Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
Моноклональные антитела в диагностике и терапии. онкологических заболеваний 11
1.1. Общие аспекты применения моноклональных антител в онкологии 11
1.1.1. Иммунохимический анализ в онкологии 11
1.1.2. Диагностические и лекарственные препараты на основе МАТ в онкологии 15
1.2. МАТ в диагностике и терапии опухолей головного мозга 18
1.2.1. Молекулярные механизмы деструкции ГЭБ в процессе опухолевой инвазии глиобластом 19
1.2.2. Потенциальные мишени для иммунодиагностики и иммунотерапии глиом 23
1.2.3. Роль GFAP в реактивном глиозе в ответ на опухолевую инвазию 27
1.2.5. Перспективы диагностики и терапии низкодифференцированных глиом с
помощью меченых радионуклидом моноклональных антител 32
1.3. Резюме 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1. Характеристика исследуемого материала 41
2.2. Общая характеристика экспериментальной работы 42
2.3. Моделирование интракраниальной глиобластомы 43
2.3.1. Культивирование глиомных клеток Сб 43
2.3.2. Стереотаксическое введение глиомных клеток Сб в каудопутамен мозга крысы 44
2.3.3.Оценка развития имплантированной глиомы Сб 44
2.4. Гистологические методы 44
2.4.1. Окрашивание срезов мозга крезиловым фиолетовым и толлуидиновым синим для оценки инвазии имплантированных глиомных клеток Сб 44
2.4.2. Окрашивание срезов мозга ванадиевым- кислым фуксином с последующим докрашиванием толуидином т 46
2.5. Иммунохимические методы 46
2.5.1. Аффинная хроматография МАТ на протеин-А-агарозе 46
2.5.2. Иммуногистохимический анализ антигенов, ассоциированных со структурами ГЭБ 47
2.5.3. Иммунофлюоресцентное исследование методом световой и лазерной
конфокальной микроскопии антигенов структур, формирующих ГЭБ, на срезах
головного мозга крыс с глиомой Сб 49
2.5.4. Иммуноферментный анализ GFAP в сыворотке крови крыс 50
2.6. Радиохимические методы 52
2.6.1. Коньюгирование МАТ с радиоактивным Iі25 52
2.6.2. Тонкослойная хроматография препарата 1251-МАТ 52
ч 2.6.3. Диск-электрофорез препарата 1251-МАТ 53
f 2.6.4. Анализ радиоактивности 1251-МАТ в органах крысы с глиомой Сб 53
2.6.5 Контактная радиоавтография срезов головного мозга крыс с глиомой Сб 54
2.6.5 Кислотная преципитация органов крыс с глиомой Сб после внутривенного
введения 1251-меченных МАТ 54
2.7. Схема эксперимента по оценке селективного накопления в органах 1251-MAT 55
2.7.Статистическая обработка полученных результатов 56
Результаты исследования 57
ГЛАВА 3. Гистологический и иммуногистохимический анализ экспериментальной глиомы сб крысы 57
3.1. Результаты оценки инвазии глиомы Сб по общему состоянию крыс и по неврологическому статусу 57
3.2. Гистологический анализ инвазии глиомных клеток Сб 57
3.3. Иммуногистохимический анализ AMVB1, ЕВА и GFAP на срезах головного мозга крыс с глиомой Сб 61
3.4. Оценка проницаемости ГЭБ с помощью высокомолекулярных агентов при развитии глиомы Сб 73
ГЛАВА 4. Ифа GFAP в сыворотке крови крыс с глиомой сб с последующим изученим взаимосвязи морфометрических показателей глиомы и концентрации gfap в сыворотке крови крыс в динамике опухолевого процесса 75
4.1. Характеристика иммуноферментной тест-системы и нормальные показатели GFAP в сыворотке крови крыс 75
4.2. Динамика концентрации GFAP при экспериментальной глиоме Сб 76
4.3. Морфометрический анализ глиомы Сб на серийных гистологических срезах мозга в разные сроки ее инвазии 78
4.4. Морфометрический анализ астроглиального вала на серийных срезах мозга
методом флюоресценции 80
4.5. Динамика развития глиомы по данным МРТ-исследования 82
4.6. Корреляционный анализ показателей морфометрии и концентрации GFAP в
сыворотке крови 86
ГЛАВА 5. Направленный транспорт меченых антител к gfap и amvb1 в область глиомы сб при введении в системный кровоток крысы 90
5.1. Характеристика 1251-МАТ 90
5.2. Распределение меченых антител к GFAP и AMVB1 в органах после внутривенного введения крысам с экспериментальной глиомой Сб 92
5.2.1. Кинетика меченных 125ІМАТ в крови 92
5.2.2. Распределение меченных 1251 МАТ во внутренних органах крыс с глиомой Сб 93
5.2.3. Накопление меченных 1251 МАТ к GFAP и AMVB1 и IgGm в полушариях мозга крыс с глиомой Сб 94
5.2.4. Конкурентное ингибирование накопления меченных I антител к GFAP в
пораженном полушарии мозга крыс 96
5.3. Контактная авторадиография препаратов головного мозга крыс с глиомой Сб после введения меченных I антител 98
5.4. Биодеградация йодированных МАТ в крови и органах после введения в системный кровоток крысам с глиомой Сб 99
ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов 103
Выводы 109
Практические рекомендации по
Литература 111
- Общие аспекты применения моноклональных антител в онкологии
- Общая характеристика экспериментальной работы
- Результаты оценки инвазии глиомы Сб по общему состоянию крыс и по неврологическому статусу
- Характеристика иммуноферментной тест-системы и нормальные показатели GFAP в сыворотке крови крыс
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Существенной проблемой современной нейроонкологии являются низкодифференцированные опухоли головного мозга (анапластическая астроцитома, мультиформная глиобласто-ма и медуллобластома). Актуальность исследования связана с быстрым неконтролируемым ростом опухоли, высокой частотой послеоперационных рецидивов, отсутствием четких критериев динамики опухолевого процесса. Средняя выживаемость таких пациентов без лечения составляет около года с момента постановки диагноза [221, 250].
