Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 15
2.1. Общие представления о биспецифических антителах 15
2.1.1. История создания биспецифических антител и области их применения 15
2.1.2. Способы получения биспецифических моноклональных антител 18
2.1.3. Тестирование биспецифических моноклональных антител 21
2.1.4. Рекомбинация легких и тяжелых цепей антител в тетрадомах 22
2.1.5. Антигенсвязывающие свойства биспецифических моноклональных антител 26
2.1.6. Применение биспецифических моноклональных антител в твердофазных методах 3 О
2.2. Принцип работы и устройство биосенсора lAsys 34
3. Приложение 40
3.1. Теоретические основы анализа связывания антител с антигеном 40
3.1.1. Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе 41
3.1.2. Анализ равновесного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе 43
3.1.3. Модель бивалентного связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе 44
3.1.4. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Kass) в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном 47
3.1.5. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений параметров кривых связывания антител с иммобилизованным антигеном 48
3.1.6. Соотношение бивалентно и моновалентно связанных антител 49
3.1.7. Кинетический анализ связывания антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе 49
3.1.8. Использование бивалентной модели для предсказания теоретически ожидаемых изменений наблюдаемых кинетических констант в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном 51
3.2. Заключение 51
4. Экспериментальная часть 53
4.1. Реагенты и оборудование 53
4.2. Методы исследований 54
4.2.1. Клеточные линии 54
4.2.2. Приготовление аффинных носителей 55
4.2.3. Аффинная очистка моноспецифических антител 56
4.2.4. Аффинная очистка биспецифических антител 56
4.2.5. Определение концентрации белка 58
4.2.6. Определение антипероксидазной активности антител 58
4.2.7. Определение антигенсвязывающей активности антител 59
4.2.8. Определение активности биспецифических антител иммуноферментным методом с двумя антигенами 60
4.2.9. Анализ связывания антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами иммуно ферментным методом 61
4.2.10. Приготовление антител, меченых п\ и их очистка 61
4.2.11. Определение концентрации меченых I антител после аффинной очистки 62
4.2.12. Анализ связывания I-меченых антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе 62
4.2.13. Анализ связывания и определение наблюдаемой равновесной константы ассоциации антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами радиоиммунологическим методом 63
4.2.14. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствие додецилсульфата натрия 64 4.3. Анализ связывания антител с иммобилизованным антигеном с помощью биосенсора IAsys 66
4.3.1. Иммобилизация антигенов (HRP и hlgGl) на поверхность CDM кюветы биосенсора IAsys 67
4.3.2. Тестирование условий распада иммунологического комплекса 71
4.3.3. Кинетика взаимодействия антител с иммобилизованными HRP и hlgGl 71
4.3.4. Обработка, преобразование и анализ кинетических кривых, получаемых с помощью биосенсора IAsys 74
5. Результаты и их обсуждение 78
5.1. Изучение связывания родительских и бнспецифических антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами иммуноферментным методом 79
5.2. Изучение связывания антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами радиоиммунологическим методом 90
5.3. Анализ параметров связывания антител с иммобилизованными антигенами с помощью оптического биосенсора lAsys 100
Выводы 114
Список литературы 117
Благодарности 131
- История создания биспецифических антител и области их применения
- Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе
- Аффинная очистка биспецифических антител
- Изучение связывания родительских и бнспецифических антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами иммуноферментным методом
Введение к работе
Гибридомная технология, наряду с обычными моноклональными антителами (МКА), позволяет получать биспецифические моноклональные антитела (БИАТ), конструируемые методами клеточной инженерии [2, 3]. Достоинство этого метода заключается в возможности получать совершенно однородные молекулы БИАТ, сохраняющие структуру «полумолекул» родительских антител ().
