Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Основные классы антигенов 8
1.1.1. Природные и искусственные поливалентные антигены 8
1.1.2. Липосомальные антигены 10
1.2. Количественная характеристика иммунохими ческой реакции 16
1.2,1. Особенности взаимодействия антиген-антитело 16
1.2.2 Основные модели лиганд-рецепторного взаимодействия 17
1.2.3. Экспериментальные методы определения констант лиганд-рецепторного взаимодействия 26
1.3. Количественная характеристика диффузионных свойств липосомальных мембран 29
1.3.1. Принципы организации липидного бислоя 29
1.3.2. Конформация и движение молекул в бислое 31
1.3.3. Фазовые переходы в липидном бислое 34
1.3.4. Исследование латеральной диффузии в мембранах 38
1.4. Моделирование иммунохимических взаимодействий 41
1.4.1. Основные типы моделей взаимодействия антиген-антитело 41
1.4.2. Особенности моделирования взаимодействия антител с поливалентными корпускулярными антигенами 43
1.5. Аналитическое применение липосом 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 59
2.1, Материалы 59
2.2. Методы 60
Глава 3. Результаты и их обсуждение 69
3.1. Получение и характеристика иммунореагентов 69
3.2. Измерение равновесных и кинетических констант реакции антитело-липосомальный антиген 84
3.3. Диффузионные свойства мембран антиген-содержащих липосом 98
3.4. Влияние компонентов липидного бислоя на количественные параметры связывания липосомальных антигенов с антителами 105
3.5. Математическое моделирование взаимодействия антител с поливалентными антигенами 11 ]
3.6. Разработка метода липосомального иммуноанализа 126
Выводы 138
Список литературы 140
- Особенности взаимодействия антиген-антитело
- Особенности моделирования взаимодействия антител с поливалентными корпускулярными антигенами
- Измерение равновесных и кинетических констант реакции антитело-липосомальный антиген
- Влияние компонентов липидного бислоя на количественные параметры связывания липосомальных антигенов с антителами
Введение к работе
Количественное изучение физико-химических закономерностей реакции антител с антигенами различной природы является одной из ключевых проблем фундаментальной иммунологии. Эти сведения очень важны как для понимания иммунных взаимодействий in vivo, так и для создания иммунохимических систем детекции биологически активных соединений.
Корректное описание взаимодействия антител с поливалентными антигенами, к которым относятся олигомерные белки, вирусы, бактериальные и животные клетки, а также синтетические конъюгаты гаптен-носитель, представляет достаточно сложную задачу в связи с многостадииностью процесса и образованием большого количества комплексов разного состава. Одним из эффективных подходов для решения этой задачи является сочетание экспериментального исследования поливалентных антигенов с варьируемыми иммунохимическими свойствами и создания математических моделей, отражающих полученные закономерности.
Липосомальные частицы со встроенными в бислой антигенными группами представляются удобной и информативной экспериментальной моделью клеточной поверхности и с успехом могут использоваться для характеристики антигенных свойств животных клеток. В качестве искусственных поливалентных антигенов липосомы позволяют корректно характеризовать влияние физико-химических свойств и состава антигенов на кинетические и равновесные параметры иммунохимической реакции. При использовании липосом имеется возможность варьировать их состав, размер, структуру и экспонированность поверхностных антигенных детерминант.
Известно, что для животных клеток характерна миграция поверхностных антигенных детерминант. Важное следствие этой миграции - образование в ходе иммунохимической реакции кластеров из нескольких детерминант, активирующих многие внутриклеточные процессы. Липосомальная модель клеточной поверхности может быть использована для выявления и анализа факторов, обуславливающих индуцированную антителами агрегацию моновалентных детерминант в поливалентные комплексы.
Информация о закономерностях взаимодействия антиген-антитело на поверхности липосом представляет также интерес в связи с их использованием для направленного транспорта лекарств.
Помимо значимости липосом для фундаментальных исследований, следует отметить эффективность их применения в качестве иммуноаналитических реагентов.
