Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Культурные виды картофеля (род Solatium L., секция РеШа Durmort., подсекция Potato G. Don.) - географическое распространение, гипотезы о происхождении, таксономические исследования 9
1.1.1. Дикорастущие и культурные виды картофеля - центры происхождения, особенности видообразования 9
1.1.2 Происхождение культурного картофеля 11
1.1.3 Системы культурных видов картофеля 15
Основные таксономические системы видов секции Petota 15
Основные таксономические системы культурных видов картофеля 18
1.2. Интродукция возделываемого картофеля 20
1.2.1. История интродукции картофеля в Европу и Северную Америку 20
1.2.2. Основные этапы селекции картофеля и генетическое разнообразие сортов 24
1.3. Анализ генетического разнообразия возделываемого картофеля и генотипирование сортов с использованием традиционных и современных подходов 29
1.3.1. Изучение морфологических признаков растений для идентификации сортов 29
1.3.2. Использование белковых маркеров для идентификации сортов и изучения их разнообразия 32
1.3.3. Использование различных ДНК маркеров для генотипирования сортов картофеля и изучения их генетического разнообразия 34
Использование nSSR маркеров для генотипирования сортов отечественной селекции 43
SSR генотипирование в программах по сохранению сортового генофонда в генбанках 44
1.4. Изучение идентичности микрорастений и их полевых аналогов при длительном сохранении в условиях in vitro и крио 46
1.4.1. Микроклональное размножение растений 46
1.4.2. Методы выявления сомаклональной изменчивости 53
1.4.3. Изучение идентичности растений при длительном хранении генетических ресурсов растений в контролируемых условиях среды -in vitro и крио коллекциях 54
2. Материалы и методы 57
2.1. Материал исследования 57
2.2. Методы исследования 59
2.2.1 Методы выделения ДНК 59
2.2.2. Измерение концентрации ДНК и проверка качества ДНК препаратов 61
2.2.3. Проведение ПЦР 61
Проведение SSR анализа 61
Проведение RAPD анализа 65
ПЦР с праймерами специфичными к последовательностям органельных ДНК 66
2.2.4. Электрофорез амплифицированных фрагментов 68
Электрофорез в агарозном геле 68
Электрофорез в ПААГе 68
2.2.5 Статистическая обработка результатов изучения полиморфизма nSSR локусов 68
2.2.6. Методы in vitro хранения 70
2.2.7. Методы криоконсервации и криохранения 71
Droplet метод 71
Метод Droplet vitrification 72
3. Результаты и обсуждение 75
3.1.. Оценка полиморфизма 14 ядерных микросателлитных локусов у выборки сортов селекции России и стран ближнего зарубежья, сохраняемых в коллекции ВИР 75
3.2. Изучение генетического разнообразия селекционных сортов 80
3.2.1. Выявление сортов с редкими и уникальными аллелями nSSR локусов 80
3.2.2. Изучение полиморфизма селекционных сортов в зависимости от периода селекции 82
3.2.3. Оценка уровня гетерозиготности с использованием монолокусных ядерных микросателлитных маркеров 89
3.3. Генотипирование выборки сортов российской, украинской, белорусской селекции из коллекции ВИР 101
3.4. Изучение генетических взаимосвязей сортов на основе SSR анализа с использованием методов многомерной статистики 105
3.4.1. Изучение генетических взаимосвязей сортов российской, украинской и белорусской селекции (выборка 118 сортов) 106
3.4.2. Изучение генетических взаимосвязей 77 сортов российской селекции 114
3.4.3. Изучение генетических взаимосвязей сортов отечественной и зарубежной селекции на основе результатов SSR анализа 118
3.5. Оценка идентичности ДНК спектров микрорастений сортов картофеля после длительного in vitro и криохранения в сравнении с исходными генотипами 122
3.5.1. Оценка идентичности микрорастений, длительно сохраняемых в условиях in vitro, их полевым аналогам на основе использования ДНК маркеров и оценки морфологических признаков 122
3.5.2. Модификация методов криоконсервации сортов картофеля 130
Изучение возможности сокращения продолжительности воздействия криопротекторов 131
Изучение возможности использования различных типов эксплантов для криоконсервации сортов картофеля 133
3.5.3. Молекулярный анализ регенерантов сортов картофеля после криоразмораживания 135
3.6. Выводы 137
3.7. Список литературы 138
4. Приложения 158
- Происхождение культурного картофеля
- Изучение идентичности растений при длительном хранении генетических ресурсов растений в контролируемых условиях среды -in vitro и крио коллекциях
- Оценка уровня гетерозиготности с использованием монолокусных ядерных микросателлитных маркеров
- Молекулярный анализ регенерантов сортов картофеля после криоразмораживания
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в мире насчитывается более 7300 селекционных сортов картофеля (Berloo et al, 2007). Разработка методов изучения генетического разнообразия и генотипирования сортов существенно расширяет возможности регистрации, систематизации и сохранения сортового генофонда в генбанках, и его рационального использования в селекции и семеноводстве.