Актуальность проблемы. БИАТ могут служить «мостиком» между антигеном и маркерной молекулой (например, ферментом). Именно поэтому многие исследователи считают их конъюгатами нового поколения, поскольку теперь нет необходимости метить МКА [4-7]. Большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в твердофазных системах [8-16]. Вместе с тем, отсутствуют работы, в которых теоретически и экспериментально сравнивались бы свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованным антигеном. Исследование вопроса о связывании БИАТ с иммобилизованным антигеном не только имеет большое значение для использования этого класса биомолекул, но и представляет определенный интерес с точки зрения изучения взаимодействия МКА с иммобилизованными антигенами.
При использовании МКА в иммуногистохимии, иммуноблоттинге, иммуноферментном анализе (ИФА) и других твердофазных системах необходима количественная оценка процесса связывания антител с иммобилизованным антигеном. Для характеристики связывания МКА особенное значение имеют две величины: аффинность, характеризующая степень сродства антитела к данному эпитопу антигена, и авидность, или общая мера стабильности комплекса антиген-антитело. Различие между аффинностью и авидностью может быть обусловлено способностью антител (например, класса IgG) бивалентно взаимодействовать с иммобилизованным антигеном. За счет бивалентного связывания происходит значительное возрастание эффективности связывания антител с антигеном на твердой фазе [17-28].
Из-за стерических факторов не все антитела способны связываться с иммобилизованным антигеном бивалентно. Наличие бивалентного связывания антител с иммобилизованным антигеном необходимо доказывать не только для каждой пары антитело—антиген, но и для каждого клона антител к данному антигену [21].
С другой стороны, бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеном можно изучать путем сравнения констант связывания антител в растворе и на твердой фазе [32]. При этом константа связывания антител в растворе служит в качестве инструмента для количественной оценки аффинности. Однако, иммобилизация антигена на твердой фазе (например, на поверхности иммунного планшета) часто приводит к частичному изменению конформационной структуры белка, изменяющей его антигенсвязывающие свойства [33, 34]. Таким образом, аффинность антител, измеряемая в растворе, не является истинной для экспериментов, в которых антитела связываются с иммобилизованным антигеном. На наш взгляд, идеальной моделью для оценки аффинности моновалентного связывания могут служить БИАТ. Структура «полумолекул» БИАТ тождественна структуре «полумолекул» нативных родительских антител (рис. 1). И за исключением одного из вариабельных участков и первичная, и третичная структура БИАТ совпадает со структурой нативных родительских антител (в том случае, когда обе «полумолекулы» БИАТ относятся к одному подклассу IgG) [2, 3, 35, 36].
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось количественное изучение взаимодействия родительских моноклональных и биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1) Получить аффинно-очищенные моноклональные и образованные отних биспецифические моноклональные антитела. В качестве антигенов были выбраны следующие протеины: пероксидаза хрена (HRP), человека (Мб) и иммуноглобулин G человека (hlgG).
2) Теоретически рассмотреть равновесные и кинетические закономерности взаимодействия обычных моноклональных антител и образованных от них биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами различной структуры.
3) Экспериментально изучить характер и определить количественные характеристики иммунохимического взаимодействия с различными иммобилизованными антигенами, на примере трех клонов обычных антител: антимиоглобиновых (анти-Мб), антипероксидазных (анти-HRP) и антител против IgG человека (анти-hlgG); и двух клонов образованных от них биспецифических антител (биспецифические антитела, несущие сайты связывания с миоглобином и пероксидазой хрена (анти-Мб/HRP), и биспецифические антитела, несущие сайты связывания с IgG человека и пероксидазой хрена (анти-hIgG/HRP)). Провести сравнение с использованием иммуноферментного, радиоиммунологического методов и с помощью оптического биосенсора, основанного на принципе «резонансное зеркало» (IAsys). Соотнести результаты, полученные тремя методами.
4) Апробировать иммунохимическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания родительских моноклональных антител и биспецифических моноклинальных антител, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). В качестве инструмента для оценки аффинности моно валентного связывания использовать биспецифических моноклинальные антитела.