Особенности структуры липосом позволяют инкапсулировать в них маркерные молекулы различной природы (флуорофоры, ферменты и др.), а антителозависимый лизис липосом приводит к выходу маркера с его последующей детекцией и определением концентрации аналита.
Вышеизложенные соображения обуславливают актуальность данной работы, целью которой явилось изучение количественных закономерностей взаимодействия .антител с низкомолекулярными антигенами, иммобилизованными на поверхности липосом.
Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач, определяющих структуру исследования:
получение и характеристика иммунохимических реагентов;
изучение влияния поверхностной плотности антигенных детерминант на равновесные и кинетические параметры взаимодействия антител с липосомальными антигенами.
изучение диффузионных свойств липосомальных антигенов;
изучение влияния состава липидного бислоя липосом на количественные характеристики связывания с антителами;
математическое моделирование взаимодействия антител с поливалентными антигенами и конкурентного связывания со свободным гаптеном;
проверка адекватности предложенных моделей;
разработка метода иммунодетекции пестицида атразина с использованием липосом.
Особенности взаимодействия антиген-антитело
Многие биохимические процессы протекают посредством образования комплексов биологически активных веществ различной природы, называемых лигандами, со специфическими рецепторами. На лиганд-рецепторном взаимодействии основаны внешняя регуляция клеточной активности, ферментативные реакции, внутриклеточный транспорт и др. Реакцию антитело-антиген можно рассматривать как частный случай реакции лигандов с макромолекулярными рецепторами. В основе иммунного взаимодействия лежат общие принципы обратимой бимолекулярной реакции, которая описывается теми же кинетическими (константы скорости ассоциации и диссоциации иммунных комплексов) и термодинамическими (равновесная константа связывания) параметрами, что и любой процесс комплексообразования. Диапазон вариантов иммунохимического взаимодействия достаточно широк. В простейшем случае взаимодействия моновалентных Fab -фрагментов моноклональных антител с моновалентным гаптеном определение равновесных и кинетических характеристик реакции не составляет труда. Однако молекулы нативных антител способны взаимодействовать с несколькими детерминантами на поверхности антигена, поскольку имеют несколько антигенсвязывающих центров (молекула IgG содержит два активных центра, a IgM -пять). Кроме того, синтезируемые в живом организме антитела гетерогенны по физико-химическим свойствам, что определяет индивидуальные различия антител в иммунной сыворотке по аффинности и специфичности. Во многих случаях эффективная константа комплексообразования оказывается недостаточной для иммунохимической характеристики поливалентных антител. Дополнительная сложность описания реакции антиген-антитело обусловлена поливалентностью антигенов и возможностью образования вследствие этого комплексов сложного состава, на аффинность которых влияет кооперативный характер взаимодействия активных центров антител. Таким образом, основными этапами количественного изучения иммунного взаимодействия являются дискриминация моделей комплексообразования и определение параметров, адекватно описывающих этот процесс
При условии избытка лиганда в процессе лиганд-рецепторного взаимодействия концентрация лиганда практически не меняется, т.е. [L] [Lo].
Решение уравнения (2.2), полученное с помощью метода варьирования постоянной или преобразований Лапласа, имеет вид:
[RL] = г[ (1 - exp(-r( [L0 ] + _,))) (2.3),
[LQ] + Kd
где Ro - начальная концентрация рецепторов Kd - равновесная константа диссоциации лиганд-рецепторных комплексов {Kd = к.//к+і).
Уравнение (2.3) называют уравнением (изотермой) Лэнгмюра.
Если представить уравнение (2.3) в виде: [RL] = А{\ - ехр(-АО), то в координатах (к; []) тангенс угла наклона прямой будет равен константе прямой реакции, а отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат, - константе обратной реакции. Для описания процесса диссоциации лиганд-рецепторных комплексов можно использовать схему:
где [RL]o - концентрация комплексов на момент вытеснения. Константа скорости диссоциации определяется по тангенсу угла наклона в полулогарифмических координатах: (In [RL]/[RL]o, t).
