Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
Иммуноферментнын анализ NSE, GFAP и МВР в СМЖ и сыворотке крови при моделировании фокальной ишемии головного мозга
1.1. Общая характеристика нейроспецифических белков 8
1.2 NSE, GFAP и МВР - маркеры повреждения нервной ткани 11
1.3. Методологические основы моделирования фокальной ишемии головного мозга 20
1.4. Экспериментальные модели фокальной ишемии головного мозга 29
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Общая схема эксперимента 45
2.2. Моделирование фокальной ишемии головного мозга 46
2.3. Оценки неврологического статуса и функционального состояния ЦНС— 2.4 Техника взятия проб спинномозговой жидкости и крови 48
2.5 Морфологический анализ 49
2.7. Твердофазный иммуноферментный анализ NSE, GFAP и МВР в биологических жидкостя 52
2.8 Радиоизотопное исследование распределения моиоклональиых антител к NSE в крови и органах крыс с ОСМА 56
2.4. Статистический анализ 58
Глава 3. Результаты исследований — 59
3.1. Динамика морфологических изменений головного мозга после односторонней окклюзии средней мозговой артерии 62
3.2. Мониторинг состояния организма и функций ЦНС после ОСМА 66
3.3. Иммуноферментный анализ нейроспецифических белков
3.3.1 Характеристика используемых иммуноферментных тест-систем — 76
3.3.2 Динамика концентраций NSE, GFAP и МВР в СМЖ и сыворотке крови крыс в течение 3-х месячного постишемического периода 77
3.4 Корреляционный анализ связи концентраций НСБ в сыворотке крови с функциональным состоянием ЦНС и морфометрическнми показателями при экспериментальном ишемическом инсульте головного мозга
3.5. Исследование возможности проникновения моноклональных антител к NSE в направлении кровь-мозг у крыс после ОСМА 98
Глава 4. Обсуждение 108
Выводы 114
Практические рекомендации 115
Список литературы 116-134
- Общая характеристика нейроспецифических белков
- Оценки неврологического статуса и функционального состояния ЦНС— 2.4 Техника взятия проб спинномозговой жидкости и крови
- Иммуноферментный анализ нейроспецифических белков
- Исследование возможности проникновения моноклональных антител к NSE в направлении кровь-мозг у крыс после ОСМА
Общая характеристика нейроспецифических белков
Нейроспецифические белки в нормальных условиях обнаруживаются в крови лишь в следовых концентрациях, однако, при повреждении нервной ткани происходит их выход в кровоток и повышается концентрация в спинномозговой жидкости. Элиминация нейроспецифнческих белков из спинномозговой жидкости происходит по двум основным путям - через пахионовы грануляции их субарахноидатыюго пространства в кровоток и через решетчатую пластину в лимфатические сосуда и, далее - в лимфатические узлы шеи [123]. Кроме указанных двух основных путей, существует потенциальная возможность выхода нейроспецифнческих белков в кровоток через поврежденный гематоэнцефалический барьер в условиях патологии, однако непосредственных подтверждений этого механизма элиминации НСБ в настоящее время не существует.
К нейроспецифическим белкам отсутствует иммунологическая толерантность, поэтому появление их в системном кровотоке или в лимфоидных органах запускает каскад иммунного ответа на эти антигены [22]. Очевидно, гго повышение концентрации нейроспецифических белков в биологических жидкостях указывает на наличие повреждения клеток ЦНС, тогда как особенности кинетики І1СБ позволяют оценить степень вовлечения иммунной системы в патологическом процесс.
Уникальные свойства НСБ позволяют использовать их в качестве клинико-диагностических критериев патологического процесса головного мозга как с позиции связи динамики их концентрации с объемом повреждения нервной ткани, так и с функциональным состоянием ЦНС. Действительно в клинической практике проводится все больше исследований НСБ в биологических жидкостях. Эти белки расцениваются как маркеры повреждения мозга при инсульте [31, 67, 73, 154, 208, 212], при травматических повреждениях [107, 117, 177, 189], после хирургических вмешательств, требующих искусственного кровообращения [122,206] или при остановке сердца [30,36,46,148, 184].