5) Определить условия бивалентного связывания биспецифических моноклональных антител с различными антигенами одновременно иммобилизованными на твердой фазе.
Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. В результате проведенного исследования впервые теоретически и экспериментально были сравнены свойства БИАТ и обычных МКА при связывании с иммобилизованными антигенами. Изучение этого вопроса имеет большое значение для использования БИАТ в различных твердофазных системах. Экспериментально эффективность связывания БИАТ с иммобилизованными антигенами в сравнении с родительскими антителами изучалась ранее только одной группой исследователей [37], к сожалению, их результаты не интерпретируются существующей теорией.
Впервые апробирована иммунологическая модель, предполагающая сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ, для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентного или бивалентного). Теперь для внедрения новых методов исследования предлагается использовать именно эту иммунологическую модель. В то время как обычно используют иммунологическую модель, предполагающую сравнительный анализ связывания антител и их F(ab) фрагментов с иммобилизованным антигеном [29, 30].
Также впервые с помощью иммуноферментного метода показано наличие бивалентного связывания БИАТ с двумя антигенами, одновременно адсорбированными на твердой фазе. Важный методический аспект имеет сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ с иммобилизованным антигеном с помощью современного оптического биосенсора lAsys, основанного на принципе «резонансное зеркало» [29, 38-46]. Это метод нового поколения, который в настоящее время начинает активно использоваться для количественной оценки иммунохимических взаимодействий.
История создания биспецифических антител и области их применения
Биспецифические антитела, то есть антитела, способные связывать одновременно два различных антигена, были впервые получены химическим путем в 1961 году Нисоновым и Риверсом [47]. С этой целью были выделены Fab фрагменты от поликлональных кроличьих антител к двум антигенам различной специфичности. Fab фрагменты смешивали в эквимолярных количествах и окисляли сульфгидрильные группы. Дальнейший анализ подтвердил, что среди образовавшихся F(ab)2 фрагментов антител присутствуют биспецифические, то есть способные связывать одновременно два антигена. Поликлональные биспецифические антитела представляют собой разнородную смесь биспецифических антител с разными антигенсвязывающими характеристиками, что не всегда удобно при их использовании. По этой причине поликлональные биспецифические антитела не нашли широкого применения.
В настоящее время существует три основных способа получения биспецифических антител. Первый способ является продолжением химического подхода, предложенного Нисоновым и Риверсом, и предполагает фрагментирование поликлональных, а в современном варианте моноклональных антител различной специфичности и ковалентное связывание фрагментов разных антител для получения биспецифических молекул. Близок к этому подход, связанный с получением так называемых гетероконъюгатов - ковалентно сшитых нативных молекул двух различных МКА [48].
Второй способ получения биспецифических антител использует методы генной инженерии. Это направление разрабатывается с 1989 года, когда были описаны антитела одного домена [49]. Антитела, полученные генно-инженерным способом, представляют собой клонированные в E.coli вариабельные области L и Н цепей молекул иммуноглобулинов, полученных из лимфоцитов или гибридом с известной специфичностью. Биспецифические антитела могут быть получены из антител одного домена путем химической модификации с помощью S-—S связей или путем нековалентных междоменных взаимодействий [50, 51]. Для увеличения авидности антител предложены методики, которые позволяют получать мультивалентные БИАТ [52-59].
Третий способ базируется на гибридомной технологии и предполагает получение гибридных гибридом, тетрадом и триом (тридом). Для получения тетрадом сливают две гибридомы, продуцирующие различные МКА подклассов IgG, а для получения триом - иммунные лимфоциты селезенки и гибридому, также продуцирующую антитела подкласса IgG. В тетрадомах и триомах наряду с родительскими могут образовываться биспецифические антитела, которые образованы двумя половинками родительских антител. Первые БИАТ к соматостатину и пероксидазе хрена были получены Милынтейном и Куэлло в 1983 году [2]. Важно отметить, что только моноклональные биспецифические антитела, полученные гибридомным способом, сохраняют нативную структуру молекулы иммуноглобулина (речь идет как о третичной структуре молекул, так и о первичной структуре их константных частей), поэтому такие молекулы антител могут участвовать во всех реакциях, присущих природным иммуноглобулинам.
