Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс] Вечканов Евгений Михайлович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы.

1.1. Бактериологические особенности Н. pylori

1.2. Роль белково-антигенных комплексов в патогенности Н. pylori. 12

1.3. Проблемы диагностики Н. pylori. 19

1.4. Микробиологические и серологические методы диагностики Н. pylon.

1.5. Методы получения моноклональных антител и их практическое использование 30

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Лабораторные животные 43

2.2. Бактериальные штаммы и антигены 43

2.3. Приготовление элективной питательной среды для выделения и культивирования Н. pylori (СЭХ) и её экспериментальная оценка 43

2.4. Культивирование штаммов Н. pylori 45

2.5. Клеточные линии позвоночных 48

2.6. Оборудование и реактивы, схема этапов работы 48

2.7. Получение гибридом 53

2.7.1 Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной сыворотки 53

2.7.2. Гибридизация клеток 53

2.7.3. Клонирование гибридом 54

2.7.4. Культивирование гибридом in vitro и in vivo 54

2.7.5. Криоконсервирование гибридом 55

2.8 Метод очистки иммуноглобулинов 56

2.9. Выделение и фракционирование белков Н. pylori. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 56

2.9.1. Подготовка и проведение электрофореза 56

2.9.2. Визуализация белковых фракций методом окрашивания геля Coomassie brilliant blue R250 58

2.10. Иммуноферментные методы 59

2.10.1. Твердофазный иммуноферментный анализ 59

2.10.2. Иммуноферментный анализ дот-блот 60

2.10.3. Метод непрямой иммунофлюоресценции моноклональных антител 61

2.10.4. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони 62

2.10.5. Конкурентный иммуноферментный анализ 64

2.11. Иммуноблоттинг 66

2.11.1. Электроперенос фракционированных белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану 67

2.11.2. Визуализация белковых фракций на фильтре 68

2.11.3. Проведение иммуноблоттинга 68

2.12. Характеристика белкового антигена методом спектрофотометрии 69

2.12.1. Элюирование белкового антигена — 69

2.12.2. Определение концентрации белка по Лоури 69

2.12.3. Исследование спектров поглощения и собственной флуоресценции белка препарата. 69

2.13. Денситометрический метод обработки результатов гель-электрофореза и используемое програмное обеспечение 71

2.14. Методы статистической обработки результатов исследования 72

Глава 3. CLASS Результаты исследования CLASS 73

3.1. Результаты культивирования бактериальных штаммов Н. pylori и иммунизации лабораторных животных 73

3.2. Исследование и оценка ростовых и элективных свойств среды (СЭХ)

-3-для выделения и культивирования Н. pylori. Характеристика полученных колоний Н. pylon.

3.3. Иммунизация 74

3.4. Получение и первичный скрининг гибридом-продуцентов МКА к белкам Н. pylori

3.5. Оценка специфической активности МКА в серолоических методах 83

3.6. Определение эпитопной направленности МКА к Н. pylori 86

3.7. Определение класса полученных иммуногобулинов 88

3.8. Получение препаративных количеств МКА, их очистка 88

3.9. Фракционирование и построение белкового профиля Н. pylori 89

3.10. Денситометрическое исследование белковых фракций Н. pylori 95

3.11. Сравнительное исследование белковых фракций Н. pylori методом иммуноблоттинга . 103

3.12. Оценка термолабильности белкового антигена Н. pylori, выявляемого МКА гибридомы В10 108

3.13. УФ спектры поглощения и флуоресценции белка. 109

3.14. Определение небелковых компонентов белковых фракций. 113

3.15. Оценка возможности использования полученных МКА в диагностике Н. pylori - инфекции. 114

3.16. Сравнительный анализ чувствительности иммунохимических методов на основе МКА и поликлональных сывороток. 117

Обсуждение результатов исследования 120

Выводы 139

Список использованной литературы 140

• Методы получения моноклональных антител и их практическое использование
• Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной сыворотки
• Денситометрический метод обработки результатов гель-электрофореза и используемое програмное обеспечение
• Сравнительное исследование белковых фракций Н. pylori методом иммуноблоттинга

Введение к работе

Актуальность исследования

Роль Н. pylori в возникновении гастродуоденальной патологии считается доказанной и подтверждённой современными исследованиями микробиологов, клиницистов и эпидемиологов. Ежегодные данные ВОЗ, свидетельствующие о стремительном расширении круга лиц, поражённых этим возбудителем, ставят проблему хеликобактериоза в один ряд с важнейшими проблемами мирового здравоохранения. Только в СНГ и России ежегодный прирост заболеваемости хроническими гастритами и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки составляет более 1 млн. случаев, из которых от 60% до 90% составляют хеликобактер-ассоциированные (Аруин Л.И., 1999). Особую значимость данной патологии придаёт официальная констатация Н. pylori как канцерогена I класса, иницирующего запуск патологических реакций, малигнизации тканей (ВОЗ., 1995).

