Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы.
Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая лимфопролиферативная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного скота (ВЛКРС), входящего в семейство RETROVIRIDAE. Как типичный представитель рода Deltaretrovirus ВЛКРС широко распространен в мировом масштабе и представляет серьезную угрозу скотоводческой отрасли разных стран (N.L. Huber et al,1981; F.L. Pollari et al,1992; Y. Da et al,1993; R.M. Jacobs et al,1991; K.G. Trono et al,2001; A. Kurdi et al,1999; D.D. Motton et al, 2003; S.M. Rodrguez et al, 2011; J. Brenner et al, 1989; K. Trono et al,1999; M.C. Wu et al, 1989), что делает актуальным изучение молекулярно-генетических аспектов при данной инфекции.
Ретровирусы на сегодняшний день являются важными патогенами как для человека, так и для многих видов животных. Семейство данных вирусов отличается наличием уникального этапа в процессе репликативного цикла – обратной транскрипции, опосредованного ферментом обратной транскриптазой – РНК-зависимой ДНК-полимеразой, которую кодирует ген pol в составе генома ретровирусов (G. Gerald et al,1980; R. Kettmann et al,1981).
На основании ветеринарной отчетности Департамента ветеринарии МСХ РФ лейкоз крупного рогатого скота – одно из наиболее распространенных инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. Инфицированность скота в Российской Федерации долгие годы колеблется на уровне 10%. В структуре инфекционной патологии с 1997 года лейкоз КРС занимает одно из первых мест и в настоящее время составляет более 60% (М. И. Гулюкин и др., 2011).
Изучением лейкоза крупного рогатого скота в нашей стране стали заниматься после создания в начале 1961 года лаборатории ВИЭВ по изучению лейкозов сельскохозяйственных животных и птиц. Были разработаны методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота: гематологический (модификация «лейкозного ключа»), патоморфологический. Открытие ВЛКРС (1969) как этиологического агента лейкоза положило начало разработке специфических непрямых (серологических) методов. Долгие годы основой диагностики и оздоровительных мероприятий служила реакция диффузионной преципитации. С 1980г. разработана промышленная технология изготовления наборов методом РИД. В последние годы разработаны и внедрены в производство диагностические наборы для выявления АТ против ВЛКРС методом ИФА на основе моноклональных АТ. Основу мер борьбы с этой болезнью, таким образом, составляют методы серологической диагностики, поскольку у большинства инфицированных животных вырабатываются антитела против антигенов вируса (М. И. Гулюкин и др.,2011; В.А. Апалькин и др.,2005).
В результате проведения многолетних противолейкозных мероприятий в странах Евросоюза лейкоз КРС фактически ликвидирован (N.Gillet et al,2007). Однако, ситуация в Восточной Европе отличается от таковой в Западной Европе, так как болезнь до сих пор присутствует в Болгарии, Греции, Эстонии, Латвии, Польше, Румынии, Украине (S.M. Rodrguez et al,2011). Более 10 и 30% молочного и мясного скота в США и Аргентине, соответственно, инфицированы ВЛКРС (S. Dube et al,2009).
Проблема лейкоза крупного рогатого скота имеет непосредственное отношение к безопасности здоровья человека. Несмотря на то, что случаев естественного инфицирования человека ВЛКРС не выявлено, не исключается вероятность рекомбинации между ВЛКРС и HTLV, что может привести к появлению онкогенных свойств вируса, опасных для человека (A. Burny et al, 1987).
Совершенствование ранней диагностики лейкоза остается по-прежнему актуальным. В ветеринарную практику активно внедряются современные молекулярно-биологические методы – ПЦР как высокочувствительный, специфичный метод прямого выявления возбудителя, секвенирование ДНК, проведение филогенетического анализа. При этом унифицированные методики пробоподготовки, детекции продуктов реакций и автоматизация процессов дают возможность проведения полного спектра анализа генетической информации за короткие сроки.
1.2. Степень проработанности проблемы. Расхождение в нуклеотидных последовательностях ВЛКРС, поражающего крупный рогатый скот различных регионов мира, составляет менее 6% для генов pol и env, что свидетельствует о высокой степени консерватизма генома вируса, обусловленной, по-видимому, высокой точностью обратной транскрипции (N.Gillet et al, 2007). Вместе с тем, использование тест-систем на основе гена env приводит к гораздо большему получению ложноотрицательных результатов исследования по сравнению с серологической диагностикой методом РИД (А.П. Лиманский и др.,2001). Поэтому нуклеотидные последовательности провирусной ДНК гена pol ВЛКРС вызывают большой интерес исследователей с точки зрения разработки ПЦР тест-систем для диагностики индуцированной ВЛКРС инфекции.
В Российской федерации были разработаны тест-системы с использованием праймеров, комплементарных фрагментам гена pol ВЛКРС (Н.А. Мальцева, 2002) на уровне лабораторных образцов, не применяющиеся для практических целей. На ограниченном материале изучен полиморфизм гена pol, кодирующего вирусные ферменты – обратную транскриптазу и интегразу и предложена классификация вариантов ВЛКРС по гену pol (М.Н. Рузина, 2012).
