Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Вирусологические аспекты лейкоза крупного рогатого скота 9
2. Методы выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота 14
3. Сравнительный анализ методов оценки устойчивости и
восприимчивости животных к лейкозу 17
4. Сравнительный анализ методов оценки полиморфизма ДНК 23
5. Гены иммунного ответа как кандидатные гены
предрасположенности к инфекционным патологиям 28
6. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота 32
Заключение по обзору литературы 34
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
1. Материалы и методы исследований 37
2. Результаты исследований 42
2.1. Формирование групп животных и создание панели геномной ДНК крупного рогатого скота 42
2.2. Отработка оптимальных условий постановки методов для ОНП - генотипирования43
2.3.Оценка вариабельности генов цитокиновой сети в популяциях крупного рогатого скота57
2.3.1. Влияние породной принадлежности на распределение частот встречаемости аллелей и генотипов 61
2.3.2. Влияние инфицированности вирусом лейкоза на распределение частот встречаемости аллелей и генотипов 66
2.3.3. Оценка связи между генотипами вируса лейкоза крупного рогатого скота и распределением частот встречаемости аллелей и генотипов 69
Обсуждение результатов исследований 75
Выводы 82
Практические предложения 84
Библиография 85
Приложение 108
- Вирусологические аспекты лейкоза крупного рогатого скота
- Материалы и методы исследований
- Формирование групп животных и создание панели геномной ДНК крупного рогатого скота
Введение к работе
Актуальность проблемы.
К числу широко распространенных хронических вирусных заболеваний, ежегодно наносящих ощутимый ущерб животноводческим хозяйствам, относится лейкоз крупного рогатого скота (Т.П. Кудрявцева, 1980; В.М. Нахмансон, 1980, 1986; В.П. Шишков, 1986; В.Н. Сюрин и соавт., 1998; М.И. Гулюкин и со-авт., 1999).
Рост показателей заболеваемости, экономические издержки и социальная значимость проблемы определяют необходимость поиска новых, эффективных подходов решению проблемы отбора и производства крупного рогатого скота с пониженной восприимчивостью к данной инфекции (А.Б. Прохватилова и соавт., 1998; Л.К. Эрнст и соавт., 1998, 2000; Б.Г. Орлякин и соавт., 2000; М.И. Гулюкин и соавт., 2002).
В настоящее время перспективным и своевременным является выяснение механизмов генетической резистентности к инфекционным заболеваниям в популяции сельскохозяйственных животных. Наиболее информативным представляется метод, основанный на анализе ассоциаций между полиморфизмом генов-кандидатов и характерных фенотипических проявлений у животного с использованием однонуклеотидных полиморфных маркеров (ОНП) (W.M. Grosse 1999; М.Р. Heaton et al., 1999, 2001; Н. Zimdahl et al., 2004; К. Zhang et al., 2004).
На сегодняшний день гены, кодирующие наиболее важные белки и участвующие в реакции организма на внедрение инфекционных агентов у разных видов млекопитающих, могут вызывать изменения клинической картины и исходов инфекционного процесса (С. Симбирцев, 1999; И.С. Фрейдлин и соавт., 1999; Н.Н. Носик, 2000; В.И. Коненков и соавт., 2002; R.G. Keefe et al., 1997; F. Altere et al., 1998; J.C. Knight et al., 1999; T. Krakauer et al., 1999; H. Shin et al., 2000; SJ.H. Van Deventer et al., 2000; B.R. Lane et al., 2001; K. Ozaki et al., 2002).
Во многих научных центрах мира ведется интенсивный поиск различных вариантов генов, разрабатываются конкретные приемы, позволяющие предотвратить распространение среди животных болезней, наследуемых генетически, и повысить эффективность селекции.
В организме восприимчивого животного хронически персистирующий вирус может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности и преодоление защитных сил организма. Поэтому, наряду с генетическим статусом хозяина необходимо изучать и генетическую изменчивость самого патогена (L. Willems et al., 1993, 1995; Н. Fechner et al., 1997; M. Licursi et al., 2002).
Изучение полиморфизма генов хозяина и патогена в их комбинациях на уровне индивидуальных геномов открывает новые возможности в понимании молекулярно-генетических механизмов развития патологий.
Цель работы: изучить полиморфизм некоторых генов цитокиновой сети в связи с предрасположенностью крупного рогатого скота к лейкозу и оценить влияние на полиморфизм различных факторов, включая генотипы вируса лейкоза.
Задачи исследований:
1. Сформировать группы животных и создать панель геномной ДНК КРС для дальнейшего выявления и изучения молекулярно-генетических маркеров, отвечающих за резистентность к лейкозу.
2. Оптимизировать условия постановки методов для ОНП - генотипирования (постановка локус-специфической ПЦР, AS-ПЦР, ПДРФ).