Впервые упоминания о наличии в желудочном содержимом изогнутых и спиралевидных бактерий относятся к концу XIX-века. Однако связь между этими микроорганизмами и гастродуоденальных патологий была установлена лишь в 1983г., когда австралийские учёные Уоррен и Маршалл выделили чистую культуру этих микробов и выдвинули предположение об их влиянии на деструкцию эпителиального барьера в желудке. Долгое время господствовала версия о паразитическом образе жизни Н. pylori в желудке человека. Однако в настоящее время, господствующее положение постепенно приобретает версия о симбиотическом характере взаимоотношений человека и Н. pylori. Несмотря на допускаемые симбиотические взаимоотношения человека и Н. pylori, это микроорганизм всё же является одним из самых существенных факторов риска развития язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хронического гастрита, аденокарциномы желудка (Negrini R., Lisato L., Zanella I et al., 1991). В

связи с этим изменилось представление о методах лечения и диагностики этих заболеваний.

Разработано большое количество методов диагностики, позволяющих
выявлять и идентифицировать этот микроорганизм. Развитие и
усовершенствование этих методов помогло в получении ценной
информации об эпидемиологии хеликобактериоза, сыграло большую роль
в понимании патогенеза этой инфекции. Это, в свою очередь, позволило
разработать наиболее эффективные схемы противохеликобактерной
терапии и мероприятия, направленные на профилактику

хеликобактериоза.

Тем не менее, ни один из существующих методов диагностики
H.pylori- инфекции не универсален. Пределы возможностей этих методов
могут быть ограничены не только их чувствительностью, но, зачастую
зависят от возраста пациента, его индивидуальных особенностей, стадии
заболевания, а также индивидуальных особенностей течения инфекции.
Среди наиболее распространённых методов диагностики
хеликобактерной инфекции выделюят: бактериологический,
гистологический, уреазный тест, молекулярно-биологический (ПЦР-
исследование), серологический методы. Все перечисленные методы
имеют свои достоинства и недостатки. Из недостатков приведённых
методов можно указать следующие: инвазивность, трудоёмкость и
необходимость в специальном оборудовании для

бактериологического метода, инвазивность и квалифицированные персонал для гистологического исследования, недостаточная чувствительность для уреазного теста, трудности в интерпретации значимости положительного результата в ПЦР-исследовании.

Для выделения и культивирования хеликобактерий в исследовательской практике используются различные питательные среды. Рецепты применяемых сред известны, однако их воспроизведение в лабораторных условиях затрудняется сложностью приобретения всего

-7-перечня добавок и факторов элективности. Трудновыполнимы также жесткие требования к газовой среде культивирования, которая должна состоять из 5% кислорода, 10% углекислого газа и 85% азота. Решению этих проблем служит разработанная в Ростовском ПЧИ питательная среда для выделения и культивирования хеликобактерий элективная (СЭХ). В основу идеи создания среды заложен принцип полной комплектности препарата, гарантирующий оптимальный уровень его ростовых свойств. Оценка качества, элективных и ростовых свойств среды является важной составной частью успешной работы по выделению и наработке биомассы микроорганизма.

Среди перечисленных методов особое место занимают серологические методы исследования. Одним из таких методов является метод обнаружения Н. pylori с помощью моноклональных антител (МКА). Использование моноклональных антител, получаемых к белковым антигенам клеток Н. pylori, является оправданным вследствие неинвазивности, чувствительности и специфичности тест-системы для обнаружения этого микроорганизма у пациента на их основе. Моноклональные антитела являются сегодня наиболее эффективным инструментом, с помощью которого возможно, с одной стороны, проведение тонких исследований антигенной композиции микробной клетки, выяснение функций отдельных антигенных детерминант, с другой - повышение чувствительности и специфичности серологического анализа, создание на их основе новых, более точных и быстрых методов идентификации и дифференциации.

Выяснение биологических и иммунохимических свойств антител и распознаваемых ими антигенов является необходимым условием их последующего успешного применения в диагностических целях, и нашей задачей было изучение свойств МКА, секретируемых гибридомой В10, полученной в лаборатории «гибридом» Ростовского противочумного института.

