Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Особенности организации генома птиц 16
1.2. Генетические и физические карты хромосом птиц 30
1.2.1. Генетические карты 30
1.2.2. Физические карты 42
1.2.3. Интеграция генетических и физических карт 51
1.3. Геномные библиотеки как инструмент интеграции молекулярного и цитогенетического уровней изучения генома 55
1.4. Гибридизация ДНК/ДНК in situ как метод прямого физического картирования хромосом 68
1.5. Отношения гомологии (ортологии и паралогии) нуклеотидных последовательностей и хромосомных районов 80
1.5.1. Паралогия 81
1.5.2. Ортология 86
1.6. Композиционная гетерогенность ДНК и функциональная специализация геномных фракций 90
Глава 2. Материал и методы 105
2.1. Материал 105
2.2. Полимера зная цепная реакция (ПЦР) 106
2.2.1. Подбор последовательностей ДНК и дизайн праймеров 106
2.2.2. Условия амплификации ДНК 108
Скринироваиие геномных библиотек 109
2.3.1. Олигонуклетидное мечение ДНК-зондов 109
2.3.2. Гибридизация меченых ДНК-зондов с геномными клонами 110
2.3.3. Верификация аутентичности клонов 110
Трансформация клеток Е. соН и выделение эписомной ДНК 111
2.4.1. Трансформация клеток Е. соН 111
2.4.2. Выделение эписомной ДНК макрометодом 112
2.4.3. Очистка эписомной ДНК 113
Секвенирование фрагментов ДНК 114
Приготовление препаратов митотических хромосом птиц 116
2.6.1. Приготовление препаратов митотических хромосом из 96 (72)-часовых эмбрионов 116
2.6.2. Приготовление препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов 117
Флуоресцентная гибридизация ДНК-ДНК in situ (FISH) 119
2.7.1. Мечение ДНК-зондов при помощи ник-трансляции с использованием нерадиоактивных дезоксинуклеотидтр и фосфатов 119
2.7.2. Преципитация ДНК-зондов в присутствии конкурирующей ДНК и супрессия неспецифической гибридизации 121
2.7.3. Гибридизация меченых ДНК-зондов с ДНК митотических хромосом птиц 122
2.7.4. Детекция гибридизационных сигналов с использованием флуоресцентных красителей 124
2.7.5. Анализ результатов гибридизации 125
Глава 3. Результаты 127
3. 1. Скринирование гридированных геномных библиотек с использованием кодирующих последовательностей ДНК в качестве зондов 127
3.1.1. Скринирование космидной геномной библиотеки домашней курицы 127
3.1.2. Скринирование геномной ВАС-библиотеки джунглевой курицы 129
3. 2. Прямое физическое картирование маркеров первого типа на митотических хромосомах домашней курицы 135
3.2.1.Семейство генов циклинов 135
3.2.2. Семейство генов авидинов 139
3.2.3. Семейство генов аденозиновых рецепторов 141
3.2.4. Гены MC1R и ВВС1 141
3.2.5. Гены АРОА1 и ETS1 145
3.2.6. Гены ALB, ANX5, EDNRA, GDF8, MGF, MGP и TYR 145 3.3. Композиционное картирование митотических хромосом домашней курицы и японского перепела 155
Глава 4. Обсуждение 188
4.1. Оценка эффективности применения гридированных геномных библиотек для молекулярно-цитогенетического анализа генома птиц 188
4. 2. Клонирование и хромосомная локализация кластера генов семейства авидинов 193
4. 3. Эволюционный консерватизм районов хромосом домашней курицы и человека 199
4.3.1. Консерватизм теломерной локализации генов MC1R и В ВСІ 199
4.3.2. Колокализация генов АРОА1 и ETSlHa одной микрохромосоме 203
4.3.3. Ортология GGA Ip21-ql2 и HSA 12pl3-q23 206
4.3.4. Ортология GGA Iq23-q44 и HSA 1 Ipl5-q22 212
4.3.5. Ортология GGA 3q23-q210 и HSA 6pl2-q27 215
4.3.6. Ортология GGA 4qll-q24 и HSA 4pI6-q28 217
4.3.7. Ортология GGA 5qll-ql2 и HSA Ilpl3-q24 222
4. 4. Отношения паралогии нуклеотидных последовательностей внутри семейства генов аденозиновых рецепторов домашней курицы 225
4.5. Сравнительное композиционное картирование хромосом домашней курицы и японского перепела. Функциональная компартментализация генома птиц 228
Заключение 233
Выводы 236
Список литературы 238
- Геномные библиотеки как инструмент интеграции молекулярного и цитогенетического уровней изучения генома
- Гибридизация меченых ДНК-зондов с геномными клонами
- Приготовление препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов
- Клонирование и хромосомная локализация кластера генов семейства авидинов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Комплексный подход к анализу генома предполагает интеграцию молекулярного и цитогенетического уровней исследования хромосом. Изучение молекулярно-цитогенетической организации генома птиц в аспекте сравнения с геномом млекопитающих открывает возможности вскрытая общих закономерностей структурно-функциональной организации хромосомы эукариотической клетки и выяснения ее особенностей, определяемых таксономическим положением видов. Стратегия картирования геномов животных во многом определяется структурой их кариотипов и особенностями организации нуклеиновых кислот.