3. Идентифицировать вариабельность цитокиновых и функционально связанных с ними генов в популяции крупного рогатого скота (GROX(2), GR03, IL8R, iNOS2).
4. Охарактеризовать группы животных, отличающиеся степенью предрасположенности к инфицированию вирусом лейкоза в популяциях различных пород крупного рогатого скота, по разнообразию аллелей и их частотам.
5. Изучить гетерогенность популяции и ассоциации полиморфных вариантов, исследуемых генов с вариантами генетического полиморфизма вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований получены новые данные, свидетельствующие о влиянии полиморфных вариантов генов цитокиновои сети на предрасположенность к лейкозу крупного рогатого скота. Впервые в РФ получены данные о характере распределения ОНП - маркеров в зависимости от породной принадлежности крупного рогатого скота.
Проведено генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота и изучена взаимосвязь полиморфизма ключевых генов цитокинов хозяина с генетическим полиморфизмом патогена.
Практическое значение работы. Результаты исследований использованы при разработке методических рекомендаций «Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции (ГЩР)», утвержденных ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 4 от 17.07.04г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 15 от 17.07.04г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Оптимальные условия постановки методов для ОНП - генотипирования (постановка локус-специфической ПНР, AS-ПЦР, ПДРФ) генов цитокиновои сети (GROX(2), GR03, IL8R, iNOS2).
2. Результаты анализа ассоциаций изученных полиморфных вариантов с породной принадлежностью и степенью предрасположенности к инфицированию вирусом лейкоза в популяции крупного рогатого скота.
3. Степень гетерогенности популяции вируса лейкоза крупного рогатого скота.
4. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов исследуемых генов с вариантами генетического полиморфизма вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных» (Ставрополь, 2003); международном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Феодосия, 2003); международной научно-практической конференции НГАУ «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2004); международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Новосибирск, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах и состоит из введения, обзора литературы, заключения по обзору литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 19 рисунками. Список использованной литературы включает 192 источника, в том числе 101 зарубежный.
Вирусологические аспекты лейкоза крупного рогатого скота
Лейкозы животных и птиц относительно широко распространены и встречаются почти во всех странах мира. Лейкоз крупного рогатого скота является болезнью, поражающей органы кроветворной системы. Сущность его состоит в патологически усиленной пролиферации лимфоидных клеток в местах их возникновения и за их пределами, выбросе этих клеток в циркулирующую кровь, появлении злокачественных образований в кроветворных и других органах и тканях (Т.П. Кудрявцева, 1980; В.М. Нахмансон, 1980; В.Н. Сюрин и соавт., 1998; М.И. Гулюкин и соавт., 1999). Почти на протяжении века ученые многих стран проводили исследования по изучению вирусной этиологии этого заболевания и лишь 1969 г. вошел в историю как год открытия вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) (G. Bederke et al., 1968; V. Ellerman et al., 1968; J.M. Miller et al., 1969). В последующих работах детально изучена морфология и морфогенез вируса, установлена его онкогенная активность (Р.А. Кукайн и соавт., 1973; Л.Г. Бурба и соавт., 1977; В.А. Крикун и соавт., 1977; А.Ф. Валихов и соавт., 1978; А.Т. Шиков и соавт., 1979; В.П. Шишков и соавт., 1981; Р.А. Кукайн и соавт., 1982; С.Я. Логановский и соавт., 1982; А.Т. Левашев и соавт., 1982; В.П. Шишков, 1984; Л.Г. Бурба, 1985; Р.А. Кукайн и соавт., 1985; J.M. Miller et al., 1972; J.A. Robertsson et al., 1977; J.F. Ferrer et al., 1979; V. Horvath et al., 1979), доказаны инфекционные свойства вируса для некоторых лабораторных и сельскохозяйственных животных, в том числе для крупного рогатого скота (В.М. Жданов и соавт., 1974; Р.А. Кукайн и соавт., 1974; Л.Г. Бурба и соавт., 1979; Н.Е. Hoss et al., 1974; О.С. Straub et al., 1974; A.A. Ressang et al., 1976), для овец (B.K. Паракин, 1979; В.К. Паракин и соавт., 1981; M.J. Van der Maaten et al., 1972; H.E. Hoss et al., 1974; M. Mammerickx et al., 1981) и коз (M. Mammer-ickxetal., 1981).
Вирус лейкоза крупного рогатого скота принадлежит к роду Deltaretrovirus, семейству Retroviridae, подсемейству Oncornaviridae. Это большая группа РНК-содержащих вирусов, имеющих в своем составе уникальный фермент РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу, ревертазу), которая обеспечивает синтез ДНК на матрице вирусной РНК.
Материалы и методы исследований
Работа выполнена на базе лаборатории лейкозов ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и Института биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор».