На сегодняшний день биспецифические антитела находят все большее применение в сферах, где ранее использовали модифицированные МКА: в иммуногистохимии, иммуноферментном анализе, в иммунорадиодиагностике и иммунорадиотерапии, в транспорте токсических агентов к опухолевым клеткам. Так, в иммуноцитохимических н в иммуно ферментных тестах БИАТ, у которых один антигенсвязываюший сайт связывается с тестируемым антигеном, а второй - с ферментом, дают возможность избежать химической сшивки антител с ферментом и проводить анализ в один этап [2-7].
БИАТ используются как молекулы-транспортеры токсических агентов к злокачественным клеткам-мишеням. У таких антител один антигенсвязываюший сайт ассоциируется с токсином, убивающим клетки, а второй - со специфическим антигеном поверхности злокачественной клетки [12, 14 ,15]. При использовании биспецифических антител в качестве транспортеров биологически активных молекул к клеткам-мишеням не обязательно комбинировать антитела и специфический агент перед введением в организм. Вначале вводят БИАТ, которые избирательно накапливаются на клетках-мишенях, а затем, через некоторое время - химиотерапевтический агент. Это позволяет уменьшить дозу вводимого лекарства без снижения терапевтического эффекта и снизить вероятность повреждения нормальных тканей [12, 14, 60].
Моноклональные антитела к опухолевым антигенам, меченые радиоактивными изотопами, являются подходящим инструментом для выявления (радиоиммунодиагностика) и лечения (радиоиммунотерапия) некоторых опухолей [12, 14, 60]. Введенные в организм радиоактивные антитела локализуются на опухолевых клетках, что можно выявить специальными сканирующими устройствами, регистрирующими радиоактивное излучение. Для локализации опухолей вместо меченых МКА было предложено использовать БИАТ, у которых один сайт связывается с антигеном поверхности опухолевой клетки, а второй сайт -с хелатирующими агентами (например, ЭДТА), которые образуют прочные комплексы с радиоактивными ионами металлов ( In). Реарданом с соавторами [61] были получены МКА к ЭДТА, которые эффективно связывают не только хелатирующий агент, но и радиоактивный комплекс In-ЭДТА. Использование БИАТ для локализации и терапии опухолей имеет то преимущество, что позволяет существенно уменьшить количество радиоактивного агента.
Научный и практический интерес представляет также возможность использования БИАТ к нейроспецифическим белкам в качестве вектора для доставки в мозг определенных маркеров или лекарственных препаратов. С этой целью используются БИАТ, у которых один антигенсвязывающий сайт связывается с существующим мозговым белком-транспортером, а второй сайт - с транспортируемым лигандом. Таким образом, белок-транспортер осуществляет транспорт комплекса БИАТ-лиганд. Этот подход позволяет преодолеть гемато-энцефалический барьер соединениям, для которых он в норме не проницаем [62]
Анализ равновесного связывания антител с антигеном в растворе
Анализируя чувствительность тест-систем, в которых активность БИАТ как меченых молекул сравнивается с активностью меченых антител - конъюгатов, авторы утверждают, что чувствительность тест систем с БИАТ не ниже (а в некоторых случаях выше), чем при использовании конъюгатов [10]. Однако, обращает на себя внимание следующее обстоятельство, в большинстве работ используется конъюгат, в котором молекула антитела связана с одной молекулой фермента [8-11]. Вместе с тем, существующие методы конъюгации фермента с антителами (например, периодатный метод сшивки пероксидазы с антителами [95]) предполагают метку молекулы антител более чем одним молем пероксидазы. В то время как молекула БИАТ может связаться (при условии существенного молярного избытка фермента) не более чем с одной молекулой фермента. Несомненно, БИАТ, несущие сайт связывания с ферментом, могут исполнять роль меченых антител при идентификации антигена на твердой фазе. Весь вопрос в том, насколько БИАТ более (или менее) эффективны как меченые молекулы. На наш взгляд, вопрос о высокой эффективности БИАТ, как меченых молекул, является весьма спорным; для решения этого вопроса требуются дополнительные исследования.