Первые публикации по исследованию НСБ в качестве маркеров повреждения нервной ткани относятся к началу 80-х годов. Использовались в основном два метода оценки концентрации НСБ - радиоиммунный и иммуноферментный.
Радиоиммуппый метод применялся различными исследователями при таких заболеваниях, как болезнь Гентингтона [142,143], опухолях различного генеза [176] и пр. Так, P.J. Marangos [142, 143], исследуя радиоиммунным методом экстракты из базальных ганглиев головного мозга больных болезнью Гентингтона, обнаружил эффект значительного понижения в них концентрации NSE, в то время как уровень белка в коре оставался практически неизменным. Marangos с соавт. предложили метод анализа NSE для маркирования жизнеспособных нейрональных систем, и объяснили эффект снижения количества NSE в экстракте из базальных ганглиев нейрональной дегенерацией, что было подтверждено морфологическими исследованиями [142, 143]. Этой же группой исследователей сообщается о повышении концентрации NSE в сыворотке крови пациентов с различными нейроэндокршшыми опухолями [176], верифицированного также с использованием радиоиммунного метода. R. Dauberschmidt с соавт. [78] применял радиоиммунный метод анализа NSE для оценки степени повреждения ГЭБ при травмах головного мозга. Уровень NSE динамически определялся в сыворотке крови и спинномозговой жидкости больных с травмами головного мозга различной степени тяжести, при этом более тяжелой клинической картине соответствовала более высокая концентрация NSE. На основании анализа кривых изменения концентрации белка в динамике патологического процесса R. Dauberschmidt с соавт. предложили использовать количественный анализ NSE для прогнозирования возможных исходов заболевания, выявив прямую корреляцию концентрации NSE в сыворотке крови и СМЖ с вероятностью смерти пострадавшего. Такой подход, по мнению авторов, может найти определенное применение в процессе первичной сортировки тяжело раненых при массовых катастрофах и авариях.
Илшунофермептный анализ NSE впервые разработали и применили К. Kato с соавт. [119, 128], которые использовали его для определения уровня данного антигена в сыворотке крови больных с нейробластомами. Достоверное повышение концентрации NSE было выявлено в сыворотке крови у пациентов с островковой опухолыо поджелудочной железы, медуллярной тиреоидной карциномой, злокачественным карцшюидом, н нейробластомой. Средний уровень этого белка в сыворотке крови здоровых людей обоего пола и различного возраста при этом был приблизительно одинаков и равнялся 5-6 нг/мл (что соответствует данным и других исследований). Максимальные концентрации NSE в сыворотке крови при этом не превышают 10-15 нг\мл [21].
В 1983 Mokuno [157] впервые применил NSE в качестве маркера нейроналыюго повреждения при ишемическом инсульте. Им исследовался уровень NSE и S-100 в острый период церебральной ишемии головного мозга человека. Было показано, что концентрация NSE СМЖ колебалась в пределах 9,9 ± 6,2, S-100 - в пределах 1,4 ± 1,4 нг/мл, и обе концентрации достоверно отличались от контрольного уровня. Такое, заключает автор, повышение концентрации NSE и S-100 в спинномозговой жидкости напрямую указывает на наличие гибели нейронов и глиальных клеток.
Следующим этапом исследований стал поиск связи повышения концентрации NSE с объемом ишемического поражения нервной ткани и функциональным состоянием ЦНС. Так, F.C. Вагопе с соавт. [44] наблюдал повышение концентрации NSE в сыворотке крови больных с ишемическими инсультами, причем концентрация NSE прямо коррелировала с тяжестью инсульта. Показано, что подъем NSE в сыворотке крови коррелирует со степенью неврологических нарушений, оцененных по неврологическим шкалам (Ранкина, NIHSS), тем самым NSE является надежным маркером степени нейроналыюго повреждения.