-8-Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось характеристика белковых антигенов Н. pylori на основе моноклональных антител и определение возможности их использования для создания новой тест-системы по обнаружению данного микроорганизма. Задачи исследования.

1. Культивирование, получение колоний и наращивание биомассы микроорганизма Н. pylori.

2. Экспериментальная оценка элективной питательной среды для выделения и культивирования Н. pylori (СЭХ), полученной в Ростовском НИПЧИ.

3. Фракционирование и характеристика белковых антигенов методом электрофореза в полиакриламидном геле, денситометрии, спектрофотометрии и флуорометрии.

4. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам Н. pylori и характеристика их свойств.

5. Выявление белкового антигена Н. pylori, против которого направлены моноклональные антитела гибридом-продуцентов.

6. Выделение, очистка и характеристика препарата белкового антигена из клеток Н. pylori путём гель-электрофореза и иммуноблоттинга с использованием полученных моноклональных антител.

7. Исследование возможности использования полученных моноклональных антител в качестве основы тест-системы скрининга Н. pylori - инфекции.

8. Оценка диагностической значимости моноклональных антител в серологическом методе диагностики Н. pylori - инфекции.

Научная новизна.

В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Н. pylori. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств

-9-микроорганизма Н. pylori, обладает элективностью в отношении энтеробактерий, дрожжевой флоры и протея, позволяя четко дифференцировать колонии возбудителя хеликобактериоза от сопутствующей микрофлоры.

В результате проведённых исследований созданы гибридомы-продуценты моноклональных антител строго специфичных в отношении белковых антигенов микробных клеток Н. pylori. Показано отсутствие перекрёстной активности моноклональных антител гибридомы В10 с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с Н. pylori.

Впервые методом иммуноблоттинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10. Выявленный белковый антиген был оценен как термолабильный, с типичной белковой формой УФ абсорбционного спектра и спектра флуоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

Впервые оценена возможность применения полученных моноклональных антител гибридомы В10 для изучения антигенной структуры штаммов Н. pylori, и создания тест-системы скрининга Н. pylori - инфекции. Научно-практическая значимость работы.

В результате исследования показано, что использование среды СЭХ в практических медицинских учреждениях позволит значительно повысить эффективность исследования материала, подозрительного на обсемененность хеликобактериями.

Получена коллекция гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к белковым антигенным детерминантам Н. pylori, которая хранится в жидком азоте в библиотеке гибридом Ростовского противочумного института. Произведено депонирование гибридомы.

Характеристика моноклональных антител, продуцируемых гибридомой В10 и белков-антигенов Н. pylori, явилась необходимой основой для оценки возможности создания тест-системы скрининга Н. pylori - инфекции.

Материалы диссертации используются при чтении общего курса «Биотехнология» и спецкурса «молекулярная иммунология» на кафедре биохимии и микроюиологии Ростовского госуниверситета.

По материалам диссертации планируется создание и введение в клинико-лабораторную практику тест-системы скрининга Н. pylori -инфекции. Основные положения выносимые на защиту.

9. В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Н. pylori. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Н. pylori

10. Охарактеризован фракционный состав белков Н. pylori методами гель-электрофореза и денситометрии.

11. Получен набор стабильных гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам Н. pylori, не обладающих перекрёстной реактивностью с гетерологичными микроорганизмами. Среди полученного набора по оптимальным характеристикам отобрана для дальнейшего использования гибридная культура В10.

12. Методом иммуноблоттинга идентифицирован белковый антиген, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10. Проведено выделение данного белкового антигена. Антиген термолабилен, имеет молекулярную массу 30 ± 1 кДа, типичные белковые адсорбционные спектры и спектры флюоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

-11-5. Показана диагностическая значимость, полученных моноклональных антител гибридомыВЮ.

Апробация диссертационной работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных
конференциях биолого-почвенного факультета Ростовского

государственного университета (Ростов-на-Дону, 2003-2006), а также были представлены на 2, 3, 4 международной межвузовской конференции молодых учёных «Обмен веществ при адаптации и повреждении» Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2003-2005). Материалы диссертации апробированы на совместном заседании кафедры биохимии и микробиологии Ростовского госуниверситета и лаборатории гибридом ФГУЗ «Ростовского противочумного института» Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них две в центральной печати. Личный вклад автора 100%.