Объектом исследования являлся крупный рогатый скот распространенных пород (симментальской, красной степной, черно-пестрой голштинизированной с разной долей голштинизации), принадлежащий хозяйствам Новосибирской области: - Карасукский район (ЗАО «Благодатное», ЗАО «Калиновское»); - Новосибирский район (ОПХ «Боровское») Предметом исследования являлись пробы крови и сыворотки крови, инфицированных ВЛКРС, больных лейкозом и интактных животных, а также ДНК, гены цитокиновой сети (GR02(X), GR03, IL8R, iNOS2).
Забор крови осуществляли из яремной вены животного стерильной иглой в пробирки с соблюдением правил асептики и антисептики. В пробирки Флоринского для гематологического исследования кровь отбирали по 3-4 мл с добавлением антикоагулянта (трилон Б). Для получения сыворотки использовали бактериалогические пробирки без антикоагулянта, кровь (10-15 мл) выдерживали в теплом месте (не выше 40 С) 2-3 ч. Для лучшего отделения сыворотки сгусток обводили в пробирке профломбированной проволокой (спицей). Затем материал помещали в холодильник при 4 С и отстаивали 10-12 ч. Отстоявшуюся сыворотку сливали в пробирки Флоринского и маркировали. Для молекулярно-генетических исследований кровь (30-50 мл) отбирали в стерильные одноразовые пробирки. Полученный материал хранился в замороженном виде при температуре -20С. Диагностические исследования крупного рогатого скота на лейкоз и инфекцию ВЛКРС проводили в соответствии с Методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденными ДВ МСХ РФ (М., 2000) в лаборатории лейкозов ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН. Антитела к ВЛКРС выявляли с помощью реакции иммунодифузии (РИД) в агаровом геле. Использовали набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (фирма «Биок», г. Курск). Гематологические исследования крови крупного рогатого скота проводили с использованием фазово-контрастного устройства КФ-4 по методике С.С. Бирбина в модификации П.Н. Смирнова, А.Т. Левашева(1989). Препараты ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови в лаборатории биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор» по методу К. Смита и соавт. (1990) с небольшими модификациями. Процесс получения ДНК состоит из двух частей, заключающийся в лизисе лейкоцитов с участием детергентов и протеиназы, и фенольно-хлороформовой экстракции нуклеиновой кислоты. В начале исследуемый материал необходимо разморозить. Затем его переносят в стаканы для гомогенизации, добавляют буфер А (ЇМ трис НС1 (рН 7,5) - 20 мл; 5М NaCl - 4 мл; 1М MgCl2 - 6 мл.) и гомогенизируют в течение 30 с. Компоненты, входящие в буфер А, лизируют клеточную мембрану лейкоцитов, но не разрушают ядро Полученную однородную массу помещают в центри фужные стаканы, доводят объем буфера А до объема крови и центрифугируют 20 мин при 7-8 тыс. об/мин, что способствует осаждению ядер. По истечении данного времени стаканы с содержимым осторожно вынимают, сливают супер натант, добавляют буфер А, равный одному объему, разбивают осадок и цен трифугируют 10 мин при 7-8 тыс. об/мин. Данную процедуру повторяют еще дважды.
Формирование групп животных и создание панели геномной ДНК крупного рогатого скота
На основании клинико-гематологических и серологических исследований сформированы группы животных: интактные, инфицированные ВЛКРС и больные лейкозом, отличающиеся по породной принадлежности Породы крупного рогатого скота, представленные в таблице 1, наиболее распространены в Новосибирской области и отличаются, согласно литературным данным, различиями в генетической восприимчивости к лейкозу (А.Г. Не-завитин, 1990; В.М. Нахмансон, 1986; В.Л. Петухов, 1992). Черно-пестрая гол-штинизированная порода состоит из двух групп животных, отличающихся по кровности.
При проведении РИД три пробы от скота черно-пестрой голштинизиро-ванной породы (7/8 доли кровности) имели слабоположительную реакцию, т.е. контрольная линия преципитации имела незначительный изгиб, не соприкасаясь с краем лунки с испытываемой сывороткой. Оценена - ++. Четыре пробы (симментальская порода) имели дополнительную полосу, которая располагалась ближе к лунке с испытываемой сывороткой и обусловлена наличием антител к полипептидному антигену (р24) ВЛКРС. Такие животные были отнесены к группе больных.
Остальные пробы имели сильную линию преципитации между лунками испытуемой сывороткой и антигеном, которая проходила по середине расстояния между этими лунками. Оценена - ++++.
Из проб крови животных (30-50 мл) выделили геномную ДНК, которую в дальнейшем использовали для проведения молекулярно-генетических исследований. Из образцов ДНК составили панель для анализа, которая хранится при температуре -20С в нескольких дублирующих вариантах.
