Введение к работе
1. Актуальность проблемы
Хорошо известно, что гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) обеспечивает не только защиту нервной ткани или клеток мозга от токсинов и продуктов метаболизма, но и предотвращает проникновение в кровь различных антигенов, специфичных для нервной ткани. За последние 30 лет накопилось большое количество научных данных о нейроспецифических белках (НСБ), методах их выделения, идентификации, биохимических и иммунохимических свойствах (Мооге В. W. и соавт., 1976, 1992, Eng L.F. и соавт., 1971, 2000., DeiblerG.E. и соавт., 1978, Воск Е. и соавт., 1978, 2004., Березин В.А., 1990, Чехонин В.П. и соавт., 2000). Показана практическая значимость их прижизненного иммунохимического анализа в биологических жидкостях при различных заболеваниях и патологических процессах в центральной нервной системе (ЦНС) (Бурбаева Г.Ш. и соавт., 1989., Barone F.C. и соавт.,1993, Ro-sengreen L.E. и соавт., 1994., Blennow М. и соавт., 1996., Чехонин В.П. и соавт., 2000, Eng L., 2001., Checkonin V. и соавт., 2002., Beems Т. и соавт., 2003).
К наиболее изученным и информативным НСБ, наряду с антигенами группы S100 (Мооге W.B. и соавт., 1996), нейрональными молекулами клеточной адгезии NCAM (Bock Е. и соавт., 1974.,) антигенами, ассоциированными с миелином-MAG (Poltorak М. и соавт., 1987.,) и MBP (Deibler G.E. и соавт., 1995), относятся и такие белки как нейроспецифическая енолаза (NSEXMarangos P.J., 1988), глиофибриллярный кислый протеин (GFAP)(Eng L.F., 1988), а также специфические а2-гликопротеин мозга (ci2GP)(Warecka К., 1982), осі и аг-глобулины мозга (ctiBG и a2BG)(Chekhonin V. и соавт., 2002). Иммуноферментный анализ этих НСБ и соответствующих антител (AT) к ним позволяет не только косвенно оценить степень нарушения функций ГЭБ, но и адекватно отразить характер и степень повреждения нейронов, астроцитов и олигодендроглиоцитов (Чехонин В.П. и соавт., 2000., Fri-driksson Т. и соавт, 2001., van Geel WJ. и соавт., 2002). При этом количественный динамический анализ НСБ и анти-НСБ- АД>с.оывдро«*Я*{ИЙй[боль-
БИБЛИОТЕКА СПетсрвгрг /Г/ 09 *Ж^4«т*/<
ных заболеваниями, сопровождающимися нарушением функции ГЭБ, может служить дополнительным критерием степени выраженности патологического процесса в ЦНС, а также объективизации оценки тяжести состояния пациента и прогноза течения заболевания (Barone F., 1993, Schaarschmidt Н., 1994., Verdu Perez А. и соавт., 2001., Herrmann М. и соавт., 2000, 2003, Seung-Hum., 2003).
Кроме этого, из-за отсутствия иммунологической толерантности к НСБ их прорыв в кровь при заболеваниях, сопровождающихся длительным или периодическим нарушением резистентности ГЭБ, нередко сопровождается появлением специфических анти-НСБ антител (Jankovic B.D., 1985., Chek-honin V. и соавт., 1994, 1999, Silber Е. и соавт., 2002). В связи с этим оправданно встает вопрос о целесообразности их количественного определения и исследования механизмов их аутоагрессии в направлении кровь-мозг. Понимание этих механизмов при тех или иных патологических процессах откроет новые перспективы специфической терапии нервно-психических заболеваний, включая высокоспецифичный способ защиты мозга от агрессии анти-НСБ антител из крови в мозг методом экстракорпоральной иммуносорбции (Taniguchi Y, 1995., Toepfer М. и соавт., 1999., Benny W.B. и соавт., 1999, SchneidewindJ.M., 2001).
В настоящее время в связи со значительным увеличением количества оперативных вмешательств с применением аппарата искусственного кровообращения, возрастает роль НСБ в оценке функций ЦНС и резистентности ГЭБ у больных, перенесших такие операции (Rasmussen T.S. и соавт., 1999, 2002, Anderson R. и соавт., 2003., Меупааг ГА. и соавт., 2003). Нет сомнений в том, что надежный количественный иммунохимический контроль этих параметров не только позволить получать объективную информацию о состоянии клеток нервной ткани в раннем постоперационном периоде, но и определит перспективы создания методов стабилизации их функций в условиях гипоксии и ишемии.
Цельработы
Целью данной работы явилось иммунохимическое исследование ней-роспецифических белков и антител к ним как критериев оценки резистентности гематоэнцефалического барьера человека и животных в норме и при патологии.