Методы получения моноклональных антител и их практическое использование

Одно из проявлений иммунной реакции, возникающей у позвоночного животного при попадании в его организм чужеродного агента, - выделение плазматическими клетками антител. Последние представляют собой молекулы иммуноглобулинов с участками -31-связывания, которые узнают форму специфических детерминант на поверхности чужеродного агента, или антигена, и связываются с ними. Каждое антитело узнает только собственный антиген, точнее, одну его детерминантную группу. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, отличающихся по структуре, степени специфичности и прочности связывания с ней. Таким образом, при введении антигена в крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител. Реакция между антителом и антигеном запускает процессы, приводящие к нейтрализации и удалению чужеродного агента. Помимо той естественной функции, которую антитела выполняют в иммунной реакции, они уже в течение долгого времени служат важным инструментом для исследователей, использующих специфичность антител для того, чтобы идентифицировать или метить молекулы и клетки, а также выделять их из смеси (В.И. Покровский, СП. Гордиенко, В.И. Литвинова., 1993).

Однако, качество поликлональной сыворотки, полученной от иммунизированного животного, обусловлено вариациями специфичности, аффинности, авидности, других признаков популяций антител, входящих в ее состав. Кроме того, стерические препятствия одного антитела взаимодействию другого с комплементарным сайтом на антигене также могут затруднять интерпретацию результатов.

Следовательно, возникает необходимость не в многокомпонентной смеси антител, а в отдельных, элементарных составляющих этой смеси, направленных лишь к одной детерминанте антигена и имеющих одни и те же характеристики.

Поскольку, каждое антитело синтезируется лишь одной определенной линией лимфоцитов, потомство одной клетки, или клон, могло бы быть источником большого количества идентичных антител к одной антигенной детерминанте - моноклональных антител (МКА). К сожалению-антителообразующие клетки не удается поддерживать в культуре (Абелев Г.И., 1998; Новохатский А.С., 1984).

Решение проблемы пришло в 1975 году, когда Келер и Мильштейн осуществили соматическую гибридизацию клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела к поверхностным антигенам эритроцитов барана. В результате они получили гибридные клетки (гибридомы), которые сохраняли способность к продукции специфических антител и одновременно - способность к непрерывной пролиферации (Домарадский И. В., 1957; Kohler G„ Milstien С, 1976).

В настоящее время получение МКА является одной из ведущих областей биотехнологии. Количество созданных гибридом превышает тысячи и постоянно растет. Благодаря своим уникальным свойствам МКА успешно используются для решения многих актуальных задач биологии и медицины: а) совершенствование или создание новых диагностических препаратов для обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний; б) разработка новых терапевтических реагентов, обеспечивающих сайт-специфическую доставку в место локализации инфекции, или пассивной иммунизации одними антителами; в) очистка антигенов или концентрирование бактерий с помощью иммуносорбентов; г) получение новых реагентов для классификации бактерий, биохимических исследований.

Было бы ошибочным считать, что МКА полностью заменят поликлональные сыворотки. Последние могут быть использованы, например, когда определяемый антиген денатурирован или изменен каким-либо другим путем. Было бы неблагоразумно использовать МКА для определения молекул у генетически различающихся видов без тщательного тестирования, гарантирующего, что эти молекулы не "ускользнули" из области специфичности МКА из-за генетического полиморфизма (Кущ А.А., Цой Л.А., Полетаев А.И., Шумай Е.П., 1985).

Поэтому выбор между поликлональными и моноклональными антителами должен определяться их свойствами, необходимыми для решения конкретных задач.

Кроме того, получение МКА является достаточно сложным, длительным и трудоемким процессом, эффективность которого зависит от целого ряда факторов. Это свидетельствует о важности методической части гибридомной технологии, которой посвящена чрезвычайно многообразная и многочисленная литература. В связи с этим представляется важным осветить основные принципы техники получения гибридом.

Основные этапы получения гибридом включают получение линий опухолевых клеток, иммунизацию доноров селезеночных клеток, слияние клеток, селекцию гибридом, определение секретируемых антител, клонирование позитивных культур и получение МКА "in vitro" и "in vivo"(pncyHOK 2).

Два главных требования при отборе опухолевого партнера:

1. Отсутствие у клеток миеломы способности к синтезу иммуноглобулинов и, таким образом, исключение возможности контаминации супернатанов, содержащих специфические антитела.

2. Дефект какого-либо определенного фермента, поддерживающего рост клеток на селективной среде in vitro (Goding J.W., 1986).

