0116 из Киева и 00BY10443 из Могилева. Из восьми штаммов ВИЧ-1, для которых были получены нуклеотидные последовательности участков обоих генов env и gag, только один (00BY10443) попал в разные группы на основании анализа разных генов, что позволяет предположить наличие точки рекомбинации в его геноме, не прибегая к филогенетическому анализу.
Для каждой группы были построены консенсусные нуклеотидные последовательности, длина которых составила 391 п.н. Общее число вариабельных позиций (nt) для обеих консенсусных последовательностей равно 22, а число позиций, в которых замены встречаются только в одной из нуклеотидных последовательностей (пи), - 21 и 18 для групп "Nik" и "Kiev", соответственно. В отличие от гена env неопределенных позиций в консенсусных последовательностях участка гена gag не было.
При анализе нуклеотидных замен было обнаружено 23 замены по сравнению с консенсусной последовательностью в группе "Nik" и 27 замен в группе "Kiev". Чаще всего среди этих замен, как и в случае гена env, встречались транзиции двух типов A G и G" A (см. табл.3.5), причем в группе "Nik" соотношение первого и второго типов было 10:5, а в группе "Kiev"-8:8. Как и в случае нуклеотидных последовательностей анализ замен аминокислот проводили отдельно для каждой группы штаммов ВИЧ-1 "Nik" и "Kiev". Консенсусные аминокислотные последовательности участка белка gpl20 имели длину 201 и 204 а/к для групп "Nik" и "Kiev", соответственно. Для группы "Nik" было обнаружено 30 вариабельных позиций, 4 из которых оказались неопределенными (они обозначены вопросительным знаком на рис.3.5). Для группы "Kiev" было обнаружено 32 вариабельные позиции, 2 из которых - неопределенные. Для однозначных вариабельных позиций (26 для группы "Nik" и 30 группы "Kiev") был проведен анализ мутаций в индивидуальных аминокислотных последовательностях по сравнению с консенсусными последовательностями (см. табл.3.7). Обнаруженные замены аминокислот были разделены на три группы: "синонимичные", "неопределенные" и "несинонимичные" замены, как описано в п.2.8.1.
Результаты амплифицирования, клонирования и секвенирования фрагментов ДНК, содержащих в совокупности полный геном ВИЧ-1
На основании результатов анализа нуклеотидных последовательностей участков генов env и gag 17 штаммов ВИЧ-1 два штамма - 00UA0116 из Л Киева и 00BY10443 из Могилева - были выбраны для дальнейшего анализа полноразмерных нуклеотидных последовательностей их генома. С этой целью проводили амплифицирование перекрывающихся фрагментов ДІЖ (см. табл.2.3), содержащих в совокупности полный геном ВИЧ-1, в соответствии со схемой, представленной на рис.2.2. В результате второго раунда ПЦР с соответствующими внутренними праймерами (см. табл.2.2) было получено по 9 амплифицированных фрагментов генома для двух штаммов ВИЧ-1. На рис.3.9 в качестве примера представлены результаты электрофореза 9 амплифицированных фрагментов генома штамма 00UA0116. Как видно из рисунка, длины всех полученных фрагментов ДНК соответствуют ожидаемым длинам амплифицированных фрагментов генома ВИЧ-1, описанных в табл.2.3. Все амплифицированные фрагменты очищали путем препаративного электрофореза в легкоплавкой агарозе и клонировали с помощью бактериального плазмидного вектора pGEM Easy (Promega, США). Плазмидную ДНК из рекомбинантных бактериальных клонов анализировали , на наличие клонируемого фрагмента с помощью электрофореза в 0.8% агарозном геле: электрофоретическую подвижность рекомбинантных плазмид сравнивали с подвижностью исходного плазмидного вектора pGEM-5Zf(+). Наличие вставки ожидаемого размера в анализируемых плазмидах подтверждалось расщеплением плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции Pstl и EcoRl, сайты узнавания для которых расположены около места клонирования амплифицированного фрагмента ДНК.
Пример анализа рекомбинантных плазмид, содержащих амплифицированные фрагменты генома штамма ВИЧ-1 00UA0116, представлен на рис.3.10. Как видно из рисунка, суперскрученная форма плазмид, содержащих фрагмент VI генома штамма 00UA0116 (дорожки 2-4) имеет меньшую электрофоретическую подвижность, чем суперскрученная форма исходного плазмидного вектора pGEM-5Zf(+) (дорожка 5). В результате расщепления плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции PstI образуются фрагменты размером 5 т.п.н., соответствующие линейной 1/; форме плазмид (дорожки 6-8), а при расщеплении ЕсоШ - фрагменты размером 3 т.п.н. и 1.8 т.п.н., представляющие собой линейную форму вектора pGEM Easy и "вырезанный" клонированный фрагмент, соответственно (дорожки 10-12).