V. Bonhomm и соавт. [57] рекомендовали использование иммуноферментпого анализа NSE для оценки функционального состояния нейронов на различных стадиях патологического процесса. Этой группе авторов впервые удалось достоверно показать прямую корреляционную зависимость между концентрацией NSE в сыворотке крови и объемом ишемического поражения ткани мозга. Выводом этой работы была рекомендация применения динамического мониторинга NSE в плазме или сыворотке крови как диагностического и прогностического критерия степени повреждения нейронов при ишемии мозга. Авторы впервые показали, что количественный анализ NSE в данной ситуации может являться объективным диагностическим критерием, позволяющим судить об эффективности проводимой терапии.
Дальнейшие исследования были направлены на сопоставление динамики NSE в острой стадии ишемического инсульта не только со степенью неврологических нарушений, но и с исходом заболевания [167, 187, 208]. Так, Schaarschmidt с соавт. [187] оценивал концентрацию NSE в сыворотке крови пациентов в течение 10 суток с момента развития ишемического инсульта. Повышение уровня NSE коррелировало с тяжестью ишемического инсульта, оцениваемое по шкале ком Глазго. Корреляционный анализ не выявил связи между объемом инфаркта головного мозга и концентрацией NSE в сыворотке крови. Тем не менее, полученные результаты позволили, во-первых, прогнозировать летальный клинический исход заболевания при превышении концентрации NSE уровня в 120 нг/мл. Во-вторых, выявлена определенная фазность выхода NSE в системный кровоток: вслед за первичным - на 1-е сутки - выходом NSE, обусловленным очевидно первичным ишемическим повреждением нервной ткани, следовало повторное повышение концентрации NSE в сыворотке крови на 2-3 сутки с момента возЕїикновения ишемии, связанное с нарастанием неврологической симптоматики. Наконец, на 4-8 сутки после возникновения артериального тромбоза обнаруживался третий пик концентрации NSE в крови, указывающий, по мнению авторов, на наличие вторичного нейронального повреждения вследствие повышения внутричерепного давления. Более того, проведение дегидратационной терапии, направленное на уменьшение отека мозга, приводило к достоверному снижению концентрации NSE.
Оценки неврологического статуса и функционального состояния ЦНС— 2.4 Техника взятия проб спинномозговой жидкости и крови
Эффективность экспериментального моделирования фокальной ишемии мозга определяется степенью адекватности выбранной модели клинической ситуации, наличием контрольных групп животных и тщательностью мониторинга физиологических функций у них (артериального давления, рН, уровня глюкозы и газового состава крови, температуры головного мозга при операции, температуры тела в период операции и при выходе из наркоза, веса тела в послеоперационном периоде) [63, 90, 99, 129, 207]. Решающее значение имеет правильный выбор критериев и методов оценки патологического процесса на тканевом и организменном уровнях. Поскольку упомянутые методы являются универсальными, целесообразно дать их краткую характеристику перед анализом конкретных экспериментальных моделей фокальной ишемии мозга
Гистоморфологичсская оценка повреждения головного мозга Течение и прогноз фокального ишемического поражения мозга во многом определяются размерами зоны ишемического инфаркта, вовлечением в патологический процесс определённых отделов мозга. Поэтому гистоморфологическая верификация очага повреждения (размеры, локализация инфаркта и степень перифокальных изменений ткани мозга) присутствует практически во всех экспериментальных работах по фокальной ишемии мозга.
Морфологически развитие ишемического повреждения ткани мозга у человека и экспериментальных животных не имеет существенных качественных различий. Ишемические цитоморфологические изменения нейронов, астроцитов, олигодендроцитов и микроглии носят неспецифический характер и подробно описаны [97, 199]. К высокоинформативным методам анализа относится иммуногистохимическая идентификация нейральных клеток с помощью антител к антигенам мозга, в частности: микротубуло-ассоциировашюму протеину 2 для выявления нейронов, дендритным клеткам (0X62), микроглии/макрофагам (0X42), комплексу гнстосовместнмости II класса (0X6), [134], глиофибрилярному кислому протеину для выявления астроцитов [97] и ED-1 -микроглии [43].