Одной из наиболее часто используемых селективных систем является ГАТ-среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин является антагонистом фолиевой кислоты. Тетрагидрофолиевая кислота является коферментом, необходимым для превращения рибонуклеотида 5-аминоимидазол-4-карбоксамида (АИКР) в рибонуклеотид формамидоимидазол-4-карбоксамида (ФАИКР) в биосинтезе пуринов и превращения дезоксимонофосфата уридина (дУМФ) в дезоксимонофосфат тимидина (дТМФ) в синтезе пиримидинов. Аминоптерин, аналог фолиевой кислоты, предотвращает образование тетрагидрофолята, конкурентно ингибируя гидрофолятредуктазу, и таким образом блокирует процессы биосинтеза как пуринов, так и пиримидинов на стадиях, указанных на схеме (рис. 3). -35 монофосфаты инозина (ИМФ), ксантина (КМФ), гуанина (ГМФ);

дезоксимонофосфаты уридина (дУМФ), тимидина (дТМФ);

дезоксидифосфаты гуанина (дГДФ), тимидина (дТДФ);

дезокситрифосфаты гуанина (дГТФ), цитидина (дЦТФ), аденина (дАТФ), тимидина (дТТФ);

тим идинкиназа (ТК);

гипоксантин-гуанин фосфорибозил трансфераза (ГГФРТ).

В клетках существуют обходные пути биосинтеза нуклеотидов, в которых происходит реутилизация гипоксантина и тимидина. Эти пути зависят от двух ферментов: тимидинкиназы (ТК), катализирующей трансформацию тимидина в дезокситимидинтрифосфат, и гипоксантин-гуанин фофорибозил трансферазы (ГГФРТ), катализирующей трансформацию гипоксантина в инозинмонофосфат и гуанина в гуанозинмонофосфат. При добавлении в среду гипоксантина и тимидина клетки могут нормально синтезировать ДНК в условиях, когда основной путь биосинтеза нуклеотидов блокирован аминоптерином. Если клетка имеет дефект по этим ферментам, то в присутствии аминоптерина она погибает, но способна выжить, если ее слить с другой клеткой, в которой эти ферменты имеются. Двойной или полной системой является такая система, когда происходит слияние двух клеток, в одной из которых отсутствует компенсация этих ферментов, и они выживают в среде ГАТ, тогда как родительские клетки погибают.

Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной сыворотки

Клонирование и реклонирование клеточных культур осуществляли методом предельного разведения (Goding, 1986). Для этого гибридомы осторожно суспендировали в 2 мл культуральной среды и определяли концентрацию жизнеспособных клеток в тесте с трипановым синим. Затем суспензию разводили так, чтобы в 1 мл содержалось 150 клеток, 1 мл суспензии доводили средой до объема 10 мл и по 100 мкл распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с фидерными клетками. В тех лунках, где образовывались моноклональные культуры (микроскопия), проверяли наличие антител. Процедуру повторяли до тех пор, пока не переставали регистрироваться антителонегативные колонии (5-7 клонирований).

После покрытия клетками 2/3 поверхности дна микролунок, их переносили в лунки объемом 2 мл. Для этого за сутки до переноса гибридом в планшеты для культивирования вносили по 50 тысяч перитонеальных макрофагов. Гибридомы аккуратно суспендировали при помощи движения поршня автоматической пипетки и переносили из каждой исходной лунки в лунку объемом 2 мл. После разрастания гибридом их переносили в планшеты с лунками объемом 5 мл, а затем в культуральные флаконы емкостью 50-100 мл. В этих сосудах ростовую среду меняли каждые 2-3 дня.

Культивирование гибридом in vivo проводили в организме беспородных мышей. За неделю до инокуляции гибридных клеток животных внутрибрюшинно обрабатывали 0,5 мл пристана (2,6,10,14etramethylpentadecane, 96%). Гибридомы вводили в количестве не менее 10 млн. клеток в 3 мл культуральной среды на мышь.

2.7.5. Криоконсервирование гибридом (И. Лефковитс, Б. Пернис, 1989) Замораживали культуры, здоровые в середине логарифмической фазы (примерно, 6-Ю5 в 1 мл). Клетки центрифугировали и ресуспендировали в смеси ледяного 5% диметилсульфоксида (ДМСО) и 95% сыворотки плода коровы в концентрации 106—107 клеток в 1 мл. По 1 мл клеточной суспензии разливали в пластиковые ампулы для замораживания и тотчас помещали в морозильник с температурой -70 С. Когда содержимое ампул замораживалось, их переносили в жидкий азот.