Послеоперационные рецидивы возникают вследствие инвазивного роста глиобластомы [104, 207]. Современные исследования не позволяют точно определить границы инвазии глиобластомы. Низкая эффективность стандартных химитерапевтических методов связана с тем, что цитостатики, эффективные в отношении активно делящихся клеток, бессильны в отношении мобилизованных глиомных клеток, которые после химиотерапии активируются и становятся источниками новых очагов глиомы [3, 221].
Таким образом, поиск более эффективных методов диагностики низко-дифференцированных опухолей, в том числе и глиом, остается актуальным. Большую значимость в онкологической практике в эпоху активного развития молекулярной биологии и генетики начинает приобретать онкоиммунология.
Впервые идея использования специфических противоопухолевых антител для иммунотерапии новообразований была предложена в 1948 г. Pressman и Keighley. В 1975 году изобретение гибридомной технологии Kohler G., Milstein С. (Нобелевская премия 1984 года) позволило в дальнейшем получать моноклональные антитела (МАТ), селективно взаимодействующие с антигенами, в-частности, экспрессирующимися клетками злокачественной опухоли [10, 18]. Были получены МАТ, распознающие /in vitro/ рецептор эпи-дермального фактора роста [58], рецептор фактора роста нервов [142], фиб-ронектин [166], тенасцин [114, 151, 190] и ряд других известных и неиденти-фицированных белков, представленных в экспериментальной глиоме животных и глиобластоме человека [75]. Препараты направленного действия на основе МАТ выгодно отличаются от классических химиотерапевтических лекарственных средств тем, что способны избирательно связываться с рецепторами, экспрессирующимися на опухолевых клетках [1, 18, 22, 39].
Несмотря на интенсивное развитие радиоиммунодиагностики и -терапии, в настоящее время отсутствует универсальная транспортная система, способная при введении в системный кровоток обеспечить терапевтическую концентрацию доставленного препарата без осложнений для пациента. В первую очередь необходимо преодолеть гематоэнцефалический барьер, сформированный церебральными эндотелиоцитами с их уникальными мор-фо-функциональными свойствами: наличие плотных контактов, связанных с Р-поверхностью цитолеммы [242, 187], высокое содержание митохондрий, низкий уровень пиноцитоза, отсутствие фенестр [131], высокое трансэндоте-лиальное сопротивление [161]. Эти особенности препятствуют пассивной диффузии любых гидрофильных высокомолекулярных веществ, не имеющих систем направленного транспорта [22, 25, 144, 224]. При паталогических состояниях ГЭБ условия проницаемости могут измениться, в том числе и для специфических антител к барьерным и забарьерным рецепторам [29,32, 101, 157,190].
Известно, опухоли головного мозга сопровождаются изменением проницаемости ГЭБ [22, 101, 157]. В эндотелиоцитах опухолевых микрососудов изменяется экспрессия белков, подерживающих барьерные функции [22, 101], отмечается увеличение экспрессии антигенов, нетипичных для барьерного эндотелия [104]. Одним из примеров нетипичной экспрессии является увеличение экспрессии антигена аблюминальной мембраны эндотелиоцитов (AMVB1). AMVB1 распознается моноклональными антителами 2тВб, полученными в лаборатории иммунохимии ФГУ ГНЦССП Росздрава [22]. По результатам наших исследований уровень AMVB1 в опухолевых эндотелиоцитах достоверно выше чем в нормальном церебральном эндотелии [23]. Интерес к белкам, специфически экспрессирующимся в эндотелии неопластических микрососудов, обусловлен тем, что это ассоциированные с ангиогене-зом белки— рецепторы факторов роста, интегрины и другие молекулы клеточной адгезии. Применение МАТ к подобным белкам-мишеням, возможно, позволит селективно ингибировать неоангиогенез и, тем самым, замедлить или вообще остановить рост опухоли в послеоперационном периоде [216].
В проведенных ранее исследованиях [22, 31] удалось показать селективное накопление анти-GivlP антител и awm-NSE антител в зоне ишемии мозга крыс с поврежденным ГЭБ в результате окклюзии средней мозговой
артерии. Эти данные свидетельствуют о перспективности применения МАТ к указанным нейроспецифическим антигенам в качестве векторов для адресной доставки лекарственных и диагностических агентов в опухоль головного мозга.