Установлены общие патоморфологические закономерности возникновения развития и последующей организации ишемического инфаркта [9, 132]. В ишемизированной области различают зону некроза (паннекроза или селективного некроза - в зависимости от глубины ишемии) и зону обратимых изменений (пенумбра). К концу первых - началу вторых суток начинается миграция полиморфноядерных лейкоцитов в зону поражения и глиальная реакция с пролиферацией микроглии и астроцитов, наиболее выраженные на границе с очагом (т.н. глиомезодермальный вал). В течение последующих нескольких суток наступает расплавление пекротизированных масс поглощение, удаление пейрального дебриса фагоцитами. К 7-10 суткам на месте инфаркта начинает образовываться полость или глиомезодермальный рубец [9, 163].
Для оценки эффективности моделирования фокальной ишемии мозга большинство исследователей применяют морфометрический анализ зоны ишемического повреждения. Имеются некоторые особенности технологии морфометрии инфарктов различной локализации. При глубоких инфарктах, распространяющихся и на подкорковые области (проксимальная окклюзия СМА), используют серийные окрашенные коронарные срезы мозга на 2-4 сутки после окклюзии СМА, когда некротическая зона достаточно чётко отграничена от здоровых тканей грануляционным валом. Обычно срезы окрашивают гемотоксплином и эозином, фусцином/крезилом фиолетовым, Luxol Fast Blue, иногда применяют окраску Kluver-Barera. Широко используется метод отпечатков с использованием 2,3,5-трифенилтетразолина хлорида (далее ТТХ) [213]. Последний основан на эффекте селективного прокрашивания зоны инфаркта при экспозиции срезов или целого мозга в течение 60 минут при комнатной температуре в 2% растворе ТТХ. При этом возникает эффект «негатива», когда зона инфаркта окрашивается в красный цвет, а интактная ткань не воспринимает краситель и остается обесцвеченной. Технология определения объема инфаркта сводится к измерению площадей инфаркта на серийных срезах (обычно 5-Ю срезов на всю зону повреждения) с помощью стандартных анализирующих компьютерных программ, входящих в пакет выовера, либо в графическом редакторе (например, Photoshop — [203]). Объем инфаркта (V) вычисляется по формуле: V = XA-d, где А- сумма площадей всех срезов, d- расстояние между соседними срезами [126]. Этот способ позволяет определить, кроме объёма инфаркта, также объемы желудочков, неповрежденной ткани полушария, в котором располагается инфаркт и объем интактного полушария. Необходимость в этом возникает в случае расчета объема инфаркта в первые сутки после окклюзии СМА, когда должна быть сделана поправка, отражающая увеличение объема мозга вследствие его отека. По данным Lin она составляет 22% [139]. Предложен способ расчёта объёма инфаркта без упомянутой поправки: Vi(%) = 100 - VUD/VN., где VUD - объем неповрежденной ткани полушария с инфарктом, Уш -объем интактного полушария [41].
Для определения размеров коркового инфаркта при дистальной окклюзии СМА на поверхности мозга измеряют площадь зоны повреждения коры планиметрически с помощью стандартной сетки [69] или с помощью метода ТТХ-отпечатков [69]. Эта зона наиболее чётко отграничена от здоровых тканей на 2-4 сутки после окклюзии сосуда. Получаемая величина прямо пропорциональна объему инфаркта. Такая зависимость обусловлена особенностями кровоснабжения коры головного мозга, осуществляемого через радиальные артерии. Последние отходят под прямым углом от сосудов на поверхности мозга и проникают вглубь коры, не выходя за ее пределы, что позволяет рассчитать объем инфаркта, умножив площадь коркового повреждения на толщину коры.
Методы оценка фунщий ЦНС Для оценки функционального состояния ЦНС при ишемическом повреждении головного мозга применяется комплексный подход, включающий использование методов, направленных на обнаружение неврологических, двигательных расстройств (неврологического дефицита) и нарушений в сфере высшей нервной деятельности (поведение). При анализе результатов таких исследований важно учитывать временной фактор, поскольку имеются весьма существенные различия в информативности тех или иных тестов на различных сроках с момента создания фокальной ишемии.
