Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Общая характеристика болезни Паркинсона 13
1.1.1. Клиническая картина болезни Паркинсона 13
1.1.2. Классификация болезни Паркинсона 15
1.1.3. Нейропатология и течение болезни Паркинсона 17
1.2. Генетические причины развития болезни Паркинсона 20
1.2.1. Гены моногенных форм болезни Паркинсона 22
1.2.1.1. Ген альфа-синуклеина (SNCA) 22
1.2.1.2. Ген паркина (PARK2) 24
1.2.1.3. Ген PTEN-индуцируемой протеин киназы (PINK1)... 26
1.2.1.4. Ген белка DJ-1 (PARK7) 27
1.2.1.5. Ген дардарина (LRRK2) 28
1.2.1.6. Ген С-концевой убиквитин-гидролазы 1 (UCHL1)... 30
1.2.1.7. Ген АТФазы 13 А2(АТР13А2) 31
1.2.2. Генетический анализ болезни Паркинсона как ключ к этиопатогенезу заболевания 32
1.3. Использование ДНК микрочипов при изучении болезни Паркинсона 41
1.4. Анализ изменения транскриптома при болезни Паркинсона 47
1.4.1. Анализ экспрессии генов в тканях головного мозга 47
1.4.2. Анализ экспрессии генов в периферической крови 53
1.5. Современные подходы к диагностике ранних стадий болезни Паркинсона 56
1.5.1. Нейровизуализационные методы исследования 57
1.5.2. Идентификация нарушений обоняния 59
1.5.3. Парадоксальный сон без мышечной атонии 61
1.5.4. Обстипация как маркер ранних стадий болезни Паркинсона 64
1.5.5. Биохимические маркеры в гуморальных средах 65
1.5.6. Молекулярно-генетические подходы к клинической и доклинической диагностике болезни Паркинсона 71
Глава 2. Материалы и методы 75
2.1. Общая характеристика анализируемых выборок 75
2.2. Молекулярно-генетические методы анализа 76
2.2.1. Выделение геномной ДНК и тотальной РНК из цельной крови человека 76
2.2.2. Анализ экспрессии генов SLC6A3, GSK3B, МАРТ, PARK2, SNCA,ST13 77
2.2.2.1. Полимеразная цепная реакция обратной транскрипции 77
2.2.2.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени... 79
2.2.3. Анализ ДНК-микрочипов с использованием технологии APEX 80
2.2.3.1. Полимеразная цепная реакция 80
2.2.3.2. Очистка и концентрирование продуктов ПНР 82
2.2.3.3. Фрагментация продуктов ПНР 82
2.2.3.4. Полимеразная реакция удлинения праймера на микрочипе 83
2.2.4. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов в гене LRRK2. 85
2.2.4.1. Полимеразная цепная реакция и гидролиз продуктов ПЦР специфическими рестрикционными эндодезоксирибонуклеазами 85
2.2.4.2. Анализ продуктов ПЦР и продуктов гидролиза ампликонов методом электрофореза в агарозном геле 86
2.2.5. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов в генах PARK2, SNCA, WNT3 87
2.2.5.1. Полимеразная цепная реакция в реальном времени... 87
2.3. Статистическая обработка результатов 88
Глава 3. Результаты и обсуждение 90
3.1. Анализ точковых мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в генах при болезни Паркинсона 90
3.1.1. Анализ точковых мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов с помощью ДНК-микрочипа 90
3.1.2. Анализ отобранных однонуклеотидных полиморфизмов в генах LRRK2 и PARK2 100
3.1.3. Анализ дополнительных однонуклеотидных полиморфизмов в генах SNCA и МАРТ 104
3.2. Анализ изменения экспрессии генов GSK3B, SLC6A3, МАРТ, PARK2,SNCA,ST13 106
3.2.1. Анализ изменения экспрессии генов SLC6A3, МАРТ и PARK2 110
3.2.2. Анализ изменения экспрессии генов GSK3B, SNCA и ST13 113
3.2.2.1. Анализ изменения экспрессии гена GSK3B 113
3.2.2.2. Анализ изменения экспрессии гена SNCA 115
3.2.2.3. Анализ изменения экспрессии гена 5773 118
Заключение 121
Выводы 124
Список литературы 125
- Нейропатология и течение болезни Паркинсона
- Использование ДНК микрочипов при изучении болезни Паркинсона
- Полимеразная реакция удлинения праймера на микрочипе
- Анализ отобранных однонуклеотидных полиморфизмов в генах LRRK2 и PARK2
Введение к работе
Стремительный прогресс в области технологий и накопление большого объема данных о строении и работе как отдельной клетки, так и всего организма в целом в последние десятилетия привели к активному развитию новых дисциплин в области молекулярной генетики, таких как геномика и протеомика. Одним из важнейших направлений геномики является медицинская геномика, которая занимается определением генных дефектов при наследственных и других болезнях, изучением экспрессии мутантных генов и разработкой новых методов диагностики, лечения и профилактики. Особый интерес в этом направлении представляет изучение молекулярно-генетических основ нейродегенеративных заболеваний. Это связано с тем, что изучение этой группы болезней позволяет выявить и охарактеризовать новые экспрессирующиеся в нервной системе гены, что существенно расширит генетическую базу, закладывающую основы изучения молекулярных принципов функционирования нервной системы.