Органические заболевания ЦНС (т.е. сопровождающиеся возникновением патологического очага в нервной ткани) сопровождаются реакцией аст-роглии [22]. Наличие реактивного астроглиоза при экспериментальных глиомах подтвержден многими исследователями [167, 239]. Астроглиоз сопровождается повышенной пролиферацией фибриллярных астроцитов в зоне патологии, выраженной гипертрофией их клеточных тел и цитоплазматических отростков, быстрым синтезом белков цитоскелета, в основном, высоким уровнем экспрессии GFAP "glial fibrillar acidic protein" — специфического для астроцитов белка промежуточных филаментов [6,61, 167].
В выборе экспериментальной модели опухоли для наших исследований мы руководствовались данными других исследователий, которые свидетельствуют, что наибольшим морфологическим свойством и характером роста с мультиформной глиобластома человека обладает глиома С6, полученная на крысах Wistar-Furth с помощью канцерогенеза М",К'-нитрометилмочевиной [67, 91, 104, 158,167, 232, 239, 257].
В процессе инвазии глиобластомы происходит гибель глиальных клеток, в результате чего происходит выход внутриклеточных белков в межклеточное пространство, в том числе и GFAP. Из межклеточного пространства через неполноценный ГЭБ GFAP элиминируется в биологические жидкости организма [22, 63,193].
В этом случае актуальным является определение уровня GFAP в биологических жидкостях как критерия состояния глиобластомы [22, 63, 193, 61]. Большое количество данных, полученных в экспериментах in vitro и in vivo подтверждают, что мониторирование уровня GFAP в сыворотке крови и ликворе позволяет как охарактеризовать степень патологических изменений в ЦНС, так и оценить прогноз того или иного критического состояния [12, 22, 61, 193].
В настоящее время имеются данные о взаимосвязи синтеза GFAP астроцитами со степенью выраженности патологических процессов в ЦНС [22, 23, 24, 145]. В свою очередь, количественный мониторинг GFAP в биологи-
ческих лшдкостях в процессе развития глиобластомы позволил бы выявить достоверную взаимосвязь реакции астроглии с выходом белка из паренхимы мозга, разработать диагностическую систему для оценки размеров и состояния глиобластомы. Решение поставленной задачи позволит создать условия для разработки методов направленной высокоселективной диагностики и лечения глиобластом.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Провести иммунохимическую оценку проницаемости ГЭБ у крыс с глиомой С6 и изучить перспективы визуализации опухоли с помощью ме-ченных I моноклональных антител к GFAP.
ЗАДАЧИ:
Воспроизвести модель экспериментальной Сб-глиомы у крыс. Провести динамический гистологический и морфометрический анализ глиомы на срезах мозга; оценить проницаемость ГЭБ для высокомолекулярных веществ.
Охарактеризовать динамику роста глиомы С6 с помощью магнитно-резонансной томографии, количественно оценить объём глиомы на разных сроках развития опухоли.
Провести иммуногистохимический анализ экспрессии GFAP и других антигенов, ассоциированных с эндотелиоцитами, формирующих гема-тоэнцефалический барьер (AMVB1, ЕВА) с помощью специфических к ним моноклональных антител на срезах мозга крыс при экспериментальной глиоме Сб.
Провести мониторинг элиминации GFAP в системный кровоток в процессе развития экспериментальной глиомы С6 с помощью количественного иммуноферментного анализа. Провести корреляционный анализ сывороточной концентрации GFAP, объёма глиомы по данным МРТ и морфометрических показателей глиомы и астроцитарного вала.
Оценить накопление меченых I антител к GFAP в мозге и в других органах крыс при экспериментальной глиоме С6 с помощью анализа радиоактивности в образцах органов и контактной радиоавтографии срезов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые проведено динамическое исследование развития астроглиаль-ного вала вокруг имплантированной глиомы Сб. Показано, что GFAP-положительные реактивные астроциты сопровождают инвазию глиомы на всех сроках ее развития.
Впервые продемонстрирован феномен селективного накопления меченых 125І анти - GFAP антител в полушарии головного мозга с глиомой. более чем в 20 раз превышающий накопление этих же антител в нормальной ткани.
Впервые при экспериментальной глиоме С6 показана взаимосвязь уровня GFAP и объема астроцитарного вала.
Впервые разработан и применен для визуализации клеточных компонентов ГЭБ метод двойного иммунопероксидазного анализа с помощью антител различной специфичности.
Впервые с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии исследована ультраструктурная локализация AMVB1 эндотелиоци-тах микрососудов, формирующих ГЭБ. Показано, что этот антиген локализуется на аблюминальной и/или базальной мембране эндотелиоци-тов.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Количественный мониторинг концентрации GFAP в сыворотке крови может быть использован в качестве диагностического критерия состояния внутримозговой глиомы.
Иммуногистохимическии анализ эндотелиальных антигенов ЕВА и AMVB1 может применяться в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo для характеристики сосудистой системы глиом.
