Введение к работе
Актуальность темы.
Гипоксически-ишемическое поражение головного мозга в перинатальном периоде (ГИППГМ) является одной из основных причин смертности новорожденных, а также развития тяжелой патологии ЦНС с исходом в инвалидизацию [БарапшевЮ Л, 2000; AlminiR. etal, 2000; Volpe J. etal, 2000].
Несмотря на интенсивные исследования в этой области, надежных средств . лечения последствий ГИППГМ практически нет, поскольку патогенез хронгоации нейродегенеративного процесса, являющегося определяющим моментом для течения и исходов ГИППГМ, во многом не известен. В качестве достаточно продуктивной рассматривается гипотеза о включении аутоиммунных механизмов в патологический процесс вслед за первичным повреждением нервной ткани при ряде заболеваний (опухоли, болезнь Паркинсона, травма мозга) [Чехонин и соавт., 2000; Ганнушкина ИВ., 2003]. В связи с этим, в последние десятилетия отмечен возрастающий интерес к нейроспецифическим белкам (НСБ), как к сывороточным маркерам патологических процессов и травм головного мозга, в которых определенное место отводится нарушению резистентности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [ButtnerT. etal., 1997; EngL.Fetal.,2000; NagdymanN. etal., 2001; Nedelcu J. etal., 1999]. Это также актуально и в связи тем, что клиническое и инструментальное обследование не всегда дают возможность достоверно верифицировать дегенерацию нервных клеток в ткани головного мозга у детей с ГИППГМ, что существенно затрудняет адекватную оценку состояния больного и прогноз.
Для исследования нейродегенеративного процесса и. проницаемости ГЭБ в направлении мозг-кровь широко применяется иммуноферментный анализ нейрос-пецифических антигенов (Чехонин BJL и соавт., 2000; Дмитриева Т.Б., 2003; Eiig L.F et al., 2000]. Одними из наиболее изученными среди них являются глиофибрил-лярный кислый протеин (GFAP) структурный белок промежуточных филаментов астроцитов, и нейроспецифическая енолаза (NSE) - гликолитический цитоплазма-тический фермент нейронов, катализирующий превращение 2-фосфоглицерата в 2-фосфоенолпируват [Eng LF etal., 2000; Oh S.R etal., 2003].
РОС Нлч * ..f.uiiAX . БИБЛИОТЕКА J
ЯЦГХ
Исследования, выявившие повышение проницаемости ГЭБ для НСБ у новорожденных с ГИППГМ, преимущественно проводились лишь в течение нескольких первых суток жизни, с анализом лишь одного из НСБ [Blennow М. et al., 2001; Gar-cia-Alix A. et al., 1994; Nagdyman N. et al., 2001]. Динамика проницаемости ГЭБ при ГИППГМ одновременно для нескольких НСБ, которые помогли бы охарактеризовать дегенеративный процесс и глиального и нейронального компонентов ткани мозга в относительно отдалённом периоде патологического процесса, до сих пор не была изучена ни в клинике, ни в эксперименте.
Известно, что нейродегенеративный процесс сопровождается изменением содержания НСБ не только в периферической крови, но и (по-видимому, в первую очередь) в цереброспинальной жидкости. Последнему посвящено большое количество исследований [Beiger R. et al., 2002; Blennow M et al., 2001; Garcia-Alix A. et aL, 1994]. Вместе с тем, результаты сопоставления таких данных с уровнем НСБ в сыворотке крови, до сих пор остаются не известными.
Очевидно, что решение поставленных проблем практически невозможно только путём клинических исследований, т.к. неизбежно возникают ограниче-. ния, обусловленные частотой взятия проб крови и ликвора у детей с ГИППГМ. Поэтому необходимо проведение исследований на адекватных экспериментальных моделях данной патологии для уточнения патогенеза ГИППГМ, в частности, с целью выяснения роли нарушения проницаемости ГЭБ для НСБ в хронизации нейродегенеративного процесса и поиска новых подходов к диагностике, терапии и реабилитации пациентов с ГИППГМ. Наиболее часто используется моделирование ГИППГМ по методу J. Шее [J.Rice J. et al., 1981], воспроизводящему преимущественно одностороннее постнатальное гипоксиче-ски-ишемическое повреждение мозга, и по методу В. Lubec [Lubec В. et al., 1997], моделирующему внутриутробную асфиксию плода которая вызывает диффузное повреждение ткани обеих полушарий мозга.
В существующих моделях ГИППГМ недостаточно проработаны вопросы морфологических, неврологических и поведенческих критериев оценки динамики нарушения деятельности нервной системы в постнатальном периоде, что совершенно необходимо для анализа результатов экспериментальной терапии. В част-
0.