Задачи исследования
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи исследования:
На основе очищенных препаратов нейроспецифических белков и соответствующих препаратов поликлональных AT разработать иммунофер-ментные системы для анализа NSE, GFAP, CC2GP, ctiBG, CC2BG и AT к ним в сыворотке крови и ликворе человека и животных.
Провести иммуноферментный анализ каждого из пяти нейроспецифических белков и AT к ним в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями с целью оценки резистентности ГЭБ.
Провести комплексный иммуноферментный анализ пяти нейроспецифических белков и AT к ним в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями с целью оценки резистентности ГЭБ.
Провести сравнительный анализ диагностической значимости индивидуального и комплексного иммунохимического определения НСБ и анти-НСБ-АТ в сыворотке крови и ликворе больных нервными и психическими заболеваниями.
Исследовать в эксперименте взаимосвязь между выраженностью патологического воздействия на ЦНС и ГЭБ и концентрацией НСБ в крови, а также исследовать эффект проникновения AT к НСБ через поврежденный ГЭБ.
Исследовать проницаемость меченных I анти-НСБ антител через ГЭБ крыс после внутривенного введения в норме и при экспериментальной окклюзии средней мозговой артерии.
7. Разработать способ защиты мозга от патологического воздействия AT к НСБ на основе принципа экстракорпоральной иммуноадсорбции.
Научная новизна работы.
Модифицированные способы очистки НСБ и полученные на основе иммунизации ими поликлональные AT позволили разработать иммунофермент-ные тест-системы анализа НСБ и анти-НСБ AT в биологических жидкостях человека и животных.
Впервые разработан иммуноферментный метод определения diBG и ct2BG и AT к ним на основе принципа колоночного микрореактора с пределом чувствительности определения 50 пг/мл для (Xi BG, 100 пг/мл для (X2BG И 350 пг/мл для AT к Oi BG и a2BG.
С помощью иммуноферментных тест-систем анализа GFAP и c^GP, являющихся межвидовыми белками, исследованы и количественно оценены уровни этих НСБ в крови у животных с экспериментальным повреждением ГЭБ. В этих экспериментах впервые показано наличие прямой зависимости между выраженностью патологического воздействия на ЦНС и ГЭБ в частности, и изменением уровня НСБ и AT к ним в крови.
Впервые, в эксперименте, выявлен феномен селективного накопления меченных I анти-GFAP и I анти-NSE-AT в ткани мозга после их внутривенного введения на фоне повреждения ГЭБ, вызванного ишемией головного мозга (односторонняя окклюзия средней мозговой артерии).
Впервые в клинико-лабораторной практике применен комплексный метод иммуноферментного определения пяти НСБ и AT к ним в биологических жидкостях при заболеваниях и патологических состояниях, сопровождающихся нарушением функции ГЭБ. Анализ полученных результатов выявил высокую диагностическую и прогностическую значимость определения НСБ и AT к ним, как при одномоментном, так и при динамическом исследовании.
Впервые получена серия результатов, свидетельствующих о принципиальной возможности прорыва анти-НСБ антител через поврежденный ГЭБ, сопровождающегося комплексом патологических процессов в нервной ткани.
На основе этих результатов проведены исследования, послужившие основой для разработки методологии защиты нервной ткани от аутоантительной агрессии анти-НСБ антител из крови путем их экстракорпоральной иммуноадсорбции.
Впервые разработан твердофазный иммуносорбент на основе сополимера стирола и дивинилбензола и иммобилизованных высокоочищенных препаратов НСБ. Стендовые, лабораторные и токсикологические испытания полученного иммуносорбента показали его гемосовместимость, высокую емкость по отношению к сорбируемым AT и отсутствие токсичности. На способ приготовления твердофазного иммуносорбента получено авторское свидетельство на изобретение (№ 1476648).
Впервые в рамках программы ограниченных клинических испытаний метода экстракорпоральной иммуноадсорбции были проведены успешные процедуры по извлечению AT к NSE, GFAP, Ct2GP, otiBG И (X2BG из крови трех больных, находящихся в критическом состоянии, обусловленном нейро-лепсией, а также AT к NSE, GFAP, CI2GP и МВР у больного с бульбарной формой бокового амиотрофического склероза.
Практическая ценность
На основе выделенных НСБ и поликлональных AT к ним разработаны иммуноферментные тест-системы их комплексного определения в сыворотке крови и ликворе пациентов с заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ. Используя эти иммуноферментные тест-системы в клинико-лабораторной практике, удалось выявить особенности изменения концентрации НСБ и AT к ним в сыворотке крови в зависимости от степени тяжести и длительности течения заболевания.