Методы идентификации сортов картофеля традиционно базировались на оценке морфологических и агрономических признаков (Klapp, 1933; Stuart, 1937; Salaman, 1926, Зайцева Н.Д., 1935, 1965; Костина Л.И., 1971). Использование этих методов актуально и сегодня для полевых коллекций, однако имеет определенное ограничение для идентификации сортового генофонда, сохраняемого в контролируемых условиях in vitro и криоконсервации. Использование белков клубней и изоферментов для идентификации сортов картофеля ограничено, поскольку белки клубней характеризуются невысоким полиморфизмом (Оглуздин, 1980), а на состав изоферментных спектров может оказывать влияние физиологическое состояние растений (Яаска, Яаска, 1971). Данные ограничения снимаются при использовании ДНК маркеров. В последние десятилетия для изучения генетического разнообразия и генотипирования сортов картофеля широко применяются ДНК-маркеры, основанные на использовании полимеразной цепной реакции: RAPD, ISSR, AFLP, SSR (Hosaka et al., 1994; Бирюкова, 2006; Braun, Wenzel, 2004; Moisan-Thiery et al., 2005 и др.), из которых наиболее эффективными являются микросателлитные или SSR (Simple Sequence Repeats) маркеры.
Ядерные микросателлиты (nSSR маркеры) успешно и широко применяют в самых разных направлениях - для конструирования генетических карт (Ghislain еt al., 2004; 2009), изучения дифференциации культурных видов (Raker, Spooner, 2002; Spooner et al., 2007; Gavrilenko et al., 2010), оценки генетического разнообразия сортового генофонда и генотипирования сортов (Feingold et al., 2005; Moisan-Thiery et al., 2005), и реконструкции родословных селекционных сортов (Braun, Wenzel, 2004; Антонова и др., 2004). Между тем, для изучения генетического разнообразия и генотипирования сортов картофеля отечественной селекции SSR анализ использован ограниченно (Антонова и др., 2004; Рыжова и др., 2010).
В коллекции ВИР сохраняется около 2100 селекционных сортов картофеля, в основном - в полевых коллекциях. Образцы из полевых коллекций подвержены воздействию патогенов и вредителей, а также экстремальных абиотических факторов. Для надежного сохранения сортового генофонда необходимо создавать дублетные in vitro и криоколлекции, для эффективной систематизации которых необходимо использовать ДНК маркеры. Цель работы заключалась в изучении генетического разнообразия селекционных сортов картофеля из коллекции ВИР и их генотипировании с использованием ядерных SSR маркеров. Задачи работы:
-
Провести оценку полиморфизма 14 ядерных микросателлитных (nSSR) локусов у селекционных сортов картофеля из коллекции ВИР.
-
Изучить генетическое разнообразие выборки селекционных сортов картофеля.
-
Провести генотипирование выборки селекционных сортов из коллекции ВИР и изучить их генетические взаимосвязи.
-
Оценить идентичность ДНК спектров микрорастений сортов картофеля после длительного in vitro и криохранения в сравнении с соответствующими спектрами исходных генотипов.
Научная новизна
Впервые охарактеризовано генетическое разнообразие селекционных сортов картофеля из коллекции ВИР с использованием монолокусных nSSR маркеров из набора PGI (potato genetic identification) (Ghislain et al,. 2009). Получены новые данные о генетическом разнообразии сортов в зависимости от времени их создания. Выделены сорта с редкими и уникальными аллелями исследованных nSSR локусов. Проведена модификация метода Droplet vitrification, продемонстрирована возможность использования пазушных почек микрорастений в качестве эксплантов для криоконсервации сортов картофеля.