Селективность меченных I анти-GFAP антител антител, обусловленная взаимодействием с антигеном-мишенью в области астроглиального вала вокруг глиомы, позволяет рекомендовать их в качестве векторов в системах направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в опухоль.
Апробация диссертационной работы была проведена на заседании Проблемного Совета по фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦ ССП Росздрава» (11.11.2008).
Основные положения диссертации были представлены в периодической печати, на межлабораторных конференциях ФГУ «ГНЦ ССП Росздра-ва» (2006- 2008 гг.), международной конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007г.), конференции с международным участием по нейрохимическим механизмам формирования адаптивных и патологических состояний мозга (Санкт-Петербург, 2008 г.), международной конференции EUROMAR (Санкт - Петербург, 2008), международном конкурсе молодых ученых в области нанотехнологий Rusnanotech (Москва, 2008).
ОБЪЁМ РАБОТЫ
Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Работа изложена на 133 машинописных страницах и содержит 39 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 33 отечественных и 224 иностранных источника.
Общие аспекты применения моноклональных антител в онкологии
Одним из первых зарекомендовавших себя применений моноклональных антител в онкологической практике является ИГХ с целью фенотипиро-вания опухолей.
Иммунофенотипирование опухолей связано с выявлением ее гистогенеза [4, 35]. Наиболее распространено иммунофенотипирование лимфом с помощью идентификации экспрессируемых антигенов по классификации CD. В настоящее время описано более 100 классов CD [149], но для целей диагностики достаточно использовать панель, включающую антитела к 2-3 видам CD, чтобы определить ее гистогенез [35]. Например, лимфомы Бер-китта состоят из злокачественных В-клеток, которые экспрессируют антигены CD10, CD19, CD20, CD22, CDIa, HLA-DR [130]; лимфобластные лимфомы развиваются из незрелых Т-клеток и экспрессируют иммунофенотипиче-ские маркеры Т-клеточной дифференцировки: Tdt, CD3, CD4, CD5, CD7. CD8. Таким образом, для определения происхождения лимфомы, достаточно провести идентификацию хотя бы трех CD [130, 143].
В отличие от иммунофенотипирования лимфом, типирование лейкозов требует применения большего числа антител. Панель для фенотипирования лейкозов включает антитела к CD34, миелопероксидазе, КР-1 (CD68), CD 15 (миелоидная линия), гликофорину А, (Мб), фактору VIII или гликопротеин) Ila/IIIb (Ml). Для типирования лимфобластных лейкозов пригодна "лимфом-ная" панель [130,143].
Правильно подобранная панель антител может помочь установить гистологический тип опухоли, уточнить диагноз и выбрать терапию. При цитохимической диагностике опухолей можно использовать алгоритм, предложенный D. Mason. Например, эпителиальное происхождение опухоли определяется с помощью панели антител к цитокератинам (водорастворимые внутриклеточные пептиды, присутствующие во всех эпителиальных клетках, причём различные виды эпителия экспрессируют различные цитокератины) и антигену эпителиальных мембран (ЕМА) [183, 143]. Экспрессия ЕМА отмечается также в ряде низкодифференцированных опухолей лимфоидного происхождения высокой степени злокачественности [135].
Экспрессия опухолью общелейкоцитарного антигена (LCA) говорит об ее гемопоэтическом происхождении. LCA — высокомолекулярный гликопротеин, который в большом количестве содержится в наружных клеточных мембранах клеток лимфоидного и костномозгового происхождения. Экспрессия этого антигена не отмечена в нормальных или опухолевых клетках другого происхождения, поэтому данный антиген является важным дискриминирующим фактором, особенно, при проведении дифференциального диагноза между недифференцированным раком, амеланотической меланомой и крупноклеточной лимфомой [143, 130]. Еще одним антигеном, пригодным для подтверждения меланомы, служит меланомо-специфический антиген (НМВ-45), находящийся в премеланосомах. Иммуноцитохимический диагноз амеланотической меланомы формулируется, как опухоль, негативная к кератинам и LCA, но позитивная к S-100, НМВ-45 и виментину [173]. Белок S-100, выделенный из ткани головного мозга, является водорастворимым. Ранее считалось, что он является довольно специфическим маркером глиаль-ных клеток. В настоящее время имеются данные об экспрессии белка S-100 меланоцитами, клетками Лангерганса, гистиоцитами, хондр оцитами, липоци-тами, кардиомиоцитами, шванновскими клетками, эпителием молочных, слюнных и потовых желез, и опухолями из указанных клеток. Учитывая широкий характер экспрессии этого антигена его надо применять только в панели с другими антителами [253, 173].
Миогенные опухоли позволяют дифференцировать МАТ к десмину и актину [95]. Десмин — белок промежуточных филаментов гладких, поперечно-полосатых и сердечных мышечных клеток. Синтез десмина начинается в ранний период дифференцировки миобласта и предшествует появлению других структурных белков, например, миоглобина. Десмин используется для верификации опухолей мышечного генеза, таких как лейо- и рабдомиосарко-мы. Актин — это сократительный белок, имеющий 6 изоформ, из которых а-форма присутствует только в мышечных клетках, тогда как другие присутствуют в клетках немышечного происхождения [95].