При концентрации лиганда, много меньшей концентрации рецептора, решение уравнения (2.2) может быть осуществлено по той же схеме:
Очевидно, этот случай совпадает со случаем избытка начальной концентрации лиганда по отношению к начальной концентрации рецептора. Если достигнуто равновесие рецепторного связывания, то уравнение (2.2) можно представить в виде: — [ ,]" — [Щ = — (2.6). Kdl oJ KdL J Щ Уравнение (2.6) называется уравнением преобразования Скэтчарда [35]. График зависимости отношения концентраций связанного и свободного лигандов от концентрации комплексов лиганд-рецептор ([RL], [RL]/[L]) является прямой линией с тангенсом угла наклона, равным равновесной константе связывания лигандов с рецептором, а начальная концентрация рецепторов соответствует точке пересечения прямой с осью абсцисс. Координаты Иди-Хофсти отличаются от координат Скэтчарда только обозначением осей - ([J?Z.]/[I], [RL]) [36]. Отклонение графика Скэтчарда от прямой линии свидетельствует о том, что лиганд-рецепторное взаимодействие происходит по более сложной схеме, чем (2.1). Рассмотрим основные варианты моделей, описывающих такие более сложные системы. Взаимодействие одного лиганда с несколькими типами центров связывания.
Особенности моделирования взаимодействия антител с поливалентными корпускулярными антигенами
Процесс взаимодействия моновалентных антител с поливалентными корпускулярными антигенами описывается обратимой бимолекулярной реакцией [143], если принять, что антигенные детерминанты имеют одинаковую структуру и связываются антителами независимо друг от друга, а агрегация иммунных комплексов отсутствует. При определенных условиях это приближение можно считать верным, но в действительности даже простейший вариант взаимодействия антител с клеточными антигенами характеризуется более сложными закономерностями по сравнению с антигенами в растворе. Это обусловлено тем, что реакции ассоциации и диссоциации антител с поверхности клетки являются диффузионно контролируемыми и зависят от многих факторов.
Поскольку молекула антитела (IgG) бивалентна, то после связывания с одной детерминантой поливалентного антигена она может провзаимодействовать свободным активным центром со второй детерминантой. Если детерминанты зафиксированы и не способны диффундировать по поверхности клетки, то образование бивалентного комплекса можно представить как внутримолекулярную циклизацию [144] (взаимодействие 1-го типа). К этому типу взаимодействий относятся реакции антител с синтетическими поливалентными антигенами, вирусами и бактериальными клетками [145-148]. Число антигенных детерминант, стерически доступных для взаимодействия со вторым активным центром антитела, определяет эффективную валентность клеточных антигенов.
Несмотря на широкую распространенность в природе поливалентных взаимодействий 1-го типа, количественная оценка увеличения сродства антител в результате бивалентного связывания оказалась возможной лишь для немногих систем. Главная трудность заключается в выборе экспериментальной модели, в которой поливалентное связывание не приводит к агрегации антигена. Данному требованию удовлетворяла изученная Haimovich и Sela [149] система бактериофаг Т4 -нейтрализующие его антитела. Экспериментально было показано существенное уменьшение нейтрализующей способности при переходе от бивалентных антител к их моновалентным производным. Отношение эффективных равновесных констант бивалентного и моновалентного взаимодействия зависит от ряда индивидуальных для каждой системы факторов: внутренней константы ассоциации активных центров и сегментарной гибкости молекул антител, распределения детерминант по поверхности антигена (расстояния между детерминантами и их ориентации). Попытки теоретического расчета увеличения коэффициента сродства предпринимались в ряде работ [105, 144], основные закономерности внутримолекулярных реакций сформулированы в фундаментальных исследованиях [150, 151]. Рассчитать соотношение констант связывания первого и второго активного центра антитела с антигенными детерминантами удалось Crothers и Metzger [144] на основании механико-статистического и структурного подхода. Данная модель основывалась на экспериментально определенных значениях «внутренней» константы ассоциации для взаимодействия моновалентного антигена с одним активным центром антитела. Предполагалось, что пространственная ориентация свободного активного центра антитела позволяет ему про взаимодействовать со второй антигенной детерминантой, причем связывание на первой и второй стадиях бивалентного взаимодействия -идентичные процессы.