Комплексный метод иммуноферментного определения НСБ и анти-НСБ AT в сыворотке крови и ликворе может быть использован в клинико-лабораторной практике для диагностики нервных, психических, нейроонко-
логических, нейроинфекционных или соматических заболеваний, течение которых сопровождается нарушением резистентное ГЭБ.
Динамическое определение уровней НСБ и AT к ним у больных средней и тяжелой степени тяжести при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся нарушением резистентности ГЭБ, позволяет оценить характер и выраженность патологического процесса в ЦНС, оптимизировать лекарственную терапию и прогнозировать исход заболевания.
В рамках выполнения программы ограниченных клинических испытаний иммуноадсорбции анти-НСБ антител показано, что этот метод удаления антител к нейроспецифическим белкам из крови является эффективным методом специфической терапии, способной предотвратить развитие аутоанти-тельной агрессии у больных нервно-психическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ на фоне высоких концентраций анти-НСБ антител.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработанные способы очистки NSE, GFAP, otjGP, d|BG, ajBG позволяют применять их для получения моноспецифических антисывороток и высококачественных препаратов соответствующих антител. Полученные препараты НСБ и анти-НСБ антител дают возможность разработать на их основе иммуноферментные диагностические тест-системы анализа NSE, GFAP, (X2GP, ajBG, a^BG и антител к ним, характеризующиеся точностью, воспроизводимостью, надежностью, и соответствующие общепринятым стандартам.
Комплексный иммуноферментный анализ НСБ и анти-НСБ AT в сыворотке крови и в ликворе может быть применен для диагностики, мониторинга и контроля эффективности проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением барьерной функции ГЭБ.
Нарушение резистентности ГЭБ не является специфическим процессом, характерным для того или иного заболевания, или внешнего воздейст-
вия, повлекшего за собой его повреждение, а является универсальным патогенетическим механизмом и определяется лишь интенсивностью и продолжительностью патологического воздействия.
Количественный динамический анализ НСБ и анти-НСБ AT у больных средней и тяжелой степени тяжести при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся нарушением резистентности ГЭБ, позволяет оценить характер и степень выраженности патологического процесса в ЦНС, оптимизировать лекарственную терапию и прогнозировать исход заболевания. Определение концентрации НСБ и AT к ним в критические сроки (7, 14,21 и 30 сутки) патологического процесса позволяет оценить степень репарационных процессов в нервной ткани и степень восстановления ГЭБ, уровень сенсибилизации организма к НСБ, и прогнозировать исход заболевания.
Повторный контакт НСБ с иммунокомпетентными клетками приводит к появлению в крови анти-НСБ AT, способных, при определенных условиях, проникать через поврежденный ГЭБ в мозг и связываться с антигенами-мишенями. Для предотвращения патологического воздействия на клетки-мишени возможно применение метода экстракорпоральной иммуноадсорб-ции, позволяющей селективно удалять эти AT из крови больных.
Апробация работы, внедрение, публикации
Диссертация выполнена в соответствии с планами научных исследований ГНЦ ССП им. В.П. Сербского и была апробирована на объединенной научной конференции ГНЦ ССП им. В.П. Сербского.
Результаты диссертационной работы успешно используются в клиниках нервных болезней ММА им. И.М. Сеченова, Российского государственного медицинского университета и НИИ неврологии РАМН. Различные аспекты диссертационной работы явились основанием для планирования новых научных тем, продолжающих данное научное направление.
Основные положения были представлены и обсуждены на VIII International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems (Salt Гаке City, Utah, 1997), III Furopean Meeting on dial Cell Function in Health and Disease,
Greece, 1998, IV European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease, Barcelona, 2000; в материалах II Российского Конгресса по патофизиологии, Москва, 2000; на заседаниях Проблемного Совета по биологическим основам психиатрии ГНЦ ССП им. В.П.Сербского, 2000; 3-rd International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drags", Suzdal, 2001; на Международной конференции «Biochemical and molecular biological aspects of the brain immune system», Yerevan, 2001; V European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease, Rome, Italy, 2002; на Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии", "Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия", Москва, 2002; на семинаре "Актуальные проблемы современной психиатрии", Томск, 10-11 декабря 2002.; на 3-й школе-семинаре для молодых ученых и международной научной конференции "Белки-маркеры патологических состояний", 2003, г. Астрахань, VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease, Germany, Berlin 2003.
По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, результаты диссертации включены в монографию «Иммунохимический анализ нейро-специфических антигенов» Москва., "Медицина", 2000. Список публикаций приводится в конце автореферата.
Объем и структура диссертации