Среди позвоночных животных класс Aves отличается наибольшей консервативностью величины геномов: для изученных в этом отношении видов птиц содержание ДНК на клеточное ядро варьирует от 1.7 до 3.5 пг. Гаплоидный геном птиц в среднем состоит го 1.2 х 109 пар нуклеотидов, что в 2.75 раза меньше, чем у млекопитающих. Сравнительно низкое содержание ДНК в геномах птиц объясняют "необходимостью полета", а высокий эволюционный консерватизм этого показателя - монофилетическим происхождением класса Aves (Kadi et al., 1993). Главной отличительной особенностью кариотипов птиц является многочисленность и гетерогенность входящих в их состав хромосом. Ввиду того, что хромосомы в классе Aves различаются по размеру, их принято условно делить на 2 группы: группу макрохромосом, состоящую из шести - восьми пар относительно крупных по размеру (3-8 мкм) хромосом и группу микрохромосом - мелких трудноидентифицируемыххромосом (0.3-3 мкм) (Schmidetal., 2000).
Несмотря на то, что представитель класса Aves - домашняя курица -стала первым объектом генетики животных (Bateson and Sounders, 1902), ограниченное число молекулярно-цитогенетических работ на момент начала
исследований в рамках представленной [та^9^^^^д^ЩГРРоведено на
I БИБЛИОТЕКА !
небольшом числе видов птиц. Генетические и физические карты хромосом птиц, являющиеся своего рода путеводителем по геному, остаются сравнительно малонасыщенными и по настоящее время (). Наиболее изученным с генетической точки зрения видом птиц является домашняя курица Gallus gallus, что обусловлено как хозяйственным значением этого вида, так и удобством ее использования в качестве модельного лабораторного объекта. Способность к размножению круглый год и сравнительно быстрая смена поколений существенно упрощает эксперименты по гибридологическому анализу. Детальная информация по биологии развития этого вида позволяет обсуждать генетические данные в общебиологическом контексте.
Своеобразие организации кариотипов птиц - структурная компартментализация генома (наличие микро - и макрохромосом) - давно привлекает внимание цитогенетиков в отношении изучения возможной функциональной специализации хромосом. В последнее время показана высокая генетическая активность микрохромосом, плотная насыщенность их кодирующими последовательностями ДНК, в первую очередь генами «домашнего хозяйства» и онкогенами (McQueen et al., 1998).
Прямое физическое картирование хромосом курицы проводится
преимущественно методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). В
настоящее время известна внутрихромосомная локализация около 250
маркеров первого типа (кодирующих генов), кроме того, многие физически
картированные протяженные (30 - 200 т.п.н.) геномные клоны могут
содержать кодирующие. последовательности ().
Применяются различные варианты ДНК-ДНК гибридизации in situ и системы детекции гибридизационного сигнала. В качестве ДНК-зондов часто используются протяженные (30 - 200 т.п.н.) клоны из геномных градированных библиотек, что на наш взгляд, является наиболее перспективным подходом, поскольку позволяет добиться почти стопроцентной эффективности гибридизации (Buitkamp et al, 1998; Smith et
al., 2001; Sazanov et al., 2002). Большие надежды возлагают на использование специальных хромосомоспецифических проб для микрохромосом и пэйнтинговых ДНК-зондов для макрохромосом (Zimmer et al., 1997; Fillon et al., 1998; Guillier-Gensik et al., 1999), которые могут существенно упростить процедуру идентификации хромосом и хромосомных районов. Нужно отметить, что использование хромосом типа ламповых щеток параллельно с митотическими зачастую позволяет повысить разрешающую способность метода (Mizuno etal, 1998; Rodionovet al, 2002).