Практическая ценность работы
С применением 14 nSSR маркеров генотипированы 118 сортов российской, украинской и белорусской селекции из коллекции ВИР. Проведена оценка степени их гетерозиготности по изученным микросателлитным локусам.
На основании данных SSR анализа определен минимальный набор из трех пар праймеров, пригодных для однозначного различения 185 сортов отечественной и зарубежной селекции.
Произведена закладка 22 селекционных и местных тетраплоидных сортов картофеля на длительное криохранение. Показана идентичность ДНК спектров регенерантов после криохранения и микрорастений после длительного in vitro хранения соответствующим спектрам исходных генотипов (сортов) из полевой коллекции.
Апробация работы Основные результаты представлены на III (Москва, 2003) и V (Москва, 2009) съездах ВОГиС; 17th Triennial Conference of the European Association of Potato Research, - Brasov, Romania, 2008; Всероссийской конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России», СПб, 2008; Пятом московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М., 2009; Всеросс. конференции, посвящененной 100-летию со дня рождения академика К.З. Будина. СПб, 2009; Международной конференции «Роль Вавиловской коллекции генетических ресурсов растений в меняющемся мире», СПб, 2009; COST Action-871 CryoPlaNet, Final meeting, Angers-France (2011); 18th Triennial Conference of the European Association of Potato Research, Oulu, Finland, 2011; Molecular Ecology Conference, Vienna, Austria, 2012.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, из них - 9 статей, 4 из которых опубликованы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, а также 16 тезисов.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, приложение, список литературы. Работа изложена на 157 страницах и содержит 28 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 218 источников, в том числе 52 на русском и 166 на иностранных языках.
Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю за постоянное внимание к работе; всем коллегам, способствовавшим реализации данного исследования. Автор глубоко признателен за практическую и теоретическую помощь в проведении SSR анализа в.н.с. отдела биотехнологии ВИР О.Ю. Антоновой. Автор благодарен зав. отд. ИТО ВИР к.т.н. Л.Ю. Новиковой за помощь в проведении статистической обработки результатов. Автор выражает благодарность за помощь гл.н.с. отдела генетических ресурсов картофеля ВИР д.б.н. Л.И. Костиной.
Происхождение культурного картофеля
Как упоминалось выше, ведущие систематики полагают, что наряду с полиплоидизацией, межвидовая гибридизация также сыграла важную роль в формировании генетического разнообразия видов картофеля (Букасов, 1933, 1970, 1978; Юзепчук, 1937; Hawkes, 1990; Huaman, Spooner, 2001). Примером является гибридное происхождение многих культурных видов картофеля, которые в своей истории включали этапы и межвидовых скрещиваний и полиплоидизации (рис. 1 А-Б). Например, скрещивания дикого вида S. acaule (4х) с культурным диплоидом S. stenotomum (2х) привели к образованию триплоидного вида, S. juzepczukii, а в результате природных скрещиваний S. juzepzukii с S. tuberosum ssp. andigenum (4х) образовались пентаплоидные формы гибридогенного вида S. curtilobum (Hawkes, 1990) (рис. 1Б). Необходимо отметить, что в происхождении культурных видов принимали участие только дикорастущие виды картофеля с А - геномами (Matsubayashi, 1991).
Наиболее спорным является вопрос происхождения тетраплоидных форм культурного картофеля, давших начало европейскому возделываемому картофелю. Букасов (1971) относит тетраплоидные формы культурного картофеля к двум видам: S. chilotanum Hawkes. и S. andigenum Juz. et Buk., a Хокс (Hawkes, 1990) относит их к одному виду, рассматривая в ранге подвидов S. tuberosum ssp tuberosum и S. tuberosum ssp. andigena Hawkes. Следует отметить, что чилийские и андийские тетраплоидные формы культурного картофеля различаются по ряду признаков:
1) Различие ареалов. Ареал чилийского картофеля - Чили с прилегающими островами; растения произрастают от прибрежной зоны до зоны 600-800 метров над уровнем моря. Данная местность характеризуется условиями повышенной влажности (1000-3000 мм в год) и небольшим колебанием температур +7-+15С (Букасов, 1933, 1978; Hawkes, 1990). Ареал андийского тетраплоидного культурного картофеля очень обширный, простирается от северо-западной части Аргентины в Боливию, Перу, Эквадор, Колумбию и Венесуэллу и расположен в высокогорной зоне Анд Южной Америки, на высоте от 2500 до 4600 метров над уровнем моря Для данной местности характерно небольшое количество осадков (Букасов, 1933, 1978; Hawkes, 1990).