Нейроэпителиальные опухоли экспрессируют целый ряд антигенов, в частности, специфическую енолазу, синаптофизин, белок пресинаптических пузырьков нейронов, также является чувствительным маркером невральной и нейроэндокринной дифференцировки [134]. Важно отметить, что опухоли чисто нейрогенного происхождения экспрессируют все или часть из перечисленных маркеров, но негативны к цитокератину. Если опухоль дополнительно экспрессирует цитокератин, то это свидетельствует в пользу нейроэндокринной природы. Примером такого рода опухолей может служить нейро-эндокринный рак кожи или опухоль Меркеля, карциноиды. В качестве дополнительного маркера в подобных случаях можно использовать антитела к хромогранину А, члену белкового семейства, входящих в состав матрикса нейросекреторных гранул, а также присутствующего практически в клетках всех эндокринных желез [134].
Виментин — белок промежуточных филаментов, который экспресси-руется большинством клеток мезенхимального происхождения. Первоначальные исследования давали возможность предположить, что виментин является специфическим маркером и позволит проводить дифференциальный диагноз между опухолями неэпителиального и эпителиального генеза. Более поздние данные указывают, что экспрессия виментина не ограничивается опухолями мезенхимального происхождения и встречается в карциномах и меланомах. Эпителиальные клетки могут экспрессировать виментин при культивировании in vitro, a in vivo этот феномен отмечается у раковых клеток, находящихся в экссудатах [253, 95].
Для выявления ранней стадии опухолевого процесса и мониторинга его течения, контроля за эффективностью лечения и выявления рецидивов в ранние сроки широко используются иммуноферментные методы анализа, обеспечивающие высокую надежность результата. Иммуноферментный анализ с использованием МАТ позволяет определять различные онкомаркеры в крови пациента [25]. Маркеры представлены, в основном, белками в форме антигенов, ферментов, полипептидных гормонов и другими соединениями. Очень важно определять не один, а несколько опухолевых маркеров, коррелирующих между собой и позволяющих повышать точность обследования [25].
Важным направлением в иммунохимическом анализе является исследование антигенов органов, расположенных за пределами ГЭБ. Примером такого рода антигенов являются нейроспецифические белки (НСБ) [22, 25, 6, 17, 20, 24, 63, 61, 86]. В норме ГЭБ препятствует элиминации антигенов в кровь и ликвор. При развитии различных патологических процессов ЦНС и других систем организма происходит значительное повышение уровня НСБ в биологических жидкостях. Концентрация НСБ в периферической крови отражает степень повреждения паренхимы мозга и нарушения проницаемости ГЭБ. В обеих ситуациях НСБ являются ценнейшими маркерами патологических процессов в НДС. Учитывая это, роль МАТ к НСБ трудно переоценить, на их основе разрабатываются стандартные тест-системы, позволяющие верифицировать церебральный патологический процесс, контролировать его течение и эффективность проводимой терапии [24, 63, 193].
Общая характеристика экспериментальной работы
Эксперименты выполнены на 115 половозрелых самках крыс линии Вистар, с начальным весом 200-250 г. Все экспериментальные исследования проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства высшего и среднего образования СССР от 13.11.1984г. №742). Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 особей в каждой, не менее двух недель до началаэксперимента на стандартной диете, при свободном доступе к воде и нормальном световом режиме.
Крыс умерщвляли декапитацией с предварительной прижизненной фиксацией органов 4%ПФ. Перфузию органов проводили по общеизвестной методике [8] в нашей модификации. Крыс глубоко наркотизировали внутри-брюшинным введением кетамина (100 мг/кг), затем иммобилизировали на препаровальном столике. Срединным разрезом вскрывали брюшную и грудную полости. На нисходящую аорту накладывался зажим. Для избежания тромбообразования вскрывали полость правого предсердия и выпускали кровь. В области верхушки сердца делали надрез, через который в полость левого желудочка до аортального синуса вводилась канюля, присоединенная к шприцу Жане. Перфузию мозга начинали с введения 100-150 мл забуфе-ренного физиологического раствора рН 7,4 в течение одной минуты, после чего вводили 300 мл 4% ПФ. В качестве фиксатора использовали свежеприготовленный 4%-й нейтральный раствор ПФ, охлажденный до 0 С. После заверения перфузии крыс декапитировали, извлекали мозг и выдерживали в фиксирующем растворе в течение 18 часов при 4+С. На следующий день мозг промывали в PBS, устанавливали па столик замораживающего микротома, охлаждали с помощью углекислоты и приготавливали серийные срезы на замораживающем микротоме (Reichert) толщиной 20-40 мкм.
Взятие крови у крыс проводили во время экперимента из бедренной вены. Делали небольшой разрез в паховой области, тупым методом отслаивали мышцы и фасции, выделяли вену. Отбирали по 1,0-1,5 мл крови, центрифугировали при 1500 об./мин, сыворотку замораживали на - 20 С и хранили до исследования.