В настоящее время известно более ста ортологичных районов курицы и человека (Schmid et al., 2000; Burt, 2002). С точки зрения сравнительного картирования, ортологии хромосомных районов, домашняя курица оказалась более близкой к человеку, чем даже домовая мышь (Burt et al, 1999). Это, с одной стороны, позволяет экстраполировать данные полного секвенирования генома человека на значительное число хромосомных районов птиц, с другой стороны определяет ценность данных геномики курицы для генетики человека и медицинской генетики.
Высокий уровень эволюционного консерватизма кариотипа птиц и показанная в последнее время высокая гомология нуклеотидных последовательностей (Родионов, 2002) дают основание говорить об этом классе как едином целом в отношении молекулярной организации генома.
Основными направлениями структурно-функциональной
характеристики геномов являются:
построение генетических и физических карт хромосом
исследование блочной организации и композиционное картирование хромосом
- выявление внутригеномной гомологии (паралогии) и гомологии
нуклеотидных последовательностей у разных видов (ортологии).
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является комплексная характеристика молекуляр'ной организации генома птиц. Сформулированы следующие задачи:
- оценка эффективности применения гридированных геномных библиотек
высокой плотности как инструмента геномного картирования
- локализация на хромосомах маркеров первого типа (кодирующих
последовательностей ДНК)
«заякоривание» маркеров первого типа на сравнительных генетических и физических картах хромосом человека и выявление ортологии хромосомных районов.
анализ распределения по геному генов различных семейств
- исследование паралогии на примере семейства генов аденозиновых
рецепторов
композиционное картирование хромосом курицы и перепела.
характеристика функциональной специализации микро- и макрохромосом. Научная новизна работы. Впервые продемонстрирована эффективность использования гридированных геномных библиотек для комплексных исследований генома птиц. Впервые клонирован кластер генов семейства авидинов домашней курицы. Впервые установлена локализация генов ADORA1, ADORA2B, ADORA3, АРОА1, AVD, AYR, ВВС1, CCNC, CCND1, CCND2, CCND2P, CCNE, EDNRA, GDF8, MC1R на хромосомах домашней курицы. С использованием протяженных ДНК-зондов подтверждена ранее установленная другими авторами локализация генов ALB, ANX5, MGF, MGP и TYR. Впервые использован метод двуцветной флуоресцентной гибридизации in situ для колокализации нуклеотидных последовательностей на микрохромосомах. Впервые установлена ортология макрохромосом 3 и 5 домашней курицы и хромосом 6 и 11 человека, соответственно. Впервые показан эволюционный консерватизм теломерной локализации генов ВВС1 и MC1R у птиц и млекопитающих. Впервые исследован на хромосомном уровне феномен паралогии в геноме птиц на примере семейства генов аденозиновых рецепторов. Впервые проведено композиционное картирование митотических хромосом домашней курицы и японского
перепела и продемонстрирована структурно-функциональная
компартментализация генома птиц.
Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной
к защите работы использованы при составлении баз данных по генетическим
и физическим картам хромосом курицы и сравнительным картам человека,
мыши и курицы () и банка данных нуклеотидных
последовательностей () в сети Интернет (более 500
идентификационных входов). Материалы диссертации используются при
чтении лекций на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского
государственного университете в рамках магистерской программы
«Эволюционная цитогенетика». Поскольку домашняя курица и японский
перепел являются ценными сельскохозяйственными видами, данные по
картированию нуклеотидных последовательностей на хромосомах этих видов
могут быть использованы в работах по позиционному клонированию
хозяйственно ценных признаков и селекции при помощи молекулярных
маркеров (marker-assisted selection). Данные по эволюционному
консерватизму районов хромосом человека и домашней курицы могут быть использованы для моделирования хромосомных болезней человека. Апробация работы. Материалы работы были представлены на VI съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) им. Н.И.Вавилова. (Минск, 1992), 1-ой международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1994), 1-ом съезде Российского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Саратов, 1995), международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных» (Дубровины, 2001), П-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), атакже за рубежом HaXVII-ОММеждународном съезде генетиков (Бирмингем, Великобритания, 1993), Х1-ой Европейской Птицеводческой конференции (Айр, Великобритания,
1994), ХІ-ом Североамериканском коллоквиуме по цитогенетике и генетическому картированию домашних животных (Техас, США, 1995), VI-ой Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 1998), XV-ом Европейском коллоквиуме по цитогенетике и генетическому картированию животных (Неаполь, Италия, 2002), Х-ой Международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2002). Результаты периодически докладывались на отчетных сессиях ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН, семинарах кафедры генетики и селекции СПбГУ, кафедры селекции животных Мюнхенского технического университета и на рабочих совещаниях программы Европейского Союза "Chickmap". Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации были опубликованы в научных журналах "Nature", "Animal Genetics", "Chromosome Research", "Cytogenetics and Cell Genetics", «Генетика» и «Цитология». Всего по теме работы опубликована 41 печатная работа. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц, 46 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Литература». Положения, выносимые на защиту.