К сожалению использование биспецифических антител в коммерческих целях пока ограничено, потому что существующие в США патенты запрещают это до 2008 года.
Биосенсор lAsys, фирмы Fisons Applied Sensor Technology (FAST, UK), позволяет следить за процессами взаимодействия антиген-антитело на границе раздела фаз, непосредственно в то время, когда они происходят (в реальном времени), без использования меченых реагентов [38-45]. Использованный в нашей работе биосенсор IAsys находится в Институте биомедицинской химии (Москва).
Чтобы понять принцип действия биосенсора IAsys, надо знать о том, что такое полное внутреннее отражение, затухающая волна, расщепление света при полном внутреннем отражении, волновод и интерференция. Когда границу между двумя слоями с разными индексами преломления освещают монохроматическим светом под случайным углом большим, чем угол полного внутреннего отражения, весь свет отражается от этой границы (рис. 5). Световое поле при этом не прерывается мгновенно, и часть светового поля, перед тем как отразится, проникает в слой с более низким индексом преломления (П2 из рис. 5), возникает экспоненциально затухающее поле. Если за слоем с низким индексом преломления на достаточно близком расстоянии находится слой с высоким индексом преломления (п3 из рис. 5), происходит расщепление световой волны, падающей под углом большим, чем угол полного внутреннего отражения. Часть света отражается от слоя с низким индексом преломления, а часть света попадает в слой с высоким индексом преломления. Если слой с высоким индексом преломления ограничен с двух сторон слоями с низкими индексами преломления, возникает волновод (п3 из рис. 5). Световая волна, падающая под углом большим, чем угол полного внутреннего отражения, начинает распространяться по волноводу. При отражении у световой волны изменяется фаза. Если изменение фазы кратно 2к, то происходит интерференция. Фаза световой волны в волноводе зависит от индексов преломления трех слоев, толщины волновода и угла падения. Если волновод достаточно тонкий, то возникновение интерференции возможно только при одном определенном угле от угла полного внутреннего отражения до прямого угла. Этот угол в биосенсоре IAsys называется «резонансным». Световая волна покидает волновод точно таким путем, каким она в него попала. Световая волна, попавшая в волновод, и отраженная световая волна различаются по поляризации, поэтому их можно разделить с помощью поляризаторов, при этом длина волны монохроматического света, индексы преломления и толщина слоев подбираются таким образом, чтобы максимизировать сигнал. Детектируется только волна, попавшая в волновод, и мы можем измерять интенсивность света как функцию угла падения. За короткое время, равное ОД с, лазер проходит весь спектр углов от угла полного внутреннего отражения до прямого угла, и в пределах ОД с мы имеем одно определенное значение «резонансного» угла. Таким образом, мы получаем измерительную систему, в которой при изменении индекса преломления поверхностного слоя (п4) пропорционально изменяется «резонансный» угол. А если изменение индекса преломления является результатом пропорционального изменения концентрации белка в поверхностном слое, мы получаем биосенсор. В конечном итоге прибор измеряет кинетику белок-белковых взаимодействий на границе раздела фаз, путем построения зависимости «резонансного» угла от времени. Угол при этом измеряется в секундах (в одном градусе 60 минут, в одной минуте 60 секунд). Теперь понятно, почему принцип действия биосенсора IAsys называется «резонансное зеркало», ведь весь свет отражается от поверхности биосенсора, а при определенном угле всегда возникает «резонанс». Диапазон изменения «резонансного» угла составляет 10 градусов.