Компоненты цитоплазматической мембраны животных клеток способны к поверхностной миграции, что делает возможным «перекрестную сшивку» антителом двух антигенных детерминант (взаимодействие 2-го типа). В этом случае вторая стадия поливалентного взаимодействия - бимолекулярная, и ее скорость пропорциональна поверхностной концентрации моновалентных комплексов и свободных антигенов [103, 122]. Когда антиген моновалентен, образуются только димерные комплексы, включающие одну молекулу антитела и две молекулы антигена. Если антиген би- или поливалентен, возможно образование на поверхности сложных полимерных комплексов, или «кластеров» [152, 153]. После того, как молекула антитела моновалентно связалась с клеткой, второй активный центр может либо провзаимодействовать с другой антигенной детерминантой на той же клетке, либо связать между собой две клетки, что инициирует агглютинацию.
К системам, для которых свойственна «перекрестная сшивка» антигенов, относится взаимодействие антител с антигенами на поверхности клеток крови, иммунокомпетентных и неопластических клеток [154-158]. Аналогичные модели описывают взаимодействие поливалентных антигенов со специфическими Ig рецепторами В-лимфоцитов [113, 122], связывание иммуноглобулинов в составе поливалентных иммунных комплексов с Fc-рецепторами иммуноцитов [126] и антиген-опосредованную кластеризацию комплексов IgE и их рецепторов (FceRI) [159-161]. Математические модели взаимодействия такого типа основаны на представлениях о структуре клеточной мембраны, в соответствии с которыми антигены случайным образом распределены в двумерной «липидной жидкости» и способны свободно перемещаться в плоскости ее поверхности. Простейший случай - связывание бивалентного антитела с поверхностью клеток, несущих моновалентные рецепторы (моновалентный клеточный антиген):
Измерение равновесных и кинетических констант реакции антитело-липосомальный антиген
Изучение иммунохимических свойств полученных липосомальных антигенов и определение количественных параметров реакции антиген-антитело проводилось с помощью двух вариантов конкурентного ИФА, основанных на прямом и непрямом мечении антител. Для определения времени инкубации, необходимого для достижения равновесия в системе, были получены кривые связывания свободных и иммобилизованных иммунореагентов в течение 10-150 мин (рис. 18). Оказалось, что равновесие в системе достигается в течение 60-90 мин; поэтому в дальнейших экспериментах реакционную смесь инкубировали с носителем в течение 90 мин. В первом варианте ИФА к твердой фазе с иммобилизованным антигеном добавляли раствор липосомального антигена-конкурента и раствор, содержащий фиксированное количество меченных пероксидазой поликлональных антител. После равновесной инкубации и отмывки от несвязавшихся с носителем компонентов проводилась детекция ферментативной активности иммобилизованных на твердой фазе меченых антител (рис. 19). Величина детектируемого сигнала при этом обратно пропорциональна концентрации определяемого липосомального антигена.
Во второй схеме ИФА немеченые моноклональные антитела инкубировали с антигеном, адсорбированном на твердой фазе, и липосомальным антигеном, а для выявления образующихся на носителе специфических иммунных комплексов использовали меченные пероксидазой антивидовые антитела (рис. 20).