Неврологический статус
Неврологические расстройства у крыс появляются с первых суток после создания фокальной ишемии головного мозга и наблюдаются в течение не более одного месяца, т.е. к концу 4 недели постоперационного периода происходит практически полный спонтанный регресс неврологической симптоматики [37, 38, 48, 58, 147]. В настоящий момент широко применяется несколько шкал оценки неврологического статуса, в частности, шкалы Bederson, Menzies, Hirakawa [48, 112, 151]. Приводим здесь наиболее часто используемую шкалу Menzies (1992) [151]: 0 баллов - отсутствие дефицита; 1 балл -тоническая флексия передней контралатералыюй лапы при подъёме крысы за хвост; 2 балла - у крысы, помещенной на горизонтальную поверхность, при потягивании за хвост контралатеральная передняя лапа оказывает меньшее сопротивление пассивному движению; 3 балла - движение в контралатеральную сторону при удержании крысы за хвост; 4 балла - спонтанное вращение крысы на горизонтальной поверхности в контралатеральную сторону.
Иммуноферментный анализ нейроспецифических белков
Обнаружение повышенных количеств НСБ за «пределами» паренхимы мозга (в СМЖ и в сыворотке крови) прямо указывает на повреждение нервной ткани и позволяет дать селективную оценку состояния того или иного вида нервных клеток, динамики клеточной дегенерации в ЦНС. Имеется обширная литература, свидетельствующая о резком увеличении концентраций НСБ в ликворе и крови сразу после острого ишемического повреждений ЦНС [121]. Показана прямая корреляция уровней НСБ с объёмами повреждения нервной ткани и нарушением функций ЦНС [107, 208]. Вместе с тем клинические и экспериментальные исследования ишемического инсульта свидетельствуют о том, что вслед за острым повреждением нервной ткани развивается хронически текущий нейродегенеративный процесс [38, 56, 84]. При этом исследованию динамики концентраций НСБ в биологических жидкостях посвящены лишь отдельные работы, не позволяющие детально охарактеризовать параметры элиминации НСБ в СМЖ и периферический кровоток в хронической стадии патологического процесса в ЦНС [14]. Поэтому для решения указанных задач было проведено экспериментальное исследование на модели ишемического инсульта.
Моделирование фокальной ишемии головного мозга по методу Tamura в модификации Bederson а позволила получить стандартный воспроизводимый инфаркт головного мозга (см. рис. 5). Величина объема инфаркта согласовалась с данными литературы, базирующимися на работах, выполненных с применением той же модели [25, 99, 193]. Подробный морфологический анализ показал, что помимо качественных изменений зоны ишемического повреждения - эволюции инфаркта - с течением времени имелась количественная динамика ряда морфометрических показателей. На протяжении 3-х месяцев после операции отмечалась тенденция к уменьшению объема неповрежденной зоны ишемизированного полушария относительно объема правого полушария (Vs / V j), что могло быть обусловлено постепенным снижением числа структурных элементов нервной ткани (см. рис. 10).
Таким образом, выявлена определенная динамика морфологических изменений головного мозга в течение постишемического периода, свидетельствующая о наличии незатухающих процессов структурной перестройки головного мозга после фокальной ишемии. Снижение отношения объема неповрежденной зоны левого полушария к объему правого полушария указывает на хроническую нейродегерацию, обнаруживаемую даже при достаточно грубом морфометрическом анализе. Это позволило приступить к следующему этапу исследований - оценки нарушений функций ЦНС в течение 3-х месяцев постишемнческого периода.