2) Отличия по физиологическим признакам. Чилийские формы культурного тетраплоидного картофеля образуют клубни в условиях длинного светового дня; а андийские формирует клубни в условиях короткого светового дня (Букасов, 1978). Следует отметить, что Сваминатан (Swaminatan, 1954) среди образцов S. andigenum, выращенных в течение зимних месяцев в Северной Индии, выявил мутанты, адаптированные к длинному дню.
3) Отличия морфологических признаков. Чилийские и андийские формы тетраплоидного культурного картофеля отличаются также и по некоторым морфологическим признакам. Так, растения чилийских форм имеют толстый стебель с короткими междоузлиями, слабо рассеченные листья с увеличенной конечной долей; листья расположены к стеблю под тупым углом. Тогда как растения андийских форм имеют длинный стебель, сильно рассеченные листья, у большинства форм листья отходят от стебля под острым углом (Лехнович, 1971; Букасов, 1933, 1978).
4) Различия на геномном уровне. По данным рестрикционного анализа хлоропластной ДНК у S. tuberosum ssp. andigena Hawk было выявлено 5 хлоропластных геномов (А, С, S, Т и W типы) (Hosaka, 1986; Hosaka, Hanneman, 1988; Hosaka 2003; Sukhotu et al, 2004). В то время как у S. tuberosum ssp. tuberosum встречается только три типа пластидной ДНК: А, Т и W (Hosaka, Hanneman, 1988). Причем, наиболее часто (до 90%) у чилийского подвида tuberosum встречается Т тип пластидного генома, который характеризуется делецией 241 п.о. (Kawagoe, Kikuta, 1991). У андийских форм (ssp. andigena) частота образцов с «Т» типом пластома не превышает 10%. Кроме того, дифференциация чилийских и андийских тетраплоидных форм культурного картофеля выявлена и на уровне ядерной ДНК. Так, Ракер и Спунер (Raker, Spooner, 2002), используя ядерные микросателлиты (SSR), смогли разделить чилийские и андийские образцы.
Существует две основные гипотезы происхождения чилийских и андийских тетраплоидпых форм культурного картофеля - отечественных ученых - Букасова и Юзепчука и гипотеза английского ученого Хокса (рис. 1 А, 1Б).
Согласно гипотезе Букасова (1933), происхождение вида iS . andigenum (Juz. et Buk.) Hawkes - полифилетическое. Возможно, что некоторые формы вида S. andigenum произошли путем гибридизации с участием диплоидных (или тетраплоидного S. surrense Hawkes.) диких видов с культурными видами. По мнению Букасова (1978), колумбийские и эквадорские формы S. andigenum могли произойти от культурного диплоидного вида S. rybinii Juz. et Buk. Юзепчук (1937) и Букасов (1933) считали, что чилийский тетраплоидный картофель сформировался на побережье среднего и южного Чили и прилегающих к нему островах независимо от андийского тетраплоидного картофеля. Юзепчук и Букасов (1929) предполагали, что предками чилийского картофеля являлись дикие виды S. molinae Juz и S. leptostigma Juz, которые наиболее близки к чилийским аборигенным сортам. Данные виды были найдены на острове Чилоэ, они, как и аборигенный культурный чилийский картофель, произрастают в зонах избыточного увлажнения (Юзепчук, 1937; Букасов, 1933, 1970,1978) (рис. 1А).
Согласно гипотезе Хокса (Hawkes, 1990) в эволюции тетраплоидных культурных видов картофеля участвовали диплоидный культурный вид S. stenotomum Juz et Buk и еще два диких диплоидных вида картофеля: S. leptophyes Bitt., S. sparsipilum Bitt. (рис. 1Б). По мнению Хокса, в результате гибридизации и полиплоидизации (рис. 1Б) первоначально образовался Андийский подвид S. tuberosum ssp. andigena Hawk, а от него взял начало подвид tuberosum в Чили (Hawkes, 1966, 1990). Грюн также считал, что чилийские формы S. tuberosum ssp. tuberosum образовались от андийских форм ssp. andigenum (Grun, 1990). По мнению этих авторов, подвид tuberosum мог возникнуть из S. tuberosum ssp. andigenum в результате мутаций и отбора длиннодневных форм.