В работе использовали клеточную линию глиомы С6, предоставленную Халанским А.А. из ЭНИИ морфологии человека РАМН; гибридомы, предоставлению рук.лаборатории нейрохимии ФГУ ГНЦ ССП Росздрава, д.м.н. О.И. Гуриной; препараты жти-GFAP антител, Mab2mB6 и неспецифические IgG мыши, очищенные из мышиного асцита; мозг крыс с экспериментальной глиомой С6, фиксированные 4% параформальдегидом(ПФ); сыворотка крови крыс из бедренной вены в разные сутки инвазии глиомы.
Асцит получали в результате внутрибрюшинного введения самкам мышей линии Balb/c гибридом в количестве 106 клеток на мышь с целью получения асцитическои жидкости, содержащей моноклональные анти-GF P антитела (клон 4mD9), ати-AMVBJ (клон 2тВ6), Ig G(sp2/0). Введение гибридом мышам осуществляли через 2 недели после внутрибрюшинной инъекции 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекан) («Sigma», USA). Забор асцитическои жидкости осуществляли спустя 10-14 дней после инъекции гибридных клеток. Моноклональные анти-GFAP антитела, Mab2mB6, Ig G выделяли из асцита при помощи иммуноаффинной хроматографии на протеин- А- агарозе («Sigma», USA).
Экспериментальная работа состояла из трех этапов:
1. Моделирование глиобластомы на крысах. На этом этапе было использовано 32 животных с экспериментальной глиомой С6, которым проводили гистологический, и иммуногистохимический анализ GFAP, ЕВА, AMVB1. Дополнительные группы крыс были созданы для оценки проницаемости ге-матоопухолевого барьера для Evans blue и пероксидазы хрена (4 крысы), исследования опухолевой инвазии с помощью предварительного мечения гли-омных клеток витальным красителем CFDA SE (5 крыс), проведения динамического МРТ исследования (8 крыс) и флюоресцентного определения объёма астроцитарного вала (12 крыс).
2. Иммуноферментный анализ уровня сывороточного GFAP в процессе развития глиомы Сб. Кровь для проведения этого исследования забирали на всех этапах эксперимента (всего проанализировано 83 образца сыворотки крови крыс с глиомой и 17 образцов интактных крыс).
3. Внутривенное введение меченых I МАТ крысам с глиомой С6 с по следующим анализом их накопления в мозге и других органах, радиоавтографией и оценкой биодеградации. На этом этапе исследовались три группы крыс в соответствии с вводимыми антителами: анти-GFAP антителами(23 крысы), МаЬ2тВб (20 крыс) и IgG мыши (20 крыс).
Более подробно каждый из этапов охарактеризован в соответствующих разделах данной главы.
Замороженную в жидком азоте аликвоту клеток линии Сб в количестве 5x105 быстро размораживали, отмывали центрифугированием от диметил-сульфоксида, ресуспендировали в 12 мл полной среды (DMЕМ, 20% FBS, 2 мМ L-глутамина, 25 мМ IIEPES, антибиотик-антимикотик 10000 ед./мл) и высаживали в 15-см культуральные матрасы (Costar). Культивирование глиомы продолжали до образования монослоя (Рис. 1, Б). Далее клетки глиомы суспендировали с помощью ферментативной диссоциации (0,05% трип-син-ЭДТА, 10 мин, 37С), отмывали от фетальной сыворотки раствором Хэн-кса, ресуспендировали в диссоциирующем буфере (Invitrogen), подсчитывали в камере Горяева, проверяли жизнеспособность окрашиванием трипановым синим и готовили аликвоты по 5x10 клеток, которые хранили в 1 мл среды DMEM с антибиотиком при 4С до стереотаксического введения в мозг (3-4 часа). Для оценки миграции инвазивных опухолевых клеток на срезах мозга несколько аликвот перед имплантацией метили флюоресцентным трейсером CFDA SE с помощью набора Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit (Invitrogen) no протоколу изготовителя. Для этого в клеточную среду добавляли 25 мкМ трейсера на фосфатно-солевом буфере с диметилсульфоксидом и инкубировали 15 минут при 37С. Особенностью CFDA SE является то, что его флюоресценция возникает только после диффузии через клеточную мембрану, когда происходит его деацетилирование внутриклеточными эстеразами, что позволяет исключить флюоресценцию, не связанную с мечением клеток (Рис.2).
Результаты оценки инвазии глиомы Сб по общему состоянию крыс и по неврологическому статусу
Животные хорошо переносили стереотаксическую операцию; до 15 — 16 суток развития глиомы у них не наблюдалось никакой неврологической симптоматики. Через 16 суток после имплантации глиомных клеток неврологическим нарушением, отмечаемым у всех крыс было изменение позы в форхме незначительного наклона головы (не более 30 градусов) в сторону пораженного полушария. Кроме того, возникало повышение мышечного тонуса и некоторое отставание в нижней конечности, контралатеральной пораженному полушарию. В некоторых случаях наблюдался умеренно выраженный контралатеральный гемипарез. После 21 — 23 роста глиомы суток состояние крыс начинало прогрессивно ухудшаться, крысы теряли в весе, приобретали характерную «горбатую» позу, вокруг глаз появлялись сукровичные подтеки. К 25 — 28 суткам становились малоподвижными, перестав пить и принимать пищу. Крысы, дожившие до 30 суток после имплантации глиомы С6 были крайне истощены и не реагировали на прикосновения и механические раздражения. Вследствие вышеизложенного, в экспериментальную группу по оценке проницаемости ГЭБ для MAT in vivo отбирались животные сроком 16-18 дней после имплантации глиомных клеток.