Для оценки функционального состояния ЦНС при экспериментальном ишемическом инсульте головного мозга применен комплексный подход, включающий в себя использование методов, направленных на обнаружение неврологических расстройств, двигательной асимметрии и нарушений в сфере ВНД (см. рис. 12, 13, 16, 18). Наши результаты неврологического тестирования соответствуют данным других исследователей о том, что неврологические нарушения крыс с ОСМА в большей своей массе самопроизвольно восстанавливаются к середине второго месяца постишемнческого периода [38, 58, 151]. Двигательная асимметрия, выявляемая полуколичествениым бальным способом (шкала Menzies a) полностью компенсируется в течение первых 2-3-х недель после операции. Поэтому необходимо было применить объективный нагрузочный тест, который бы позволил выявлять двигательную асимметрию в течение длительного послеоперационнного периода. Для это был разработан и внедрен К-тест, в котором субанестетические дозы кетамина приводили к ипсилатеральной по отношению к пораженному полушарию вращательной асимметрии. Подобная асимметрия сохранялась в течение, по крайней мере, 3-х месяцев наблюдений, хотя имелась тенденция к её уменьшению к концу эксперимента. По данным литературы [218] известно, что кетамин в субнаркотических дозах активирует определенные зоны и структуры головного мозга крысы. Так, Zukin [218] продемонстрировал радиоавтографическим методом активацию обонятельной коры и гипокампа крыс, которым вводился кетамин в дозе 50 мг/кг. При этом животные испытывали двигательное возбуждение, что было обусловлено по заключению авторов [218] со связыванием кетамина с фенциклидиновым сайтом NMDA-рецепторов. Очевидно, что при одностороннем поражении значительной части головного мозга происходит асимметричная активация указанных структур, и возникает двигательная асимметрия за счет избыточного возбуждения интактного (неишемизированного) полушария.
Параллельно с исследованием неврологического статуса и двигательной асимметрии проведено наблюдение нарушений двигателыю-координаторной сферы в тесте «ротород» и ВИД в тесте «пассивное избегание». Анализ динамики исследованных показателей после ОСМА показал, что двигательно-координаторные нарушения (время удержания на вращающемся стержне) и изменения в когнитивной сфере (тест пассивного избегания) сохраняются у крыс с фокальной ишемией в течение 3-х месяцев.
Проведенный мониторинг двигательных, координаторных и когнитивных нарушений в течение трех месяцев постишемнческого периода свидетельствует не только о длительном изменении функций ЦНС, но и о нарастании некоторых нарушений во времени (см. рис. 20, 21). При этом имеется определенная стадийность изменений различных функций ЦНС на разных сроках постпшемнческого периода. Так, неврологический дефицит обнаруживается наиболее рано и, в то же время, он достаточно быстро (конец 3-ей недели) частично восстанавливается. Вращательная асимметрия (К-тест) и двигательно-координаторные расстройства (тест Ротород) наиболее четко проявляются со второй недели и до конца второго месяца после операции, тогда как нарушения ВИД (тест пассивного избегания) сохраняются на всем исследуемом периоде. Наиболее выраженные и длительные изменения обнаруживались при оценке состояния ВНД. Выявляемое достоверное нарушение условного торможения спуска с платформы в step-down варианте теста пассивного избегания указывает на поражение долговременной памяти и связано с ишемическим повреждением стриатума при проксимальной ОСМА.
Корреляционный анализ выявил достоверную связь между изменениями ВНД, кетамин-индуцированной вращательной асимметрией и двигательно-координаторными нарушениями в хронической стадии ишемии головного мозга, что свидетельствует о функциональном поражении головного мозга при моделировании обширного очага инфаркта нервной ткани.
Таким образом, разработана батарея инструментальных тестов, позволяющая проводить объективную оценку нарушений функций ЦНС в течение 3-х месяцев после окклюзии средней мозговой артерии и перейти к иммунохимическому исследованию хронического нейродегенеративного процесса.