В то же время Хокс полагает, что различия между чилийским и андийским тетраплоидным картофелем не столь существенны, чтобы выделять их в отдельные виды (Hawkes, 1994).
К. 3. Будиным было высказано предположение, созвучное системе Хокса, что в формировании S. tuberosum принимали участие S. stenotomum Juz et Buk и S. andigenum Juz et Buk (Будин, Крашенинник, 1972).
Таким образом, проблема происхождения культурных видов картофеля является одной из наиболее сложных, а вопросы систематики культурных видов - наиболее спорными.
Изучение идентичности растений при длительном хранении генетических ресурсов растений в контролируемых условиях среды -in vitro и крио коллекциях
При микроразмножении путем непрямого соматического эмбриогенеза, непрямого органогенеза и адвентивной регенерации достаточно часто возникает сомаклональная изменчивость (Larkin, 1998). В то же время, растения, не прошедшие стадий неорганизованного роста и сохраняемые в условиях in vitro в виде микропобегов или микроклубней, остаются генетически стабильными -идентичными исходному геному (Лутова, 2003.). Так, увеличение срока in vitro хранения до 20 лет не вызывало изменений в RAPD спектрах микрорастений картофеля в сравнении с их полевыми аналогами (Антонова и др., 2004а). В данной работе не выявлено и влияние генотипа на стабильность RAPD спектров микрорастений разных сортов (Антонова и др., 2004а). Авторы делали вывод, что при работе с большими коллекциями генных банков растений молекулярные маркеры являются эффективными для экспресс-анализа подлинности образцов и оценки их генетической стабильности. Тем не менее, для окончательного вывода о генетической стабильности образцов, сохраняемых в условиях in vitro, необходимы дополнительные исследования по переводу микрорастений в условия in vivo и сравнению высаженных в почву микрорастений с их полевыми аналогами по комплексу морфологических признаков в полевых условиях (Антонова и др., 2004а).
Достаточно эффективно использовались различные молекулярно-генетические методы и для выявления возможных изменений в последовательностях ДНК регенерантов, индуцированных криоконсервацией. Например, с применением RAPD анализа была исследована генетическая стабильность растений - регенерантов Dioscorea floribunda после криоконсервации верхушечных почек. Для исследования были взяты 60 апексов растений одного генотипа после криоконсервации и 20 апексов in vitro растений того же генотипа в качестве контроля. У всех тестируемых растений продукты амплификации были мономорфны, и только у одного клона выявлен дополнительный компонент RAPD спектра (Ahuija, et al., 2002). В другой работе при изучении генетической стабильности растений - регенерантов двух сортов картофеля Brodick и Golden Wonder, полученных после криоконсервации, использовали ядерные SSR макркеры. Результаты показали стабильность SSR спектров растений, регенерировавших после криоразморозки, по сравнению с исходными генотипами (Harding, Benson, 2001). С использованием ДНК маркеров была изучена также генетическая стабильность каллусов нескольких линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), восстановленных после криохранения. В этой работе было показано, что в размороженных клетках каллусов доля полиморфных ДНК локусов составляла 1,7%, а регенераты, сформированные из размороженных каллусов, полностью сохраняли стабильность анализируемых ДНК спектров (Соловьева, 2011). С использованием 9 пар SSR праймеров была изучена генетическая стабильность микрорастений банана после криоконсервации методом витрификации. Авторы не выявили различий в SSR спектрах микрорастений после криоразморозки по сравнению с их полевыми аналогами, однако было выявлено различие в степени зеленой окраски плодов у одного из ex vitro растений после криоразморозки, по сравнению с его полевым аналогом (Agrawal et al., 2009). Следует иметь в виду, что, отсутствие различий, например, в RAPD, SSR или RFLP спектрах изучаемых растений - регенерантов не дает абсолютной гарантии их генетической стабильности.