ности, традиционные методы оценки моторных и неврологических нарушений у крысят носят во многом субъективный характер [Чехонин В.П. и соавт., 2002; Balduini W. et al., 2000]. Следует отметить, что в большинстве экспериментов животных исследуют лишь в острый период, до 7 дней после гипоксически-ишемического повреждения, без анализа возрастной динамики состояния ЦНС [Almini R et al., Kohlhauser С. et al., 2000; Lubec B. et aL, 1999; Pulera M. R. et al., 1998]. Это определило необходимость разработки и испытания комплекса объективных инструментальных тестов для оценки динамики психоневрологического дефицита, проведения морфологического анализа состояния высокочувствительных к гипоксии и ишемии нейронов CAl-зоны гиппокампа в обеих используемых моделях ГИППГМ, а также анализа изменений размеров полушарий и боковых желудочков мозга у крыс с асимметричным повреждением мозга.
Цельработы: Количественный иммунохимический анализ NSE и GFAP, как критериев проницаемости ГЭБ в динамике гипоксически-ишемического перинатального поражения головного мозга в клинике и эксперименте.
Задачиработ ы:
-иммунохимический мониторинг NSE и GFAP в сыворотке крови детей с ГИППГМ различной тяжести в течение 24 недель постнатального развития;
-моделирование ГИППГМ на крысах и мониторинг состояния функций ЦНС в течение 12 недель с помощью инструментальных методов оценки психоневрологического статуса животных;
количественный динамический иммуноферментный анализ NSE и GFAP в сывороткекровииСМЖкрысе ГИППГМ;
анализ связи концентраций NSE и GFAP в сыворотке крови и ликворе с тяжестью поражения ЦНС, его функциональным состоянием, а также с процессами нейродегенерации после ГИППГМ в клинике и эксперименте.
Научная новизна: 1. Впервые устаноален феномен устойчивого (в течение 6 месяцев) достоверного повышения уровня NSE и GFAP в сыворотке крови у детей с ГИППГМ характеризующийся наличием двух пиков (на 1-й неделе и в конце первого месяца жизни).
Впервые установлено, что концентрации NSE в образцах сыворотки крови детей с внутрижелудочковыми кровоизлияниями (ВЖК) существенно (в 3-8 раз) превышают таковые у детей с перивентрикулярной лейкомаляцией (ПВЛХ что может быть использовано при оценке особенностей патологических изменений в ткани мозга при ГИППГМ.
Впервые установлено, что при моделировании ГИППГМ по методу J. Rice [J. Rice et al., 1981] и по методу В. Lubec [В. Lubec et al., 1997] нарушения интегральных показателей (отставание массы тела, двигательная гиперреактивность) и психоневрологический дефицит имеют место длительный период времени, вплоть до половозрелого возраста. При этом впервые выявлен феномен кетамин-индуцированной вращательной асимметрии у животных с ГИППГМ, моделированной по методу J. Rice et al., которая сохраняется на высоком уровне не менее трех месяцев постнатального развития.
Впервые показано, что у животньж, при моделировании ГИППГМ обоими методами в течение 3-х месяцев постнатального развития выявляется хронически протекающий процесс нейродегенерации и нарушение проницаемости ГЭБ для NSE и GFAP. Эти процессы характеризуются периодическим возрастанием концентраций исследуемых антигенов до пиковых значений, коррелирующих с ухудшением ряда показателей функций ЦНС (прирост массы тела, К-тест, неврологический статус, тесты пассивного избегания, Ротород, У-образный лабиринт).
Впервые установлено, что у крыс с моделированным ГИППГМ происходит резкое увеличение содержания NSE и GFAP в ликворе большой цистерны мозга, что прямо свидетельствует о наличии нейродегенеративного процесса. Характер динамики этих показателей аналогичен таковым в сыворотке крови.
Практическаязначимость: - Комплексный иммуноферментный анализ NSE и GFAP в сыворотке крови позволяет объективно оценить резистентность ГЭБ при ГИППГМ течение нейродегенеративного процесса и, что может быть использовано для выбора адекватной терапии.
Результаты исследования содержания НСБ в сыворотке крови и ликворе могут быть использованы для биохимической верификации тяжести и типа перинатального повреждения головного мозга новорожденныхдетей.
- Разработанный нами комплекс инструментальных методов мониторинга физиологических функции организма при моделировании ГИППГМ на животных по методу J.Rice и методу B.Lubec может быть использован при поиске новых подходов к лечению и реабилитации пациентов в постишемический период.
Апробация работы проведена на объединенной научно-практической конференции кафедры неонатологии ФУВ и кафедры детских болезней №2 педиатрического факультета РГМУ, сотрудников лаборатории иммунохимии отдела биологической психиатрии ГНЦССП им. В.П. Сербского, сотрудников ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова, Основные положения работы были представлены в периодической печати и на межлабораторных конференциях ГНЦССП им. В.П. Сербского (2000-2003 гг.).
Публикации: по материалам диссертации опубликовано печатных работ,
из них статьи в периодической печати.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на машино
писных страницах; состоит из введения, глав, выводов, практических рекомен
даций, библиографического указателя. В работе приведены данные обзора литера
туры, характеристика объекта, материалов и методов исследований, результаты
собственных исследований и их обсуждение.
Диссертация иллюстрирована рисунками и содержит таблиц.