Для подтверждения специфического характера реакции и оценки доступности липосомального антигена сравнивали связывание меченых антител со свободным атразином, его карбоксилированным производным и липосомальным атразином. Полученные конкурентные кривые свидетельствуют о высокой степени иммунного распознавания липосомального антигена (рис. 21). Эффективность связывания липосомального атразина с мечеными антителами по сравнению со свободным атразином возрастает, что может быть объяснено вкладом в иммунное распознавание мостикового участка из пяти метиленовых групп между молекулой гаптена и липидным компонентом конъюгата. Однако сравнение липосомальных антигенных препаратов и карбоксилированного производного атразина показало, что эффективность их связывания с антителами достоверно не отличалась. Это свидетельствует об отсутствии каких-либо препятствий для иммунохимического связывания, вызванных стерическими затруднениями или особенностями взаимодействий на границе раздела фаз.
Сопоставление взаимодействия липосом, различающихся по плотности антигенных детерминант (в том числе липосом, не нагруженных гаптеном), с мечеными антителами подтвердило специфический характер связывания (рис. 22). С увеличением содержания гаптена наблюдается смещение конкурентной кривой, что свидетельствует о сохранении способности включенного в мембрану атразина взаимодействовать с антителами.
Качественное подтверждение способности полученных иммунореагентов к специфическому взаимодействию позволило перейти к количественному изучению реакции антитело- поливалентный липосомальный антиген.
Для определения равновесных констант диссоциации иммунных комплексов применялся подход, разработанный Friguet и соавт. [244]. Этот метод основан на взаимодействии липосомального антигена и антител фиксированной концентрации в растворе до достижения равновесия с последующим переносом реакционной смеси на твердую фазу с иммобилизованным антигеном для детекции антител, не связавшихся с антигеном. Для того, чтобы измеренные в данных экспериментах величины соответствовали истинным константам диссоциации, необходимо соблюдение ряда условий. Время инкубации с твердой фазой и концентрации иммунореагентов должны быть подобраны таким образом, чтобы количество связавшихся с фазой меченых антител не превышало 5-10%. Это обеспечивает пренебрежимо малый уровень влияния взаимодействия с носителем на равновесие между иммунореагентами, достигнутое в растворе. В нашем случае данное требование реализовалось при концентрации иммобилизуемого конъюгата КПА-БСА или КПА-СИТ, равной 2,5 мкг/мл, концентрации моно- и поликлональных антител - 3,3 мкг/мл и 1,0 мкг/мл, соответственно, и инкубации с фазой в течение 1 ч.
Значения равновесных констант (Ко) вычислялись графическим методом. Результаты фотометрического определения продуктов ферментативной реакции были представлены в координатах Клотца (1/[Аг]; [Ат]/[АтАг]), где [Ат] и [Аг] концентрации свободных антител и антигена в реакционной смеси, [АтАг] -концентрация сформировавшихся иммунных комплексов. Тангенс угла наклона получаемого линейного графика соответствовал величине Ко В табл. 1 приведены равновесные константы диссоциации, определенные для липосом с разной нагрузкой гаптена. Как видим, увеличение содержания гаптена от 0,5 до 10 мольных % приводило к уменьшению значений Ко. Однако разница между минимальным и максимальным экспериментальными значениями Ко была существенно ниже, чем диапазон варьирования плотности антигенных детерминант (в 3 и 20 раз, соответственно).
Сравнение иммунологической активности нативных поликлональных антител и их моновалентных производных выявило двукратное уменьшение аффинности связывания в случае восстановленных антител, т.е. отсутствия поливалентных иммунных взаимодействий (рис. 23).
Представляло интерес выяснить, какой вклад вносят в наблюдаемое значение Ко константы скоростей прямой и обратной реакций коплексообразования. Поэтому следующим этапом работы было изучение одной из этих составляющих - константы скорости ассоциации.
Для измерения констант скорости ассоциации (ка) комплексов антител и липосомальных антигенов использовался метод, предложенный Hardy и соавт. [245]. Процесс ассоциации инициировался при смешивании растворов липосом ального антигена и меченых антител (нулевая точка кинетики). Далее реакционная смесь инкубировалась в течение определенных интервалов времени (от 2 до 20 мин) с последующим переносом аликвот смеси на твердую фазу с адсорбированным антигеном и детекцией антител, не связавшихся с липосомальным антигеном. Константы скорости ассоциации рассчитывались на основе кривых связывания в координатах ((АгА)/(Ао-А); t), где At, AQ и А - оптические плотности продукта ферментативной реакции, измеренные во время t, в начале кинетического процесса и по его окончании, соответственно. Константа псевдопервого порядка (k0hs) соответствует тангенсу утла наклона кривой, ка вычисляется делением к0ья на концентрацию свободного антигена.