В результате клонирования и последующего выбора подходящих нуклонов была создана коллекция рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты, перекрывающие весь геном обоих штаммов ВИЧ-1. Всего было отобрано 47 клонов (см. табл.3.11): 29 для штамма 00UA0116 и 18 для штамма 00BY10443. Для штамма 00UA0116 были отобраны клоны, содержащие амплифицированные фрагменты I-VI, Vila и Vllb; амплифицированный фрагмент VII не удалось проклонировать из-за (/ нестабильности содержащих его рекомбинантных плазмид. Тем не менее, фрагменты Vila и Vllb полностью перекрывают участок генома, соответствующий фрагменту VII. Для штамма 00BY10443 данный фрагмент был проклонирован, хотя удалось обнаружить только один клон, содержащий полноразмерную вставку. Для каждого амплифицированного фрагмента (за исключением VII) было отобрано от 2 до 4 рекомбинантных клонов для определения нуклеотидной последовательности.
Клонированные фрагменты генома ВИЧ-1 были просеквенированы с помощью как универсальных вектор-специфических, так и ВИЧ-специфических праймеров (см. табл.2.5 и 2.6). Выбранные праймеры позволяли полностью просеквенировать клонированные фрагменты за счет комбинирования нескольких (от 2 до 6) достоверно секвенируемых за одну реакцию участков со средней длиной около 500 п.н., при этом перекрывание участков составляло 100-300 п.н. В результате секвенирования были определены точные длины клонированных фрагментов, представленные в табл.3.11. Для дальнейшего анализа из нуклеотидных последовательностей, полученных при секвенировании клонированных фрагментов генома ВИЧ-1, удалялись последовательности праймеров, использованных для амплифицирования. Полученные нуклеотидные последовательности представлены в приложениях I и П. Они были депонированы в базу данных "GenBank" под номерами AF413958-AF413986, AF413988-AF414005. Отдельно для каждого штамма ВИЧ-1 и каждого амплифицированного фрагмента нуклеотидные последовательности были выровнены, и для них были построены консенсусные последовательности (см. приложения I, II).
Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей молекулярных клонов фрагментов генома ВИЧ-1 Для всех амплифицированных фрагментов геномов ВИЧ-1 были обнаружены различия между нуклеотидными последовательностями индивидуальных клонов (см. приложения I, II), отражающие либо "квазивидовое" разнообразие ВИЧ-1 в организме инфицированного пациента, либо ошибки, вносимые Tag-полимеразой во время ПЦР. В табл.3.12 приведены значения генетического расстояния между отдельными клонами одного и того же фрагмента генома, вычисленные как число нуклеотидных замен, приходящееся на 100 нуклеотидов; при этом позиции, в которых имели место делеции или вставки нуклеотидов, исключались из анализа. Значение генетического расстояния между клонами варьирует от 0.3 до 4.1% для штамма 00UA0116 и от 0.3 до 2.1% для штамма 00BY10443. Делеции или вставки нуклеотидов между отдельными клонами были обнаружены для фрагментов II, III, VI штамма 00UA0116 и фрагментов III, VI штамма 00BY10443 (см. табл.3.13). Делеция одного нуклеотида в клоне №1 фрагмента II штамма 00UA0116 (для краткости далее используется обозначение "клон UA-II-1") произошла в некодирующей области, тогда как делеция одного нуклеотида в клоне UA-III-2 имела место в кодирующей последовательности гена рої и поэтому приводила к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона. Делеция 186 нуклеотидов на 3 -конце этого же клона, вероятно, является результатом деградации амплифицированного фрагмента на какой-либо из стадий молекулярного клонирования. Вставка одного нуклеотида в клоне BY-III-2 также имеет место в кодирующей последовательности гена рої и поэтому приводит к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона. Вставка и делеции в клонах UA-VI-3 и BY-VI-1 не нарушают рамки считывания гена env, поскольку их длина кратна 3 нуклеотидам. Таким образом, из 8 обнаруженных мутаций типа делеции/вставки нуклеотидов между отдельными клонами одна является результатом процедуры клонирования, пять не приводят к нарушению рамки считывания вирусных белков и только две нарушают рамку считывания.