Гридированные геномные библиотеки ДНК птиц могут быть эффективно использованы для комплексного анализа генома на молекулярном и хромосомном уровнях.
Авидиновые гены домашней курицы организованы в форме кластера, который находится в районе Zq21.
Гены ALB, ANX5, АРОА1, ВВС1, CCNC, CCND1, CCND2, CCND2P, CCNE, EDNRA, GDF8, MC1R, MGF, MGP и TYR проявляют эволюционный консерватизм локализации на хромосомах человека и домашней курицы, что свидетельствует о высоком уровне гомологии хромосом этих видов.
На основании локализации генов CCNC, CCND1, MYB и ТН районы хромосом HSA6pl2-q27 и GGA3q23-q210, HSA Ilpl3-q24 и GGA5qll-ql2 являются ортологичными.
Консерватизм теломерной локализации на одной хромосоме генов ВВС1 и MC1R наблюдается у представителей классов млекопитающих и птиц.
Гены ADORA1 и ADORA3 домашней курицы находятся на одной микрохромосоме, в то время как у человека они расположены в удаленных друг от друга паралогичных районах. Таким образом, отношения внутригеномной гомологии нуклеотидных последовательностей могут быть принципиально различными в классах млекопитающих и птиц.
Распределение фракций изохор на хромосомах домашней курицы и японского перепела является принципиально сходным, что свидетельствует о единообразии композиционной организации геномов этих видов.
Приуроченность тяжелых фракций изохор к микрохромосомам и теломерным районам макрохромосом, а легких - к интерстициальным районам макрохромосом дает основание сделать вывод о наличии структурно-функциональной компартментализации генома птиц.
Геномные библиотеки как инструмент интеграции молекулярного и цитогенетического уровней изучения генома
Возможность быстрого получения препаративных количеств ДНК протяженных ( 30 т.п.н.) фрагментов генома является необходимым условием большинства экспериментов по молекулярно-генетическому и цитогенетическому анализу геномов. Гридированные геномные библиотеки, то есть имеющие адресное указание индивидуальных клонов, позволяют получать протяженные фрагменты ДНК, содержащие интересующую исследователей последовательность, и широко используются для анализа генома с использованием различных подходов (Buitkamp et al., 1998),
Первая генетическая система для масштабного клонирования протяженных фрагментов генома была создана Бурке в 1987 году (Burke et al., 1987). Она была основана на искусственных хромосомах дрожжей (YACs), включающих центромер, теломеры, автономно-реплицирующиеся последовательности, сайт клонирования и гены селективных маркеров. Система позволяла клонировать нуклеотидные последовательности до 1000 т.п.н. Поскольку в начале 90-х годов интенсивно проводилось секвенирование генома человека, такие системы были быстро востребованы и использованы для создания геномных библиотек (Schalkwyk et al., 1995). Однако, существенные недостатки этого рода библиотек - высокий уровень химеризма, нестабильность геномной вставки и трудность приготовления препаративных количеств клонированных последовательностей ДНК - не позволили их использовать в качестве основного инструмента геномного клонирования. Большое количество тандеми ых повторов генома млекопитающих приводило в дрожжевой системе к сайт-специфической рекомбинации и потере фрагментов вставки, либо к образованию химерных клонов, то есть клонов, содержащих фрагменты ДНК из разных областей генома-донора (Schalkwyk et al., 1995). Цитологически химерные клоны выявляются при гибридизации in situ, поскольку локализуются в двух и более сайтах (Buitkamp et al., 1998).