Для использования культуры, клетки размораживали и разводили в 10 мл гибридомной среды. В небольшой порции суспензии просчитывали клетки и проверяли их на жизнеспособность, а остальные осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в гибридомной среде в концентрации примерно 4 105 жизнеспособных клеток в 1 мл и разливали по лункам 96-луночной пластинки для микротитрования. Только что размороженные клетки выращивали при концентрации сыворотки в среде не менее 20%. После того как начинался рост, концентрацию сыворотки уменьшали до 5—10%.

Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных супернатантов гибридом, асцитических жидкостей мышей и поликлональных антисывороток осуществляли преципитацией сульфатом аммония. Для этого супернатант охлаждали до 4С и фракционировали сульфатом аммония (0,277 г/мл - 45% насыщение). Пробы с сульфатом аммония перемешивали 30 минут для осаждения иммуноглобулинов. Иммуноглобулины собирали центрифугированием при 5000 об/мин х 15 мин. Далее супернатант отбрасывали и осадок иммуноглобулинов ресуспендировали в маленьком объеме фосфатно-солевого буфера. Ресуспендированные иммуноглобулины диализовали в течение ночи против 50-100 объемов ФСБ с трехкратной сменой в течение 18-24 часов и консервировали добавлением мертиолята до конечной концентрации 0,02% (Reik et al, 1987).

Электрофорез белков в комплексе с SDS проводился в системе, предложенной Лэммли (Laemmli, 1970). Для проведения электрофореза подготавливали следующие растворы:

1. Раствор акриламид / NN -метиленбисакриламида (30.8%Т 2.7%С).

2. Разделяющий гель следующего состава: 12,5% раствор акриламид / NN -метиленбисакриламида, 375мМ рН 8,8 Tris-HCl, SDS 0,1%, PSA 0.1%, TEMED 0,08%. Причём PSA и TEMED добавляли непосредственно перед заливкой геля.

3. Концентрирующий гель следующего состава: 5% раствор Акриламид / NN -метиленбисакриламида, 375мМ рН 6,8 Tris-HCl, SDS О,1 %, PSA 0,1%, TEMED 0,08%. Причём PSA и TEMED также добавляли непосредственно перед заливкой геля.

4. Электродный буфер состава: 0,025 М Tris-HCl, 0,192 М глицин, 0,1% SDS. рН раствора доводили концентрированной НО до 8,3.

Для приготовления электрофорезного геля применялись две стеклянные пластинки - с вырезом и без выреза. Помещали стеклянную пластинку с вырезом на ровную горизонтальную поверхность и размещали по ее краям два спейсера. Сверху на спейсеры накладывали стеклянную пластинку без выреза. Осторожно перемещали стеклянные пластинки в вертикальное положение и ставили на горизонтальную поверхность. Расплавляли агар и наносили его тонким слоем на заливочном столике. Помещали зафиксированные стеклянные пластинки с находящимися между ними спейсерами на заливочный столик таким образом, чтобы расплавленный агар находился между стеклянными пластинами. После застывания агара закрепляли пластины в электрофорезной камере. Полученный раствор разделяющего геля помещали между стеклянными пластинами так, чтобы уровень не превышал 3 см от верхнего края пластин. Осторожно наслаивали на раствор разделяющего геля тонкий слой деминеразизованной воды и оставляли гель застывать (до 20 минут). Удаляли воду с поверхности застывшего разделяющего геля. Наслаивали на поверхность застывшего разделяющего геля раствор концентрирующего геля и немедленно после этого вставляли гребенку между стеклянными пластинами. Оставляли гель застывать в течение 20 минут. Добавляли электродный буфер в нижнюю и верхнюю часть электрофорезной камеры так, чтобы уровень электродного буфера на 0,5 см выше уровня геля. Осторожно удаляли гребенку и промывали лунки электродным буфером с помощью шприца. Охлаждённые до комнатной температуры образцы с помощью дозатора наносили на бэнды (лунки), образованные с помощью гребенки.

Денситометрический метод обработки результатов гель-электрофореза и используемое програмное обеспечение

Спектр поглощения, или, более корректно, абсолютный спектр поглощения вещества представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны. Спектры поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм) и видимых областях отражают переходы связанных и несвязанных электронов в молекуле. Это обычно делокализованные л-электроны двойных С=С связей и неподелённые пары азота и кислорода. Длина волны, при которой наблюдается максимальное поглощение света, обозначается через \т№ Положение максимума спектра поглощения является важной оптической характеристикой вещества, а характер и вид спектра поглощения характеризуют его качественную индивидуальность. Группа в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения, называется хромофором. Такой группой является, например, карбонильная группа С=0, существующая у всех аминокислот. Другим хромофором является пептидная группа полипептидных цепей. К основным хромофорам белка относятся остатки ароматических кислот: триптофан и в меньшей степени тирозин и фенилаланин. Спектр поглощения триптофана, обусловленный его индольным кольцом с системой сопряженных связей, обладает двумя полосами поглощения с максимумами при 220 и 280 нм.