Выбор наиболее подходящего метода для выявления сомаклональной изменчивости зависит от степени изученности генома данного вида, в том числе и от наличия данных о последовательностях ДНК, доступности растительного материала, а также от методических возможностей лаборатории. В любом случае, при использовании методов in vitro и крио сохранения образцов в генбанках, для контроля идентичности регенерантов и исходных генотипов необходимо использовать ДНК маркеры.
Оценка уровня гетерозиготности с использованием монолокусных ядерных микросателлитных маркеров
Использование монолокусных nSSR маркеров позволяет определить степень гетерозиготности генотипов. Степень гетерозиготности рассчитывают, используя различные формулы. Так, Гаевский (2002) предлагает рассчитывать максимальную ожидаемую гетерозиготность (Hi) по формуле: Н]=1-1/п, где п -число аллелей в данном локусе. Рассчитанная по этой формуле максимальная ожидаемая гетерозиготность изученных 14 nSSR локусов 118 сортов выборки представлена в таблице 16. Для изученной выборки 118 сортов максимальное значение показателя ожидаемой гетерозиготности - Hi выявлено для локуса STM0037 и составило 90,9%, а минимальное значение (66,7%) - для локуса STG0025. Значения Hi согласуются с максимальными и минимальными значениями РІС изученных nSSR локусов (табл. 16).
Для расчета фактической гетерозиготности Гаевский (2002) предложил формулу H2=Nf/N, где Nh - число гетерозиготных генотипов по данному локусу, N — общее число генотипов в выборке. Рассчитанная по данной формуле для выборки 118 сортов степень фактической гетерозиготности (Н2) 14 изученных nSSR локусов была также достаточно высокой и варьировала от 59,3% (локус STM1104) до 99,1% (локус STI033) (табл. 17). При этом не выявлено соответствия значений Н2 значениям РІС соответствующих локусов. Можно полагать, что при оценке уровня гетерозиготности сортов выборки значения РІС необходимо использовать с осторожностью.
Сравнение данных, представленных в таблицах 16 и 17 показывает, что значения показателей ожидаемой (НО и фактической (Н2) гетерозиготности не совпадают, что может быть связано с полиплоидностью изученного материала и различной степенью гетерозиготности изученных микросателлитных локусов.
Оценивая степень гетерозиготности, необходимо учитывать плоидность генотипов. Как известно, все селекционные сорта картофеля являются тетраплоидами (2п=4х=48), поэтому гетерозиготность каждого локуса может варьировать от дуплекса до квадриплекса. Определить степень гетерозиготности генотипов и идентифицировать дуплексы (Д), триплексы (Т) и квадриплексы (К) для каждого изучаемого локуса позволяет использование монолокусных nSSR маркеров (рис. 8).
Так у изученных генотипов частота проанализированных nSSR локусов в гомозиготом состоянии (симплекс) варьировала от 0,9% до 40,7% и в среднем составила 13,1% на локус (табл. 18). Доля (%) генотипов, имеющих в изученных локусах по две аллели (дуплекс) - варьировала от 25,7% до 71,6%, по три аллели (триплекс) - от 0,8% до 53,8% и по четыре аллели (квадриплекс) - от 0 до 21,2% (табл. 18).
Минимальное значение показателя фактической гетерозиготности (Н2) для локуса STM1104 (табл. 17) можно объяснить высокой частотой генотипов с гомозиготным состоянием данного локуса (40,7%) и отсутствием или минимальным числом генотипов с высокой степенью гетерозиготности данного определенного локуса - квадриплекс или триплекс, соответственно (табл. 18). Напротив, максимальное значение фактической гетерозиготности Н2 для локуса STI033 (табл. 17) можно объяснить минимальной частотой генотипов с гомозиготным состоянием данного локуса (0,9%) и высокой частотой генотипов, у которых в данном локусе выявлено три (триплекс) или четыре (квадриплекс) алллели (табл. 18).
Необходимо учитывать, что реальная частота генотипов, имеющих nSSR локусы в гомозиготном состоянии (симплекс), может быть ниже в случае наличия в определенных локусах «нулевых» аллелей (табл. 19).