Поскольку прокариотические системы рекомбинации оставляют меньпіе вероятности нежелательных обменов, кроме того эписомы прокариот отличаются относительной стабильностью и могут существовать в супере кручен ной форме, бактерии оказались более привлекательны как организмы-хозяева для геномных клонов. Плазмидные векторы не только проще хромосомных эукариотических векторов (не содержат центромера, теломеров) и, следовательно конструирование библиотек с ними менее трудоемко, но и позволяют существенно упростить процедуру выделения ДНК основанных на них клонов путем полного разрушения хромосомной.
Первым вектором с использованием клеток кишечной палочки Escherichia col і были космиды - плазми ды, содержащие сегмент ДНК фага К с соединенными липкими концами (cos-сайты) (Сингер и Берг, 1998). Важной чертой большинства космидных векторов для клонирования является их способность включать вставки до 45 т.п.н. Если кольцевую космидную ДНК разрезать по какому-то уникальному сайту, смешать с фрагментами ДНК, содержащими липкие концы и произвести отжиг, то образуются длинные конкатемеры. При смешении этих конкатемеров с белками, осуществляющими упаковку фага X, они разрезаются по cos-сайтам и ДНК упаковывается в головку фага. Этот процесс позволяет отобрать вставки большой протяженности, так как для того, чтобы ДНК упаковывалась в головку фага, расстояние между cos-сайтами должно быть 38 - 52 т.п.н. Такая смесь может содержать фрагменты вовсе без вставки или с несколькими повторяющимися вставками, что отражается на качестве полученной библиотеки и затрудняет ее применение для геномного анализа. Реципиентные клетки приобретают упакованные космиды в результате инфицирования «фальшивыми» фаговыми частицами, причем этот процесс более эффективен, чем трансфекция плазмидной ДНК. Попав в клетку-хозяина, рекомбинантная ДНК амплифицируется и сохраняется в виде плазмиды (Сингер и Берг, 1998). Полученные рекомбинантные клоны могут быть гридированы - выращены на платах с точным указанием адреса каждого клона. Получение отпечатков (реплик) на нитроцеллюлозных или других фильтрах для переноса ДНК с последующим разрушением клеточных стенок бактерией и отмыванием белков позволяет проводить скринирование таких библиотек при помощи обычной дот-блот ДНК-ДНК гибридизации (Buitkamp et al., 1998). Недостаткам космидных геномных библиотек является относительно (по сравнению с искусственными хромосомами дрожжей) небольшая величина вставки (до 45 т.п.н.) и, следовательно, большой объем библиотеки (для геномов млекопитающих около 2 х 105 клонов (Human Genome Lectures, http://www.ucl.ac.uk).
Для того чтобы совместить преимущества космидных библиотек (высокая стабильность ДНК-клонов, относительно низкий уровень химеризма, простота конструирования, удобство выделения ДНК) и дрожжевых библиотек (большая длина вставки и компактность всей библиотеки), было разработано две системы клонирования - на основе искусственных хромосом бактерий (ВАС) и искусственных хромосом фага Р1 (РАС). Впервые РАС вектор (pCYPAC-І) был использован Иоанноу и соавт. в 1994 году (Ioannou et al., 1994) для переноса рекомбинантной ДНК в клетки Escherichia соИ при помощи электропорации. Разделенные при помощи пульс-электрофореза фрагменты геномной ДНК человека были упакованы в головки частиц бактериофага Р1. Заражение такими фаговыми частицами штамма Е. соИ, экпрессирующих рекомбиназу Сге привело к возникновению эписомных копий генома рекомбинантных фаговых частиц. Полученная геномная библиотека содержала 15 000 клонов со средним размером вставки 130 — 150 т.п.н. Тридцать четыре клона были гибридизованы на митотических хромосомах методом FISH, при этом не было выявлено ни одного случая химеризма. Продолжительное культивирование бактерий не выявило нестабильности вставки на примере 20 клонов (Ioannou et al., 1994).