Для определения констант скорости ассоциации проводилось несколько серий экспериментов (табл. 2).
Влияние компонентов липидного бислоя на количественные параметры связывания липосомальных антигенов с антителами
Для изучения влияния состава липидного бислоя на равновесные и кинетические
параметры взаимодействия липосомальный антиген-антитело были использованы образцы липосом, различающихся по температуре фазового перехода матричного липида. Основой для получения липосомальных антигенов служили дилаурои л фосфатиди лхолин (ДЛФХ), димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ), дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) и дистеароилфосфатидилхолин (ДСФХ), характеризующиеся температурами фазового перехода 0С, 23,5С, 41 С и 58С, соответственно. Мольное соотношение лип ид : (конъюгат атразин-ДМФЭ) в образцах липосом составляло 90:10, 97:3 и 99:1.
Определение равновесных констант диссоциации иммунных комплексов (Ко) проводили с помощью метода, описанного в п. 3.2. Результаты экспериментов представлены в табл. 5.
Полученные данные свидетельствуют о влиянии лабильности липидного бислоя на равновесные параметры иммунного взаимодействия. Поскольку инкубацию иммунореагентов проводили при 37С, фосфолипидная мембрана липосом на основе ДЛФХ и ДМФХ пребывала в жидкокристаллическом состоянии, характеризующемся высокой латеральной подвижностью молекул («жидкие» липосомы). Липидный бислой везикул, сформированных из ДПФХ и ДСФХ, в этих условиях находился в гелевой фазе («твердые» липосомы), диффузия молекул в бислое была резко ограничена, а антигенные детерминанты зафиксированы на поверхности частиц. Как и в экспериментах по измерению Ко для липосом на основе ДМФХ, описанных в п. 3.2, увеличение плотности антигенных детерминант приводило к уменьшению значений констант для образцов липосом с «жидким» бислоем. Так, для ДМФХ-липосом значения Ко составляли 1,8 х КГ8 М {нагрузка конъюгатом 10 мольных %), 3,6 х 1Q"8 М (3 %), 5,1 х 1(Г М (1 %), для ДЛФХ-липосом - 1,7 х 10 8 М, 3,9 х 10 8 М, 5,1 х 10 8 М, соответственно. Это объясняется тем, что при увеличении поверхностной плотности антигенных детерминант возрастает вероятность медленных структурных перестроек иммунных комплексов (перехода низкоаффинных моновалентных комплексов в высокоаффинные бивалентные), обуславливающих сдвиг равновесия в системе в сторону ассоциации. Так же, как и в предыдущих экспериментах, полученная зависимость не является линейной: поверхностная плотность детерминант и значение равновесной константы изменяются в 10 и 3 раза, соответственно.