Спектр флуоресценции соединения сдвинут в длинноволновую область по сравнению со спектром его поглощения.

При комнатной температуре большинство органических молекул находится в основном состоянии. Поглощение фотона сопровождается переходом электрона на более высокий энергетический уровень. После поглощения кванта молекула из-за теплового движения и столкновения с другими молекулами растрачивает часть энергии и переходит на самый нижний колебательный подуровень первого электронного возбужденного состояния. Испустив квант за 10 8 с молекула переходит в основное состояние; такое испускание света называется флуоресценцией

Оптическую плотность полученного белкового препарата измеряли в сканирующем режиме на спектрофотометре 8453Е Spectroscopy System (Agilent Technologies) (Б. Уильямса, К. Уилсона., 1978).

Оценивалась интенсивность и характер спектра собственной флуоресценции белка на спектрофлюориметре Флюорат-02 Панорама. Флуоресценция обусловлена присутствием в первичной структуре исследуемого белка остатков ароматических аминокислот тирозина, триптофана и фенилаланина. В кювету спектрофлуориметра помещали 3 мл исследуемого препарата белка и регистрировали спектр собственной

-70-флуоресценции при длине волны возбуждения 280 нм, с шагом 10 нм, с задержкой строба 0,05 мкс и длительностью строба 3 мкс, с усреднением 25 и минимальной чувствительностью. Полученные результаты анализировались и документировались с помощью программного обеспечения, входящего в состав спектрофотометра (Демченко А. П., 1981).

Полученное изображение электрофореграммы документировали и оцифровывали методом сканирования в отражённом свете. В дальнейшем изображение анализировали с помощью денситометрического программно-аппаратного комплекса Videodensitometr SORBFIL Ver. 1.6.0.212.

Денситометр Сорбфил предназначен для количественной оценки в тонкослойной хроматографии (ТСХ) и гель-электрофореза. Денситометр производит расчет окрашенных фракций в треках на видеоизображении пластины геля с построением электрофореграммы (аналоговой кривой) по отклонению яркости окрашенной фракции от яркости фона пластины геля и последующим количественным расчетом полученной электрофореграммы.

При расчете программа обработки исходит из положения, что размеры и яркость пятна (по отношению к фону пластины геля) зависит от количества вещества в пятне-фракции. Яркость фона определяется как среднее значение яркости фона выбранной области изображения и используется для расчета всех фракций. После разметки электрофореграммы программа денситометра производит расчёт треков. Результатом расчета является кривая изменения яркости трека по его длине - диаграмма яркости. По диаграмме яркости определяется величина яркости белковой фракции, высоты (Н) и площади (S) пиков, выраженное в

-71-процентах отношение площади каждого пика к сумме площадей всех пиков в треке (%S), выраженное в процентах отношение высоты каждого пика к сумме высот всех пиков в треке (%Н). Величины %S и %Н характеризуют содержание веществ в смеси. Расчет содержания белка во фракции основан на предположении, что белки, независимо от их строения, взятые в одинаковом количестве, дают одну и ту же площадь пика. Для определения содержания белка во фракции, находят выраженное в процентах отношение площади (высоты) каждого отдельного пика к сумме площадей (высот) всех пиков в треке. По построенному на основании стандартов калибровочному графику зависимости количество белка - площадь пика и предварительно рассчитанной площади фракции определяется количество белка во фракции.

Методы статистической обработки результатов Статистическую обработку результатов и определение необходимого объема выборки проводили по стандартным методам биометрии (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962; Лакин Г. Ф., 1980) с привлечением программных средств Statistica v. 6.0.

Сравнительное исследование белковых фракций Н. pylori методом иммуноблоттинга

Оценка полученных МКА к поверхностным антигенным детерминантам Н. pylori в качестве основы для использования их в диагностике Н. pylori - инфекции - явилось следующей задачей нашего исследования.