Так, наличие одного единственного амплифицированного фрагмента на электрофореграмме nSSR локуса определеннго сорта регистрируется как «симплекс», т.е. гомозиготный (АААА) локус, который во всех четырех гомологичных хромосомах представлен одной и той же аллелью. Однако, это может быть и различное гетерозиготное состояние данного определенного локуса (АААа, Аааа, Аааа) в случае наличия «нулевой» аллели «а» (табл. 19).
Основываясь на оценке числа аллелей каждого из 14 изученных nSSR локусов, в выборке были выявлены сорта, характеризующиеся относительно высокой степенью гетерозиготности, имеющие несколько микросателлитных локусов с наивысшим уровнем гетерозиготности - квадриплекс. Только один сорт - Сентябрь имел максимальное число nSSR локусов (пять) в состоянии квадриплекс, а именно пять, и четыре сорта (Бородянский розовый, Гранат, Матрешка, Румянка) имели по четыре nSSR локуса в состоянии квадриплекс. Эти пять сортов являлись продуктом современной селекции, и были созданы в период 1994 - 2004 гг. У других сортов выявлены только единичные (1-2) локусы в состоянии квадриплекс, а 29 сортов не имели ни одного из изученных nSSR локусов с максимальной степенью гетерозиготности, т.е. в состоянии квадриплекс.
По результатам SSR анализа проведена оценка гетерозиготности микросателлитных локусов для каждого сорта выборки; выявлено число nSSR локусов в гомозиготном состоянии (табл. 20).
Известен факт, что высокогетерозиготные организмы имеют большую адаптивную способность (Алтухов, 2003). Для того, чтобы исследовать возможную связь степени гетерозиготности сортов и их адаптивности, из выборки отечественных сортов (118) были отобраны сорта с широкой адаптивностью (допущенные к использованию в нескольких регионах РФ) и сорта с узкой адаптивностью (допущенные к использованию только в одном отдельном регионе) (Госреестр, 2011 г.) (табл. 21).
Всего, в соответствии с Госреестром, в России различают 12 регионов: 1-Северный; 2- Северо-западный; 3- Центральный; 4- Волго-вятский; 5-Центрально-черноземный; 6- Северо-кавказский; 7- Средневолжский; 8-Нижневолжский; 9- Уральский; 10- Западно-сибирский; 11- Восточно-сибирский и 12- Дальневосточный. Каждый регион объединяет несколько областей или округов РФ (рис. 9). В выборку широко адаптивных сортов мы старались отобрать сорта допущенные к использованию во многих регионах РФ, а также сорта, лидирующие по объемам производства семенного картофеля в разных регионах, такие как: Удача, Жуковский ранний, Снегирь, Голубизна (http://www.agroobzor.ru ). и сорта, которые показали лучшие результаты при агроэкологических испытаниях Ресурс, Накра, Сентябрь и Никулинский (http://www.agroobzor.ru).
Молекулярный анализ регенерантов сортов картофеля после криоразмораживания
Микрорастения сорта Desiree (613089) и образца S. асагйе (613090), регенерировавшие после криоконсервации, в дальнейшем бьши использованы для изучения идентичности их ДНК спектров исходным генотипам. ДНК выделяли из листьев исходных микрорастений 51 acaule и сорта Desiree, а также из листьев регенерантов, полученных после криоконсервации этих образцов. Полученные препараты ДНК амплифицировали с использованием различных систем молекулярных маркеров (6 SSR, 9 RAPD и 2 STS пары праймеров), (табл. 26, рис. 20-21).
Все 6 ядерных SSR маркеров подтвердили идентичность спектров растений после криоразмораживания и соответствующих ДНК спектров контрольных растений. Все девять изученных RAPD праймеров не выявили различий между ДНК спектрами контрольных растений и регенерантов, полученных после криоразмораживания (рис. 20). Не выявлены различия и в спектрах пластидной ДНК (рис. 21) и в спектрах мт- ДНК сравниваемых вариантов. Таким образом, результаты исследования указывают на стабильность исследованных ДНК локусов у изученных образцов после криоразморозки.
Заключение по разделу 1. Исследованные RAPD, nSSR спектры, а также ДНК спектры органельных ДНК у микрорастений, полученных после криоразмораживания, не различались с ДНК спектрами исходных растений. Использование микросателлитных маркеров одновременно позволяет подтвердить принадлежность регенеранта исходному генотипу (сорту).