Гибридизация меченых ДНК-зондов с геномными клонами
Предгибридизацию реплик гридированных библиотек проводили инкубированием при 65 С в растворе Church Buffer (0,342 М NajHPO 0,158 М NaH2P04, 7% SDS, 1% BSA, pH 7.2) в течение 1 часа. Затем в раствор добавляли по 25 мкл меченого ДНК-зонда на библиотеку и инкубировали при той же температуре в течение 16 часов. Отмывки проводили по следующей схеме: SDS при комнатной температуре в течение 7 минут Затем фильтры заворачивали в полиэтиленовую пленку Sarah Wrap помещали в кассеты. Анализ результатов гибридизации проводили методом авторадиографии на рентгеновской пленке Kodak или прямым сканированием на приборе FX-Scan. Полученные изображения обрабатывали при помощи пакета компьютерных программ Quantity-One.
Верификацию аутентичности клонов проводили путем прямого секвенирования фрагментов ДНК при помощи секвенатора ABI-377 (Perkin ПО Elmer) и набора Big-Dye-Mix (Perkin-EImer) или при помощи ПЦР. В последнем случае признаком аутентичности считали получение амплифицированного фрагмента ДНК ожидаемой длины. Для некоторых макрохромосомных ДНК-клонов локализацию методом FISH в одном районе двух и более косм ид, предположительно содержащих один и тот же ген, считали достаточным основанием для признания их аутентичности. Е. coli и выделение эписомной ДНК
Трансформацию и выделение эписомной ДНК проводили по стандартной методике (Маниатис и соавт., 1984). Добавляли 5 -10 нг эписомной ДНК к 100 мкл компетентной культуры штамма DH5a кишечной палочки Е. coli. Смесь инкубировали на льду в течение 1 часа. Затем проводили термическую обработку в течение 2 минут при 42 С на водяной бане. После чего смесь инкубировали 2 минуты на льду. Добавляли 100 - 500 мкл жидкой среды LB (бактотриптон -10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлорид натрия -10 г, дистиллированная вода до 1л; рН 7.5) без антибиотика и помещали на 30 - 45 минут в качалку при температуре 37 С, После чего смесь осаждали центрифугированием при 2000 об./мин. в течение 5 минут. Осадок ресуспендировали в 100 - 200 мкл стерильной бидистиллированной воды и высевали на чашки Петри с твердой средой LB с ампицилином (или хлорамфениколом при работе с искусственными хромосомами бактерий из Техасского Ресурсного Центра) (30-50 мг антибиотика на литр среды LB). Бактерии выращивали в суховоздушном термостате при 37С в течение 16-18 часов.Скалывали стерильной зубной палочкой одну проросшую на селективной среде колонию, переносили ее в 100 мл среды LB жидкой с антибиотиком (50 мг/л) и помещали на сутки в качалку при 37 С. Выросшие бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 5000 об./мин. в течение 5 минут и промывали в 10 мл раствора 1 (25 мМ Tris-HCL (рН-8.0), Ю мМ ЭДТА). Затем клетки осаждали центрифугированием при 5000 об./мин. в течение 5 минут. Осадок подвергали замораживанию при -20 С на несколько часов. Затем осадок растворяли в 5 мл раствора 2 (25 мМ Tris-HCL - 10 мМ ЭДТА - 0.9% глюкозы). После этого добавляли два объема раствора 0.2 н NaOH, 1% SDS и инкубировали полученную смесь на льду в течение 15 минут. Затем добавляли полтора объема (7.5 мл) 5 М ацетата калия и инкубировали смесь 1 час на льду.
Приготовление препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов
Культивирование эмбриональных фибробластов и приготовление препаратов митотических хромосом из них осуществляли по стандартной методике (Ponce de Leon et al, 1992) с некоторыми изменениями. каплю полной среды и ресуспендировали. Суспензию клеток помещали во флакон Корреля объемом 25 мл, добавляли 7 мл полной среды и инкубировали в суховоздушном термостате в присутствии 5 % СОг при температуре 38 С. Через 48 часов проводили смену среды. Рост культуры контролировали при помощи инвертированного микроскопа «МБИ-13» (ЛОМО). После образования монослоя среду удаляли, клетки промывали стерильным фосфатным буферным раствором и обрабатывали 0.05% раствором трипсина (примерно 0,5 - 1 мл). Степень трипсинизации контролировали при помощи инвертированного микроскопа «МБИ-13» (ЛОМО). При наблюдаемом округлении большинства клеток добавляли 2 мл полной среды для инактивации трипсина и резко встряхивали флаконы, чтобы отделить клетки от субстрата. Полученную суспензию переносили в пробирки объемом 15 мл и осаждали центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли гипотонический раствор 0.5% хлористого калия. Дальнейшую обработку материала проводили также как и при приготовлении препаратов митотических хромосом из 96 (72)-часовых эмбрионов курицы (2.5.1).