В настоящем исследовании использовался клинический материал от 36 пациентов, страдающих гастродуоденальной патологией. Всё пациенты были мужчинами в возрасте от 18 до 30 лет. В качестве клинического -113-материала использовались биоптаты язвенно - эррозивного поражения желудка и двенадцатиперстной кишки. Материалы поступали в лабораторию в пластиковых герметичных контейнерах. Биоптаты - в среде стерильного физраствора. Хранение и транспортировку проб производили в специальных термосах при температуре (37 ± 2)С в течение не более 3 часов, В дальнейшем каждую пробу разделяли на две части. Первую часть пробы использовали для микробиологического исследования на наличие возбудителя Н. pylori. Для этого биоптат извлекали из контейнеров, слегка подсушивали и при помощи бактериальной петли рассевали по поверхности среды СЭХ. Культивирование посевов осуществлялось в металлических анаэростатах в условиях регулируемой газовой среды. Другую часть биоптата гомогенизировали в физиологическом растворе и использовали для проведения дот-ифа с МКА гибридомы В10. Результате проведённого исследования проб пациентов на наличие возбудителя Н. pylori методом ИФА дот-блот приведены на рис, 28. №1 - №30 пробы, взятые прицельной биопсией язвенного содержимого у пациентов Военного окружного госпиталя, страдающими гастро-дуоденальной патологией. В качестве + контроля использовалась 1 млрд. взвесь бактерий Н. pylori. Источником моноклональных антител служила культуральная жидкость гибридомы В10, взятая соответственно в концентрации 1/5 и 1/50 (первое и второе пятно соответственно)Условные обозначения: + положительная реакция; - отрицательная реакция.

Как видно из результатов исследования, пробы № 1,2, 12, 14, 17, 26, 29, 34 имели положительный результат на наличие белкового антигена Н. pylori. Результаты ИФА дот-блот соотносились с результатами микробиологического исследования с помощью питательной среды СЭХ на наличие микроорганизма Н. pylori.

Из таблицы видно, пробы № 1, № 2, № 12, № 14, № 17, № 21, № 26, № 29, № 34 имеют положительный результат с использованием метода микробиологических сред. Остальные пробы имели отрицательный результат, как по результатам микробиологического исследования, так и по результатам иммунологического метода дот-блот.

Применялись методы математической статистики для подтверждения достоверности полученных результатов. Имела место альтернативная вариация при общем числе проб п=36. Уровень значимости выбирался 0,01,что соответствовало t = 2,56. Количество пациентов, с подтверждённым положительным результатом дот-ифа на наличие антигенов Н. pylori в пробе составила 8 человек, т. е. 22% от общего количества обследованных пациентов (р = рДп = 8\36 = 0,22). Количество пациентов с подтверждённым положительным результатом микробиологического исследования на наличие бактериальных клеток Н. pylori в пробах составила 9 пациентов, из них 8 пациентов, с подтверждёнными результатами дот-ифа. Таким образом, микробиологическое исследование подтвердило наличие микроорганизма во всех случаях положительного результата дот-ифа. Исходя из значения t-критерия при выбранном уровне значимости полученные данные достоверны. Статистическая ошибка составила Sn = р{\-р)\п = 0,069.

Похожие диссертации на Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс]

Изучение количественных закономерностей взаимодействия антител с низкомолекулярными антигенами, иммобилизованными на поверхности липосом Гендриксон Ольга Дмитриевна

Создание стерически стабилизированной иммунолипосомальной системы на основе моноклональных антител с целью специфической доставки биологически активных веществ к клеткам-мишенямЯглова Наталья Валентиновна

Иммунотоксины, полученные на основе моно- и поликлональных антител и А-цепи рицина Тоневицкий Александр Григорьевич

Получение моноклональных антител и изучение структурно-функциональных свойств энтеротоксина В St. aureusШемчукова, Ольга Борисовна

Получение и изучение рекомбинантных Fab''-фрагментов антител к афлатоксинамКалиниченко Артем Андреевич

Получение моноклональных антител к коллагенам человека и их использование в иммуноферментных тест-системах для изучения обмена коллагеновСимова, Людмила Петрова

Изучение фолдинга и конформационных изменений продукта гена 9 бактериофага Т4 с помощью моноклональных антителЖемаева Любовь Вячеславовна

Изучение О-антигена холерного вибриона и биохимические аспекты снижения его токсичностиГромова, Ольга Викторовна

Изучение влияния структуры меченных флуорохромами антигенов на их взаимодействие с антителами и разработка методов иммуноанализа пестицидов, сурфактантов и полиароматических углеводородов для контроля окружающей среды и продуктов питанияЛобанова Анна Юрьевна

Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностьюГладилина Юлия Алексеевна