Анализ результатов иммунохимических исследований выявил определенные особенности выхода НСБ в СМЖ и кровь после ОСМА (см. рис. 34, 35). Концентрация NSE и GFAP была максимальной на 1-е сутки после операции, что очевидно связано с первичным ишемическим повреждением нервной ткани. Затем после падения уровня этих НСБ происходил отсроченный повторный пиковый подъем концентрации NSE и GFAP в крови на 14-е сутки после операции. Динамика концентрации МВР также имела некоторые особенности. Концентрации МВР в СМЖ и сыворотке крови постепенно повышалась, начиная с первых суток, достигнув пикового значения в сыворотке крови также на 14-е сутки постпшемнческого периода. Следовательно, нами выявлен эпизод отсроченной острой нейродегенерации, которая развилась уже после завершения морфологической организации зоны инфаркта. В дальнейшем концентрации всех НСБ несколько снизились и сохранялись на достоверно более высоком уровне, чем у контрольных крыс с ЛОСМА, в течение 3-х месяцев (см. рис. 34 и рис. 35), а концентрация МВР даже имела тенденцию к возрастанию в конце эксперимента
Исследование возможности проникновения моноклональных антител к NSE в направлении кровь-мозг у крыс после ОСМА
Повышение уровней содержания НСБ в сыворотке крови было связано с динамикой морфометрических показателей головного мозга и нарушениями функции ЦНС. В частности, имела место сильная корреляционная связь между величиной концентрации НСБ и постинсультным дефицитом ткани ишемизированного полушария. В постишемическом периоде изменения концентрации NSE наиболее длительно коррелировали с когнитивными нарушениями, выявляемыми в тесте пассивного избегания, МВР - с двигательными и координаторными нарушениями, обнаруживаемыми в К-тесте и ротороде, промежуточное положение занимала корреляционная связь для изменений концентрации GFAP (см. рис. 40). Тем самым, повышение уровня НСБ отражает, связанные с ним поражение функции ЦНС и морфологические изменения нервной ткани в течение 3- месяцев постишемического периода.
Исследование концентрации нейроспецифических белков позволило объективно и специфично оценить динакику нарушений головного мозга на клеточном уровне в течение длительного постишемического периода. Выявлены определенные закономерности изменений уровней NSE, GFAP и МВР в сыворотке крови и спинномозговой жидкости. Важным оказалось выявление волнообразного статистически значимого повышения концентрации этих белков в сыворотке крови в хронической стадии ишемии головного мозга, когда процесс первичного повреждения нервной ткани уже завершился. Это непосредственно подтверждает наличие хронического неиродегенератнвного процесса при моделировании фокальной ишемии головного мозга, выявленного ранее с помощью морфометрического анализа и мониторинга функций ЦНС.
Определение НСБ в биологических жидкостях приобретает всё большее клиническое значение [121]. Повышение содержания НСБ в сыворотке крови традиционно рассматривается в качестве критерия повреждения отдельных видов нервных клеток, в частности, нейронов, астроцитов и олигодендроцитов [121, 135]. Вместе с тем теоретически оправдано полагать, что уровень (концентрации) НСБ в сыворотке крови зависит не только от параметров поступления НСБ нз погибших нервных клеток в центральный кровоток, но, очевидно, н от интенсивности метаболизма (утилизации) НСБ как в самом мозге так и за его пределами (связывание дендритными клетками и макрофагами, деградация НСБ тканевыми протеазами). Из этого следует, что повышение уровня НСБ в сыворотке крови возможно не только при активном иейродегенеративном процессе в паренхиме мозга, но и при отсутствии последнего, в частности при с низкой интенсивности инактивации этих антигенов в крови и тканях организма. Результаты наших экспериментальных исследований показали, что после ОСМА отношение концентраций НСБ в СМЖ к таковым в сыворотке крови (Cf/Cs) претерпевало о существенные отклонения от уровня физиологического баланса НСБ, свидетельствующие о снижении интенсивности инактивации НСБ в организме в процессе развития хронического нейродегенеративного процесса (см. рис. 36).