В пробирку фирмы Эппендорф емкостью 1.5 мл помещали на льду: - 10-кратный буфер - 5 мкл -100 мМ р-меркаптоэтанол - 5 мкл - смесь dNTP (dCTP, dGTP, dTTP 0,5 мМ, dATP 0,1 мМ)- 5 мкл - 1мМ digoxigenin-16-dUTP или biotin-l 1-dUTP - 2 мкл - ДНК-зонд - 0,5 -1 мкг - ДНКаза 1(1 м кг/мл) - 5 мкл - ДНК-пол и мераза I (10 ед. /мкл) - 1 мкл - бидистилированная вода - до 50 мкл Смесь инкубировали в водяной бане при 16 С в течение двух часов. Размер полученных фрагментов оценивали методом электрофоретического разделения в агарозном геле и регулировали его повторным инкубированием при температуре 16 С в присутствии ДНКазы I. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 0.5 М ЭДТА, когда размер фрагментов был в пределах 200 - 700 п.н.. П9 Проверку эффективности мечен ия ДНК-зонда проводили по следующей схеме: исходный раствор меченого ДНК-зонда разводили до концентраций 100 пг/мкл, 10 пг/мкл и 1 пг/мкл и наносили на нейлоновый фильтр фирмы «Sigma» по 1 мкл из каждого разведения. Фильтр подсушивали и облучали на транс-иллюминаторе ультрафиолетовым светом в течение 2 минут. Затем нейлоновый фильтр инкубировали в 3 % блокирующем растворе фирмы «Boehringer Mannheim», приготовленном на 0.1 % Tween20 в 4 х SSC для ДНК-зондов, меченых биотином, или в 1 % блокирующем растворе фирмы «Boehringer Mannheim», приготовленном на малеиновом буфере для зондов, меченых дигоксигенином, в течение 30 минут при 37 С. После этого добавляли 1 мкл коньюгата авидин-щел очной фосфатазы к 2 мл блокирующего раствора для ДНК-зондов, меченых биотином, и 0.5 мкл коньюгата антител против дигоксигенина со щелочной фосфатазой к 5 мл 1% блокирующего раствора на малеиновом буфере для ДНК-зондов, меченых дигоксигенином, и инкубировали в течение 40 минут при 37 С. Отмывки проводили в трех сменах 0.1%Tween-20 в 4 х SSC по 5 минут каждая. Затем помещали нейлоновый фильтр в буфер для детекции (0.1 М трис-НС1, рН- 9.5; 0.1 М хлористый натрий, 50 мМ MgCb) и добавляли 9 мкл нитроблютетразола и 7 мкл бром-4-хлор-4-индолил-фосфата. Фильтры инкубировали в полученной смеси в течение одного часа при комнатной температуре. Если на нейлоновом фильтре проявлялся положительный сигнал для разведения 1 пг/мкл, такой зонд использовали для дальнейшей работы.
Клонирование и хромосомная локализация кластера генов семейства авидинов
Авидин - белок, связывающий биотин с высокой специфичностью (близкой к специфичности связывания при иммунологических взаимодействиях) (Wilchek and Bayer, 1990). Его экспрессия происходит в клетках яйцевода во время созревания яиц и находится под регуляцией прогестерона (Tuohimaa et al., 1989). Считается, что авидин взаимодействует с различными белками, обеспечивающими защиту развивающегося эмбриона от инфекций (Tuohimaa et al., 1989). Кроме яйцевода наблюдается следовая экспрессия этого белка в различных тканях самцов и самок после их травматического повреждения, при бактериальной или вирусной инфекции (Elo et al., 1980). До начала наших исследований было известно пять гомологов гена авидина (AVR1-5), имеющих 94 - 100 % идентичности между собой и91-95%-с геном авидина (Keinanen et al., 1994; Wallen et al., 1995). Оказалось, что гомология внутри интронов (в среднем 97 %) оказалась выше, чем в экзонах (90 %) (Wallen et al., 1995). Первые пять гомологов гена авидина были клонированы в виде перекрывающихся протяженных клонов, что позволило сделать вывод об их кластеризации (Keinanen et al., 1994). Однако до начала наших исследований взаимная ориентация авидиноподобных генов внутри кластера и их хромосомная локализация не были известны, не было ясно также все ли авидиноподобные гены клонированы.