Аффинная очистка биспецифических антител
Концентрацию очищенного раствора миоглобина, очищенных антител и пероксидазы хрена определяли спектроф ото метрическим методом. Полагали, что при концентрации Мб 10 мг/мл Ашим и Атвм И,2 [102]; при концентрации очищенных антител 10 мг/мл Ажим 4 [Ю2]. Для 1%-ного раствора очищенной HRP м=22,75 и ЛЇш=7 3 С103] 4.2.6. Определение аптипероксидазной активности антител
Первый метод. Стрипы иммунных планшетов (Госниимедполимер, Россия) насыщали HRP в течение ночи при комнатной температуре (10 мкг/мл в 0,05 М карбонатном буфере, рН 9,5; 100 мкл раствора на лунку). Готовили разведения антител в концентрациях: 1 - 5000 нг/мл. Антитела растворяли в ИФА-буфере. После 4 - 5 отмывок дистиллированной водой планшеты последовательно инкубировали при 37С с разведениями антител (3 часа, 100 мкл на лунку), антимышиными овечьими антителами, мечеными биотином (Sigma, 0,7 мкг/мл в ИФА-буфере, 100 мкл на лунку, 1 час) и авидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Sigma, 0,5 мкг/мл в ИФА-буфере, 100 мкл на лунку, 1 час). Цветную реакцию проводили с гексагидратом п-нитро фенил фосфата натрия. Гексагидрат п-нитрофенилфосфата натрия (1 мг/мл) растворяли в 9,7% диэтаноламиновом буфере, с 0,01% MgCl3, рН 9,8. Буфер доводили до рН 9,8 с помощью Ш НС1. Инкубация (100 мкл на лунку) продолжалась 30 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2М NaOH (50 мкл на лунку). Поглощение регистрировали спектрофотометрически при 405 нм.
В используемых нами антимышиных овечьих антителах, меченых биотином, была фракция, которая связывалась также с иммуноглобулином G человека (перекрестное антивидовое связывание). Для устранения этой фракции антимышиные овечьи антитела, меченые биотином, аффинно очищались на hIgG-сефарозе. Во всех экспериментах со всеми антигенами (Мб, HRP и MgG) использовалась только та фракция антнмышиных овечьих антител, меченых биотином, которая не связывалась с hIgG-сефарозой.
Второй метод. Второй метод тестирования антипероксидазной активности антител основан на том, что связывание с антителами клона 36F9 не влияет на активность фермента. Стрипы иммунных планшетов насыщали аффинно-очищенными антителами кролика против IgG мыши (10 мкг/мл в ОД М карбонатном буфере рН 9,5; 100 мкл на лунку) в течение ночи при комнатной температуре. Далее планшеты инкубировали 2,5 часа с разведениями антипероксидазных антител (1 -1000 нг/мл, 100 мкл на лунку) в присутствии пероксидазы хрена (5 мкг/мл). Антитела и пероксидазу растворяли в ИФА-буфере. После каждой инкубации планшеты промывали 4 - 5 раз дистиллированной водой. Ферментативную реакцию проводили 30 минут при комнатной температуре, используя в качестве субстрата о-фенилендиамин (ОФД), 1 мг/мл в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере рН=5, в присутствии 0,03% Нг02, (100 мкл раствора на лунку). Реакцию останавливали добавлением в лунки 50 мкл 1,5 М H2SO4. Планшеты сканировали при длине волны 492 нм.