Приступая к полноценным гистологическим, морфометрическим и другим исследованиям глиомы С6 головного мозга крысы, мы проследили миграцию имплантированных глиомных клеток. С этой целью перед имплантацией в каудопутамен культивированные глиомные клетки (Рис. 1, Б) пометили витальным трейсером CFDA SE и ввели 5 крысам. Подвергнув крыс прижизненной фиксации 4%ПФ на 3-е сутки (2 крысы) и на 8-е сутки (3 крысы), оценили миграцию клеток глиомы по флюресценции в зеленой части спектра. Распространение единичных опухолевых клеток представлено на Рис. 2.
По результатам исследования (Рис. 2) инвазия опухолевых клеток становится заметной на 3-е сутки имплантации. Через 8 суток после имплантации инвазия наиболее выражена, определяются многочисленные перивазальные и пе-риневральные тяжи. Меченые CFDA SE единичные глиомные клетки обнаружились на расстоянии до 500 мкм от основного очага (Рис. 2), однако образование вторичных очагов не наблюдалось.
Культура Сб-глиомы. А. Культура глиоиных клеток на дне плашки чсреї сутки после разморозки из банка клеток. Б. Монослой клетокСб на дне плашки через 3 — 5 суток культивирования. Leiea DM1L, фазовый контраст, х200.
Флюоресценция имплантированных глиомных клеток меченных треисером CFDA SE. А. Глиома на 3-й сутки после введения, х 100; Б.,В.,Г- — 8-е сутки после введения. Голубыми стрелками показана пернвазальная инфильтрация (В); красными стрелками — отдалённые единичные глиомные кетки (Г). Б..В. х 200; Г. х 400. Картину флюоресцентного мечения сопоставляли с окрашиванием гистологических срезов с очагом глиомы толуидином и крезилвиолетом. Как уже упоминалось ранее, вследствие повышенного содержания рибонуклео-протеида глиомные клетки на срезах головного мозга крыс окрасились более интенсивно, чем нормальная нервная ткань. Окрашивание по Нисслю или толуидином позволило четко дифференцировать основной очаг опухоли, и тем самым продемонстрировать распространение опухоли по перивазальным и периневральным пространствам (Рис. 3. В, Г).
Гистолог» ческа и картина инвазии глиомы С6 на срезах. Окраска крезиловым фиолетовым и толуидиновым синим. А. Общий вид глиомы па 8-е сутки после имплантации х 100. Б. Полиморфизм ядер глиомных клеток. Масляная иммерсия х 1000. В., Г. Перивазальнан и периневральная инвазия глиомы (показано стрелками).
Погибшие ацидофильные клетки избирательно окрасились в гранатовый цвет ванадиевокислым фуксином. В результате комбинированного окрашивания VAF и толуидином хорошо визуализировалась жизнеспособная опухолевая ткань, в которой можно было обнаружить зоны центрального некроза, местами трансформирующиеся в кисты (Рис. 4. Г., Рис. 5. А.), а так Мелкие очаги некроза начинают дифференцироваться с помощью красителя с 3-х суток после имплантации глиомных клеток, а зоны центрального некроза с образованием кист наблюдаются на 16-17 сутки инвазии глиомы.
Глиомные клетки характеризовались различной формой и размерами, выраженным полиморфизмом ядер (Рис. 3. Б.). Через 28 суток инвазии глиома прорастала и разрушала базальные ядра, мозолистое тело, нижние слои коры мозга, занимая практически все полушарие. В этот период опухолевой инвазии на срезах головного мозга крыс с глиомой отчетлива выражена внутричерепная дислокация, отмечается компенсаторное уменьшение объема контралатерального полушария, трансформация некроза в объемные кисты (Рис. 4. Г, Рис. 13).
Таким образом, полученные данные гистологического исследования развития имплантированной крысам глиомы С6 сопоставимы с картиной флюоресцентного мечения, а также соответствуют гистологической картине мультиформной глиобластомы человека по литературным источникам [104, 167]. Подтвержденная гистологически активная инвазия опухоли с момента стереотаксической имплантации клеток С6 крысам создала предпосылки для иммуногистохимической оценки экспрессии ГЭБ-ассоциированных антигенов и выявления взаимосвязи морфометрических параметров глиомы с другими маркерами проницаемости ГЭБ.