Скринирование гридированной геномной космидной библиотеки RZPD-125 с использованием в качестве зондов кДНК авидина (Gope et al., 1987), имеющей гомологию нуклеотидной последовательности со всеми представителями семейства авидиновых генов, и олигонуклеотида, специфического только для гена AVD, позволило изолировать 5 клонов, представляющих AVD, и 9 клонов авидиноподобных последовательностей (Таблица 3). Таким образом, при проведении скрининга в условиях, когда олигонуклеотид МА2 специфически гибридизовался с геном авидина и не мог давать положительный гибридизационный сигнал с другими фрагментами кластера, нам удалось идентифицировать геномные клоны (007-04 и С21-154) для ранее неизвестных гомологов гена авидина - AVR6 и AVR7. Нами был клонирован фрагмент хромосомы длину которого исходя из среднего размера клона (около 40 т.п.н.) и четырехкратного покрытия библиотеки можно оценить в 100 т.п.н. Методом флуоресцентной гибридизации ДНК-ДНК in situ кластер авидиновых генов был нами локализован на половой Z-хромосоме домашней курицы в прителомерном районе q21 (Рисунок 15).
На основании полученных нами данных, Алрот и соавторы секвенировали район расположения кластера авидиновых генов (27 т.п.н.), выявили и охарактеризовали не известные ранее гены AVR6 и AVR7, установили взаимное расположение и взаимную ориентацию генов AVD, AVR1, AVR2, AVR3, AVR4 и AVR5 (Ahlroth et al., 2000). Схема организации кластера авидиновых генов, представлена на рисунке 42, была составлена на основе частичного секвенирования и рестрикционного анализа идентифицированных нами космидных клонов А02-И4, Р23-156, L09-154, А24-07, 004-05, 007-04, F18-104, К18-233 и С21-154. Клоны L09-154 и Р23-156 оказались идентичными, и клоны 004-05 и С21-154 - практически идентичными, за исключением концевой последовательности. Нуклеотидные последовательности генов AVR6 и AVR7 были внесены в геномную базу данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) под идентификационными номерами (NCBI accession number) AJ237658 и AJ237659, соответственно.
Клонирование кластера авидина и авидиноподобных генов позволило установить взаимную ориентацию этих генов, которая ранее была определена только для AVD и AVR1-5 условно на основании данных ПЦР на двух частично перекрывающихся клонах (Wallen et al., 1995). Оказалось, что ген авидина находится на удалении (9 т.п.н.) от остальных элементов кластера, расположенных в непосредственной близости друг от друга (2,5 -2,8 т.п.н.). Поскольку построенный нами контиг включает последовательности, выходящие за пределы кластера на 35 - 40 т.п.н. в двух направлениях, все авидоноподобные гены можно считать клонированными (Ahlrothetal.,2000). Из всех генов, входящих в кластер, только ген авидина транскрибируется на высоком уровне (Ahlroth et al., 2000). Описаны минорные информационные РНК для генов AVR1, AVR2 и AVR3 (Kunnas et al., 1993). Однако, не известно происходит ли трансляция этих транскрпитов. Известно, что прогестерон не оказывает влияния на транскрипцию генов AVR1, AVR2 и AVR3, которая описана только в тканях, подвергшихся воспалению (Kunnas et al., 1993). Считать авидоноподобные гены псевдогенами нельзя, поскольку их кодирующие последовательности не нарушены и в кластере присутствуют потенциально активные промоторы и сигналы посттрансляционной модификации (Ahlroth et at, 2000). На наш взгляд, следует признать рабочей гипотезой недавнее возникновение кластера путем серии дупликаций и последующей дивергенцией и инактивацией части авидиноподобных генов. На это указывает также то обстоятельство, что степень гомологии нуклеотидных последовательностей фрагментов кластера достаточно велика (около 95%) не только в кодирующих частях, но и за пределами рамки считывания (Ahlroth et al., 2000). Наличие делении величиной 6 п.н. во втором экзоне генов AVR1-7 по сравнению с AVD говорит о том, что все они от одной предковой последовательности, которая в свою очередь является результатом дупликации гена AVD