Определение антигенсвязывающей активности антител Антигенсвязывающую активность антител определяли двумя методами. Первый метод совпадает с первым методом определения антипероксидазной активности антител (раздел 4.2.6). Только стрипы иммунных планшетов насыщали не только HRP, но и Мб, и hlgGl, в течение ночи при комнатной температуре (10 мкг/мл в 0,05 М карбонатном буфере, рН 9,5; 100 мкл раствора на лунку). Второй метод заключается в следующем. При определении антигенсвязывающей активности антител иммунные планшеты насыщали антигеном (миоглобином или hlgGl) в течение ночи при комнатной температуре (2 - 10 мкг/мл в 0,05 М карбонатном буфере рН 9,5; 100 мкл раствора на лунку). Далее планшеты инкубировали с разведениями тестируемых антител в концентрации 0,1 - 1000 нг/мл (100 мкл/лунку, 2,5 часа, 37) и, после четырех-пятикратной отмывки, с аффинно-очищенными кроличьими антимышиными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение конъюгата 1:30000, 100 мкл на лунку, 1 час, 37), предоставленными Смирновой М.Б. (лаборатория нейроиммунологии ИВНД и НФ РАН). Антитела и конъюгат растворяли в ИФА-буфере. Ферментативную реакцию с ОФД проводили, как описано выше (раздел 4.2.6).
В используемых нами аффинно-очищенных кроличьих антимышиных антителах, была фракция, которая связывалась также с hlgG (перекрестное антивидовое связывание). Дня устранения этой фракции аффинно-очищенные кроличьи антимышиные антитела аффинно очищались на hlgG-сефарозе. Для получения конъюгата аффинно-очищенных кроличьих антимышиных антител с пероксидазой хрена использовалась только та фракция кроличьих антимышиных антител, которая не связывалась с hlgG-сефарозой.
Для определения способности биспецифических антител связывать одновременно два антигена (один из которых пероксидаза) иммунные планшеты насыщали антигеном (миоглобином или hlgGl) как описано выше (раздел 4.2.6). После отмывки в лунки планшетов добавляли 50 мкл раствора разведений БИАТ (0,1 - 1000 нг/мл) и 50 мкл раствора пероксидазы (5 мкг/мл). Антитела и пероксидазу растворяли в ИФА-буфере. Планшеты инкубировали 2,5 часа при 37С, и после отмывки проводили ферментативную реакцию с ОФД как описано выше (раздел 4.2.6).
Изучение связывания родительских и бнспецифических антител с адсорбированными на твердой фазе антигенами иммуноферментным методом
В случае hlgGl, адсорбированного на твердой фазе (рис. 19 б), Kass родительских МКА в 2.3 раза выше, чем Kass анти-hIgG сайта БИАТ (табл. 4). Соотношение Kass МКА и БИАТ в данном случае подтверждает вывод, сделанный на основе сравнения кривых связывания, об отсутствии бивалентного связывания родительских МКА с иммобилизованным hlgGl. Действительно, теоретически, при отсутствии бивалентного связывания Kass для родительских МКА должна быть в 2 раза больше, чем К для БИАТ (раздел 3.1.4). Различие между теоретической и экспериментальной величинами Казз лежит в пределах погрешности определения наблюдаемой равновесной константы ассоциации РИА.
Молекула hlgGl - это молекула димер, которая включает две идентичных субъединицы (рис. 1). Теоретически молекулы димеры могут образовывать с антителами циклические комплексы, подобные тем, что изображены на рисунке 6 (раздел 3.1.1). При этом авидность антител увеличивается более чем на порядок [97]. Однако в случае hlgGl предположение о циклах не подтверждается, поскольку родительские моноклональные антитела (анти-hIgG) и тождественный сайт БИАТ (анти-hIgG/HRP) демонстрируют одинаковую истинную аффинность при связывании с hlgGl (табл. 4).
В отношении иммобилизованного миоглобина данные не приводятся, так как корректных кривых Скэтчарда для антимиоглобиновых МКА и миоглобинсвязывающего сайта БИАТ получить не удалось в трех независимых экспериментах (кривые имеют слишком большой разброс точек). По-видимому, это связано с тем, что комплекс биспецифических антител (со специфичностью анти-Мб/HRP) с миоглобином более сильно диссоциирует, чем комплекс биспецифических антител с пероксидазой. Более высокая кинетическая константа диссоциация (kdiss) увеличивает разброс точек, что делает невозможным определение наблюдаемой равновесной константы ассоциации. В связи с этим заметим, что при связывании БИАТ с адсорбированной пероксидазой, кривые в координатах Скэтчарда (рис. 18 б) имеют очень низкий наклон, что увеличивает ошибку определения наблюдаемой равновесной константы ассоциации.
