Введение к работе
Актуальность проблемы Активность серотониновой системы у человека и животных в значительной степени определяется встроенным в преси-наптическую мембрану белком - серотониновым транспортером (СЕРТ), который обеспечивает обратный захват неиромедиатора из пресинаптическои щели СЕРТ представляет большой интерес не только для нейробиологии, но и для фармакологических разработок Этот белок служит мишенью для три-циклических антидепрессантов и селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, а также для кокаина и наркотических амфетаминов
Молекулярно-генетические исследования позволили установить первичную структуру СЕРТ и показали, что СЕРТ принадлежит к семейству Na+ и СГ~- -зависимых транспортных белков, которые осуществляют перенос ряда биогенных аминов и аминокислот, являющихся нейротрансмиттерами и ней-ромодуляторами На основании первичной структуры клонированных генов были предложены модели структурной организации СЕРТ и других белков этого семейства, предполагающие наличие 12 трансмембранных доменов (ТМД) Вместе с тем, несмотря на значительный прогресс молекулярно-генетических исследований, на белковом уровне СЕРТ изучен недостаточно, в частности недостаточно выяснены пути пост-трансляционного процессинга Один из наиболее эффективных путей изучения белковых молекул - использование антител с заранее заданной специфичностью к определенным участкам белка (сайт-специфических антител) В настоящее время опубликовано несколько работ по анализу СЕРТ методом иммуноблоттинга с помощью таких антител Однако, наблюдается большая вариабельность в величинах молекулярных масс СЕРТ-иммунореактивных полипептидов, выявляемых в разных работах Одной из причин этих несовпадений может быть несовершенство иммунохимических методов анализа СЕРТ, которыми в настоящее время могут располагать исследователи (например, недостаточная чувствительность иммуноблоттинга) Вместе с тем, несмотря на указанные сложности, СЕРТ был выявлен не только в мозге, но также во многих периферических структу-
pax, например на наружных мембранах тромбоцитов Считают, что тромбоциты могут служить удобной экстрацеребральной моделью для изучения СЕРТ Вместе с тем, систематических исследований по анализу СЕРТ в тромбоцитах методом иммуноблоттинга не проводилось, что затрудняет использование этой модели в фармакологических и нейробиологических исследованиях
Таким образом, актуальным является а) получение новых сайт-специфических антител, распознающих различные участки первичной структуры СЕРТ, б) создание на их основе более эффективных и воспроизводимых тест-систем для иммунохимического анализа СЕРТ ( в том числе усовершенствованных вариантов иммуноблоттинга СЕРТ), с) использование этих методов для более детальной характеристики продуктов экспрессии гена СЕРТ в различных тканях и клетках
Цели и задачи исследования Целью настоящего исследования было получение и характеристика панели сайт-специфических антител к трем различным фрагментам молекулы СЕРТ и использование этих антител для анализа СЕРТ человека и крысы в тромбоцитах и ткани мозга
В задачи работы входило
-
получение моноклональных антител (МкАТ) к С-концевому фрагменту 597-630 СЕРТ крысы и человека,
-
получение поликлональных антител (ПкАТ) к фрагменту 69-83 в N-концевой части молекулы СЕРТ человека,
-
получение ПкАТ к фрагменту 86-100, расположенному в начале ТМДI молекулы СЕРТ человека;
-
анализ реактивности (методом иммуноблоттинга) СЕРТ-специфических МкАТ и ПкАТ в экстрактах тромбоцитов человека,
-
анализ реактивности (методом иммуноблоттинга) СЕРТ-специфических МкАТ в экстрактах мозга крысы и экстрактах посмертного мозга человека
Научная новизна В работе получены новые гибридомные клеточные линии, продуцирующие МкАТ к С-концу СЕРТ (фрагменту 597-630), а также два новых поликлональных кроличьих антитела к участкам 69-83 и 86-100 в N-концевой части и ТМД1 молекулы транспортера, соответственно Впервые проведен систематический анализ СЕРТ в тромбоцитах человека методом иммуноблоттинга с использованием панели сайт-специфических антител к С-и N- концевым участкам молекулы транспортера В результате этого анализа впервые были выявлены восемь СЕРТ-иммунореактивных белков с различной молекулярной массой (14, 22, 32, 35, 37, 56, 68 и ~ 150-200) С помощью МкАТ к С-концу СЕРТ впервые выявлены низкомолекулярные формы СЕРТ (35-37 кДа) в экстрактах ткани мозга крысы и посмертного мозга человека Полученные в работе результаты позволили высказать предположение, что молекула СЕРТ подвергается в тромбоцитах и клетках мозга эндопротеолизу с образованием нескольких полипептидов
Научно-практическая значимость работы Полученные в работе антитела могут быть широко использованы в научных исследованиях для анализа СЕРТ в различных клетках и тканях человека и млекопитающих с помощью иммуноботганга и других иммунохимических методов Полученные свидетельства о возможном существовании укороченных форм СЕРТ может представлять большой интерес для нейробиологических исследований и фармакологических разработок В работе разработаны ряд методических приемов, которые позволяют повысить эффективность анализа СЕРТ с помощью иммуноблоттинга
Апробация работы Результаты, представленные в диссертации были доложены на межлабораторном семинаре НЦПЗ РАМН и на семинаре лаборатории нейрохимических механизмов условного рефлекса Института ВНД и НФ РАН, в июне 2005года,на конференции по биологической психиатрии в Вене,Австрия По материалам диссертации опубликовано четыре работы
Структура и объем работы Диссертация состоит из следующих разделов введения, обзора литературы, посвященного анализу данных, касающихся структуры, регуляции и функции СЕРТ, в том числе, полученных с помощью иммунохимических методов, экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов исследования и его результатов, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 153 источника Общий объем работы составляет 130 страниц, включая 21 рисунок и 1 таблицу.