Итак, иммуноферментный анализ в спинномозговой жидкости и в сыворотке крови концентраций иейроспецифических белков нейронов (NSE), астроцитов (GFAP) и олигодендроцитов (МВР) в процессе эволюции ишемического инфаркта головного мозга у крыс после ОСМА показал, что помимо первичной альтерации ткани мозга происходит повторное повреждение нервных клеток. Этот эпизод дегенерации нервных клеток отсрочен на две недели и протекает на фоне завершенной структурной организации инфаркта мозга с образованием рубца и кисты. В дальнейшем иммунохимически верифицируется хронический нейродегенеративный процесс, сопровождающийся систематическим выходом иейроспецифических антигенов в периферический кровоток и нарушением механизма элиминации НСБ из паренхимы мозга. Полученные данные вполне укладываются в схему типичного иммунного ответа организма на антигенную нагрузку вследствие выброса в кровоток после ОСМА «забарьерных» иейроспецифических белков. Включение в патологический процесс аутоиммунных механизмов после первичного ишемического повреждения нервной ткани следует отнести к одной из продуктивных гипотез. Возможность развития аутоиммунной агрессии подтверждается известными данными о нарушении функционирования ГЭБ в острой и подострой стадиях ишемического инсульта [22] , способствующее проникновению в паренхиму мозга специфически активированных клеток иммунной системы и антител к пейроспецифическим антигенам, к которым, как известно, отсутствует иммунологическая толерантность.
Для дальнейшего подтверждения участия иммунной системы в повреждении нервной ткани при экспериментальном ишемпческом инсульте была исследована возможность проникновения моноклональных антител к пейроспецифическим белкам в головной мозг при фокальной ишемии.
Обнаружено, что 125I-IgGl и 125I- Mab NSE, введенные внутривенно сразу после ОСМА, практически с одинаковой интенсивностью проникают в мозг. В дальнейшем динамика меченных препаратаов существенно различалась. Неспецифические иммуноглобулины элиминировались из ткани головного мозга через 48 часов после ОСМА, тогда как, специфические моноклональные антитела к NSE фиксировались в нервной ткани в течение двух суток постишемического периода (см. рис. 49).
Анализ результатов распределения метки в органах при введении I- Mab NSE позволили установить факт Mab NSE в ткани головного мозга при сравнении с другими органами (см. рис. 49). О специфическом захвате Mab NSE тканью мозга свидетельствуют данные об одновременном снижении концентрации соответствующей метки в крови и повышении ее в ткани мозга, чего не наблюдалось при введении неспецифических Ig. Показано, что эти процессы не связаны с различиемя кинетики изучаемых препаратов в крови, в частности, с более высокими уровными распределения и элиминации 125I- Mab NSE.
При авторадиографическом исследовании продемонстрировано активное накопление 125I- Mab NSE в зоне ишемического повреждения (см. рис. 50). Вместе с тем, исследование радиоактивности метки в неишемизированных отделах головного мозга мозга выявило достоверное накопление её в контралатеральном, неповрежденном полушарии и мозжечке как при введении IgG, так и Mab-NSE, однако накопление специфических антител было в несколько раз интенсивне (см. рис. 51, 52).
Таким образом, результаты исследования позволили выявить феномен прорыва Mab NSE в мозговую паренхиму крыс с экспериментальным ншемическим инсультом, при котором наблюдалось селективное накопление и задержка элиминации из ткани мозга. Установлено, что в эти процессы вовлекаются не только ишемизированное полушарие головного мозга, но и его отделы, не подвергавшиеся такому воздействию.
Итак, в представленной работе верифицирован хронический нейродегенеративный процесс при экспериментальном ишемическом инсульте головного мозга крысы с помощью иммуноферментного анализа NSE, GFAP и МВР, проведено сопоставление профилей НСБ с результатами объективного мониторинга функций ЦНС и морфометрического анализа головного мозга в течение 3-х месяцев постишемического периода. Очевидно следующий необходимый этап исследований - это экстраполяция полученных данных на человека и проведение серии клинических работ в хронической стадии ишемического инсульта. Кроме того, другим направлением исследований может стать разработка способов направленного транспорта в мозг биологически активных веществ нового поколения с использованием моноклональных антител Mab к НСБ в качестве специфических векторов.