В последнее время большое внимание уделяется исследованиям по получению так называемых биспецифических одноцепочечных фрагментов антител, получаемых с помощью генно-инженерных методов [49-59], в том числе и эффективных поливалентных фрагментов [50-52, 55-59]. Однако пока на практике преимущество поливалентности генно-инженерных биспецифических антител в полной мере реализовать не удалось: тетрацепочечные биспецифические фрагменты связывались с антигенами намного хуже исходных МКА, вариабельная область которых была воспроизведена в одноцепочечных молекулах [52, 59]. Тем не менее, дальнейшие исследования по созданию поливалентных генно-инженерных антител являются перспективным путем для увеличения авидности биспецифических антител.
При изучении биспецифических моноклональных антител возникает закономерный вопрос. Почему раньше никто не проанализировал связывание БИАТ с иммобилизованными антигенами? Нам кажется, что дело в следующем. Для доказательства на экспериментальном уровне необходимы, МКА связывающиеся с иммобилизованным антигеном преимущественно моновалентно, МКА, связывающиеся с иммобилизованным антигеном преимущественно бивалентно, и полученные от них биспецифические антитела. Антитела, связывающиеся с иммобилизованным антигеном преимущественно моновалентно, встречаются редко [21, 24, 25], большинство МКА связываются с антигеном на твердой фазе бивалентно [17-30]. По-видимому, почти никто не получал БИАТ от родительских антител, связывающихся моновалентно.
Сравнительный анализ связывания родительских МКА и БИАТ с иммобилизованным антигеном с помощью биосенсора IAsys, основанного на принципе «резонансное зеркало», имеет важный методический аспект. На эту тему нами написана методическая статья (протокол), предварительно заказанная у нас одним из редакторов американского журнала иммунологических методов (Journal of Immunological Methods). Важным преимуществом биосенсора IAsys по сравнению с классическими методами анализа, какими являются РИА и ИФА, является возможность быстрого определения не только наблюдаемой равновесной константы ассоциации (Kass), но и наблюдаемых кинетических констант ассоциации и диссоциации (кай3 и kdjss). Биосенсор позволяет следить за иммунологическим взаимодействием на границе раздела фаз, непосредственно в то время, когда оно происходят, без использования меченых реагентов. Принцип действия IAsys заключается в следующем: поверхность биосенсора освещают лазером, при этом в поверхностном слое возникает быстро затухающее поле, позволяющее детектировать малейшие изменения массы поверхностного слоя биосенсора. Например, при иммунологической реакции антител с иммобилизованным антигеном масса поверхностного слоя увеличивается, и соответствующим образом увеличивается регистрируемый биосенсором сигнал (подробнее устройство биосенсора описано в разделе 2.2). Регистрируемым сигналом в биосенсоре является угол при котором происходит «резонанс», измеряемый в секундах (в одном градусе 60 минут, в одной минуте 60 секунд).
Анализируемая панель антител включала два типа родительских МКА (анти-HRP и анти-hIgG) и один тип, полученных от них БИАТ (анти-hIgG/HRP). В связи с высокой стоимостью CMD кювет анализ связывания антимиогяобиновых МКА и миоглобиысвязывающего сайта БИАТ с иммобилизованным антигеном не проводился. На рисунке 20 представлена суперпозиция нескольких экспериментальных кривых ассоциации антител с антигеном для 5 различных концентраций. Видно, что скорость реакции (kon) увеличивается при увеличении концентрации антител.
![Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс]](/i/i/4283/202634.png "Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс] Вечканов Евгений Михайлович")