Для «твердых» липосом (на основе ДПФХ и ДСФХ) зависимость Ко от нагрузки антигеном имеет иной вид. Как видно из табл. 5, в случае 10%-ного мольного содержания гаптена константы у «твердых» и «жидких» липосом отличаются незначительно. По-видимому, процесс кластеризации детерминант в этом случае не оказывает существенного влияния на реакцию с антителами по причине стерической возможности связывания двух групп гаптена одной молекулой антитела в энергетически выгодной конформации (известно, что свободная энергия молекул IgG практически не изменяется при варьировании угла между Fab-участками в интервале 90-180 градусов), В этом случае конформационно благоприятные условия для связывания с антителом обеспечиваются вне зависимости от возможности детерминант диффундировать в бислое. Для липосомальных антигенов с низким содержанием гаптена возможность формирования высокоаффинных комплексов коррелирует с возрастанием диффузионной мобильности мембраны. Так, при 3%-ной нагрузке значения Ко для «твердого» бислоя выше, чем для «жидкого» (6,4 х 10 М, 6,5 х 10" М и 3,6 х 10"8 М, 3,9 х 10"8 М, соответственно). Вклад кластеризации в специфическое связывание и последующее образование прочных комплексов в данных условиях для «жидкого» бислоя гораздо более существенен. Увеличение значений Ко для «твердого» бислоя связано с тем, что вероятность формирования бивалентных иммунных комплексов на поверхности липосом гораздо ниже (диффузия детерминант отсутствует, а расстояние между соседними молекулами гаптена велико для бивалентного связывания антител). Та же закономерность имеет место и при 1%-ном содержании гаптена, поэтому значения констант для «твердого» бислоя в случае 3%-ной и 1%-ной нагрузки близки (6,4 х 10 М, 6,5 х 10"8 М и 5,7 х 10"s М, 5,6 х 10"8 М). Однако при 1%-ной нагрузке разница между константами для «твердого» и «жидкого» бислоя менее выражена, чем при 3%-ной (5,1 х 10"8 М (ДМФХ), 5,7 х 10 М (ДСФХ) и 3,6 х 10 s М (ДМФХ), 6,4 х 10"8 М (ДСФХ)). Это может объясняться существованием определенного предела плотности детерминант, ниже которого зависимость равновесных параметров реакции антиген-антитело от образования кластеров отсутствует. Величины Ко, рассчитанные для свободного атразина, на порядок выше Ко для липосомальных антигенов, что подтверждает образование бивалентных высокоаффинных комплексов.
Определение констант скорости диссоциации иммобилизованных на носителе иммунных комплексов в присутствии липосомального антигена проводилось по методу, предложенному Бобровником и Стародубом [246, 253]. Данный подход основан на измерении динамики элюирования антител, связанных с иммобилизованным антигеном, в присутствии свободного антигена. Для этого на твердую фазу с иммобилизованным антигеном адсорбировали моноклон ал ьные антитела, а затем вносили липосомальный антиген и инкубировали в течение 1—48 ч. Благодаря обратимости реакции антиген-антитело часть антител, ранее ассоциированных с антигеном на фазе, взаимодействовала со липосомальным атразином и переходила в раствор. После окончания инкубации липосомальный антиген и связавшиеся с ним антитела удаляли и определяли количество антител в комплексах с иммобилизованным антигеном с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой.
Кинетические зависимости десорбции антител были получены при различных концентрациях липосомальных антигенов в реакционной среде. Типичные кривые диссоциации комплексов иммобилизованный атразин - моноклональные антитела представлены на рис. 28. Как видим, примерно через 40 ч после добавления ДПФХ-липосом с 10%-ной нагрузкой гаптена в системе устанавливается равновесие и кривые выходят на плато. Значения констант скорости диссоциации (kj) определяли по формуле: - оптические плотности продукта ферментативной реакции, измеренные для моментов времени t/t t2 и после достижения в системе иммунохимического равновесия, соответственно.
Как видно из экспериментальных данных, представленных в табл. 6, антителосвязывающие свойства липосомальных антигенов различного состава были принципиально сходными и не вызывали значимых изменений в эффективных кинетических константах иммунной реакции (то есть в константах, учитывающих вклад взаимодействий как на фазе, так и в растворе). Так, например, константы скорости диссоциации антител из комплексов с иммобилизованными антигенами в присутствии ДЛФХ-липосом и ДСФХ-липосом с 10%-ной нагрузкой гаптена составляли 2,1 х 10 и 2,3 х 10 сек" . Эти данные свидетельствуют о том, что константа скорости ассоциации, лимитирующая процесс моновалентного взаимодействия, не зависит от липидного состава и поверхностной плотности антигенных детерминант.
![Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс]](/i/i/4283/202634.png "Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс] Вечканов Евгений Михайлович")