1.3. Цель исследований - оптимизировать молекулярно-генетическую диагностику индуцированной ВЛКРС инфекции.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать тест-систему с использованием нуклеотидных последовательностей гена pol ВЛКРС для молекулярно-генетической диагностики лейкоза методом ПЦР.
-
Оценить универсальность разработанной тест-системы для выявления генетических вариантов ВЛКРС, распространенных на территории РФ.
-
Изучить полиморфизм участка провирусной ДНК, амплифицируемого разработанной тест-системой, изолятов вируса, циркулирующих в различных регионах РФ.
4. Изучить возможность диагностики ВЛКРС инфекции у телят в возрасте до 6 мес. на фоне колостральных АТ и апробировать методику исследования сборных проб крови животных методом ПЦР. Определить место диагностических исследований методом ПЦР в системе профилактических и оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота.
5. Изучить возможность, пути и факторы межвидовой передачи индуцированной ВЛКРС инфекции при заражении гетерологичного вида животных – кроликов.
1.4. Научная новизна.
Разработана тест-система для молекулярно-генетической диагностики лейкоза крупного рогатого скота на основе гена pol ВЛКРС. Определена нуклеотидная последовательность целевого участка гена pol изолятов провируса ВЛКРС из различных регионов РФ и оценены их филогенетические отношения с изолятами из других стран.
Изучено выявление участков ДНК основных провирусных генов (tax/rex, gag, pol, env) методом ПЦР в динамике при воспроизведении в эксперименте индуцированной ВЛКРС инфекции у кроликов.
Подтверждено, что кролики являются чувствительным лабораторным видом животных при внутривенном и пероральном заражении, а молоко инфицированных коров содержит ВЛКРС.
1.5. Теоретическая и практическая значимость.
Сконструирована и испытана ПЦР тест-система для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Для контроля работы праймеров и определения чувствительности тест-системы методом клонирования создан положительный контрольный образец. Определена чувствительность разработанной ПЦР тест-системы. Показана диагностическая универсальность разработанной ПЦР тест-системы при исследовании проб крови животных из различных регионов РФ.
Получен патент N 2445370 «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции».
Предложена схема диагностики ВЛКРС-инфекции с применением ПЦР у молодых животных от 0 до 18 месяцев при проведении оздоровительных и профилактических мероприятий в неблагополучных по лейкозу хозяйствах. С целью сокращения экономических затрат и трудоемкости процесса в данную схему включена методика NAT-минипул-геноскринирования крови, рекомендованная ВОЗ для обеспечения инфекционной безопасности донорской крови.
Депонировано в коллекцию GenBank (NCBI) 9 нуклеотидных последовательностей целевого фрагмента провирусного гена pol ВЛКРС с регистрационными номерами: JQ400140-JQ400144, JQ400146-JQ400148, JQ429586.
1.6. Личный вклад соискателя. Формулирование целей и задач выполнено совместно с научным руководителем. Лично диссертантом подобраны методы исследования, проведены все исследования и анализ результатов, изложенных в диссертации. Соавторами осуществлялись консультативно-методическая помощь, постановка эксперимента по воспроизведению ВЛКРС-инфекции на кроликах и в некоторых случаях предоставление технической базы для выполнения работы. Диссертация написана лично автором с использованием собственных результатов.
1.7. Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы на основе инновационных достижений» (Россия, Новочеркасск, 16-17.07.2009), Международной научно-практической конференции «Мониторинг, прогнозирование, диагностика и профилактика инфекционных заболеваний с применением методов эпизоотологии, молекулярной биологии и биотехнологии» (Украина, Феодосия, 14-17.09.2009), Международной конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвященной 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиопатологии и отдела охраны полезной энтомофауны ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (Россия, Москва, 26-27.04.2011).
1.8. Публикации результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, в том числе 6 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
1.9. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. По результатам проведенных исследований в рамках диссертационной работы: разработана ПЦР тест-система для диагностики ВЛКРС инфекции с использованием генно-инженерной конструкции – рекомбинантного положительного контрольного образца; определена нуклеотидная последовательность участков гена pol изолятов провируса, установлены их филогенетические отношения; проведено выявление различных участков провирусного генома ВЛКРС методом ПЦР в рамках экспериментального воспроизведения лейкоза крупного рогатого скота на кроликах, апробирована методика ПЦР исследования сборных проб крови крупного рогатого скота, что соответствует формуле и областям исследований согласно п.1,9,11, перечисленным в паспорте научной специальности – 03.01.06.
1.10. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 175 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований), выводы, практические предложения, список использованной литературы (который включает 331 источник, в том числе 271 зарубежного автора), приложение. Диссертация содержит 27 таблиц, иллюстрирована 24 рисунками.