Характеристика иммуноферментной тест-системы и нормальные показатели GFAP в сыворотке крови крыс
Группа животных из 12-ти лабораторных крыс с экспериментальной глиомой С6 была создана для исследования взаимосвязи объёма астроцитарного вала и концентрации GFAP в сыворотке крови. Крыс перфузировали на 3-й, 8-е и 15-е сутки (по 4 крысы на каждую точку) после имплантации. Предварительно у них отбирали кровь для иммуноферментного анализа GFAP, мозг после перфузии до-фиксировали и приготавливали толстые замороженные срезы (40 мкм) для проведения иммунофлюоресцептного анализа GFAP в области астроглиального вала с вторичными антителами, меченными Alexa 488 (Invitrogen). Также иммунофлюо-ресцентную визуализацию GFAP проводили на 21-е сутки (4 крысы основной группы, получившей инъекцию l25l-IgG и пЛ-МаЬ2В6). Крысы, получившие 1251-anti-GFAP, в этом эксперименте не участвовали, поскольку в этом случае нельзя было исключить появления артефактов. На 29-30-е сутки имплантации клеток С6 в морфометрию взяты 5 крыс из группы МРТ, дожившие до этого срока. Таким образом, определение объёма астроцитарного вала и последующий корреляционный анализ с концентрацией GFAP было проведено у 21 крысы.
Вычисление объёма астроцитарного вала проводили на микроскопе Leica DM с моторизованным предметным столиком с применением специальной программы обработки цифровых микрофотографий {Leica Microsystems) и пакета Photoshop CS {Adobe). Для определения объёма астроцитарного вала из серийных срезов мозга, содержащих глиому, отбирались 6-8 срезов, характеризующих различные участки глиомы (два «полюса», среднюю часть и «эпицентр»). Эти срезы инкубировались с поликлональными ати-GFAP антителами кролика, а затем со вторичными антителами {goat-antirabbit Alexa Fluor 488, Lnvitrogen). На малом увеличении (xl/4) с помощью моторизованного предметного столика производилась автоматическая панорамная сьёмка флюоресценции и монтирование изображения. Затем на целом изображении полуавтоматически выделяли цвет, по интенсивности наиболее соответствующий флюоресценции астроцитарного вала и оп-ределяли площадь получившегося «кольца» в мм (Рис. 24). Полученную площадь умножали на толщину срезов, наиболее близких к анализируемому изображению. Конечный объём астроцитарного вала вычислялся путём сложения полученных промежуточных обьёмов.
При количественном анализе развития астроглиального вала получены следующие данные. Относительно объёма глиомы астроглиальный вал достигал своего максимума на седьмые — восьмые сутки развития опухоли, составляя 36% её объёма (Рис. 24 В). В дальнейшем, вследствие значительного увеличения объёма глиомы, относительный размер астроглиального вала уменьшался до 19,2% и 13,5% на 14-15 и 20-21 сутки соответственно. На 30 сутки развития опухоли относительный объём астроцитарного вала сокращался вообще до 4,5%. Примечательно, что и в абсолютных значениях максимальное развитие астроглиального вала наблюдалось на 20-21 сутки (56,6 мкл). На 30-е сутки абсолютный объём астроглиального вала составлял лишь 40,7 мкл. При этом, вследствие того, что глиома занимала почти всё полушарие, в астроглиальную реакцию включалось и противоположное полушарие.
Одним из самых важных показателей модели глиомы С6 на крысах является динамика роста опухоли. Наряду с анализом выживаемости животных, динамические данные роста опухоли могут применяться в экспериментах по оценке эффективности различных терапевтических подходов. Наиболее полную информацию о динамике роста опухоли можно получить, применяя магнитно-резонансную томографию (МРТ) головного мозга крыс на разных сроках развития опухоли у одних и тех же животных.Для анализа роста опухоли мы сформировали группу из 8 крыс с экспериментальной глиомой. На 7-8, 14-15 и 24-25 сутки после имплантации этим крысам проводили МРТ-исследование на MP-томографе BRUKER Bios-pec, 7Т. Крыс наркотизировали кетамином (50 мг/кг) и седуксеном (5 мг/кг) в одном шприце, катетеризировали бедренную вену и помещали в магнитную катушку для мелких лабораторных животных. Получали ТІ- и Т2-взвешенные изображения, после чего, для точного определения объёма опухоли через катетер вводили Магневист (Gd-содержащий ТІ-контрастный агент, хорошо накапливающийся в низкодифференцированных опухолях) в дозе 0,5 мл/кг. После этого повторяли ТІ- и Т2- режимы и определяли объём опухоли по накоплению контраста в Т1-взешенном режиме. Определение объёма опухоли производили полуавтоматически в специализированной программе ImageJ 1.32 путём умножения площади опухоли, накопившей контраст, на каждом скане на толщину сканов (1 мм) и последующего сложения получившихся значений. Таким образом, на каждом из указанных сроков было проанализировано 8 животных, что обеспечило высокую достоверность полученных данных.Экспериментальная глиома С6 хорошо накапливала MP-контраст Магневист, при этом максимально контрастное изображение очага глиомы можно было получить при автоматическом вычитании из Т1-взешенного контрастированного изображения фона аналогичного изображения, полученного до введения Магневиста (Рис. 25, А, Б)
В Т2-взешенных изображениях помимо очага глиомы визуализировался пе-рифокальный туморогенный отёк, иногда распространяющийся почти на всё полушарие (Рис. 25, Г)