К числу тяжелых неврологических патологий относится болезнь Паркинсона (БП), которая является вторым по распространенности (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративным заболеванием человека. Это мультисистемное хроническое медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, связанное с нарушением деятельности базальных ганглиев головного мозга. В настоящее время полагают, что в основе БП лежит дегенерация или дисфункция дофаминергических нейронов в черной субстанции. Отличительной особенностью болезни Паркинсона является то, что характерные для заболевания клинические признаки проявляются при гибели приблизительно 60% дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции и 80%-ном снижения уровня дофамина в полосатом теле.
С генетической точки зрения БП является гетерогенным заболеванием. В 10-15% случаев заболевание может наследоваться по моногенному аутосомному типу, но в большинстве случаев носит спорадический идиопатический характер и обусловлено сложным взаимодействием между генетическим строением организма и факторами окружающей среды. Активное изучение молекулярных основ развития моногенных форм БП позволил идентифицировать семь генов (PARK2, SNCA, PINK1, PARK7, LRRK2, UCHL1, АТР13А2), вовлеченных в их патогенез. Это позволило расширить представления об этиопатогенезе заболевания и начать более целенаправленную работу по изучению генетических факторов более частой спорадической формы БП. Так в настоящее время показано, что мутации в гене PARK2 вносят существенный вклад в развитие спорадической формы этого заболевания особенно с ранним началом его развития. Полученные данные' говорят о необходимости продолжения такого рода работ и изучения мутаций и полиморфизмов генов моногенных форм заболевания у больных со спорадической формой болезни Паркинсона. Кроме того, выявлен ряд потенциальных кандидатных генов {SLC6A3, МАРТ, ST13, GSK3B, GBA и др.), которые могут быть вовлечены вовлеченных в патогенез БП и влиять на риск его развития. Однако вклад этих генов, а также мутаций и полиморфизмов в них в патогенез спорадической формы БП изучен не до конца. В последнее годы также начаты работы по изучению транскриптома при БП в post mortem тканях мозга на поздних стадиях заболевания. Однако для выявления всех патогенетических процессов, протекающих при БП необходимо изучать изменения экспрессии генов-кандидатов на разных стадиях заболевания и в первую очередь на самых ранних (доклинических). Основная проблема при проведении таких исследований - недоступность тканей головного мозга человека на ранних стадиях заболевания. В то же время оценку относительных уровней мРНК исследуемых генов можно проводить в периферической крови, самой доступной ткани человека.
Проведение работ по анализу полиморфизмов и мутаций генов, вовлечённых в патогенез БП, а также изменения экспрессии генов-кандидатов позволит с одной стороны лучше понять причины и механизмы развития этого заболевания, а с другой стороны разработать молекулярно-генетические тесты для определения риска развития БП и её ранней диагностики. Возможность проведения доклинической диагностики этого заболевания позволит начать разработку принципов и подходов профилактического лечения в тот момент, когда дегенерация дофаминэргических нейронов находится на ранней стадии и затронула лишь ограниченное число нейронов этого типа. Осуществление этой работы позволит разработать в дальнейшем новые методы терапии, которые могли бы замедлить (если не остановить) развитие патологических процессов в нервной ткани и тем самым сдвинуть возраст клинического дебюта. заболевания на более поздний срок и снизить его клиническую тяжесть.
Цели и задачи работы.
Целью настоящей работы являлись поиск и анализ генетических и экспрессионных маркеров риска развития болезни Паркинсона в российской популяции.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Анализ точковых мутаций в генах, вовлечённых в патогенез БП, у пациентов с семейной и спорадической формами БП с ранним и поздним началом развития заболевания из России.
Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генах, вовлечённых в патогенез БП, у пациентов с семейной и спорадической формами БП с ранним и поздним началом развития заболевания из России.
Анализ относительных уровней мРНК генов GSK3B, SLC6A3, МАРТ, PARK2, SNCA, ST13 в периферической крови пациентов с БП из
России, находящихся на ранних стадиях заболевания, подвергавшихся и не подвергавшихся лечению, и в группах сравнения.
Научная новизна.
Впервые при анализе 68 известных точковых мутаций в генах моногенных форм БП было выявлено только три известных точковых мутаций (MIL, A82G и C253Y) в гетерозиготном состоянии в гене PARK2 у трёх различных пациентов со спорадической формой БП с ранним началом развития, что свидетельствует о малом вкладе известных мутаций в патогенез спорадической формы БП в России.
Впервые была показана ассоциация полиморфизма rs2736990 (С/Т) в гене SNCA с риском развития спорадической формы болезни Паркинсона в российской популяции. Показано, что носительство аллеля С в ОНП rs2736990 в гене SNCA повышает риск развития болезни Паркинсона в 1,70 раза.
Впервые в России был проведён анализ относительных уровней экспрессии генов GSK3B, SLC6A3, МАРТ, PARK2, SNCA, ST13, вовлечённых в патогенез БП, в периферической крови у пациентов, находящихся на ранних стадиях развития БП. Было показано, что уровень мРНК генов SLC6A3, МАРТ, PARK2 крайне низок - это усложняет их использование для анализа транскриптома при БП в периферической крови. Обнаружено, что уровни мРНК генов GSK3B и ST13 в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона на ранних стадиях не отличаются от таковых у здоровых добровольцев. Впервые было выявлено значительное увеличение уровня мРНК гена SNCA в периферической крови у пациентов с болезнью Паркинсона на ранних стадиях заболевания более чем в 5 раз, у больных церебральным атеросклерозом более чем в 2 раза и у пациентов с различными неврологическими заболеваниями в 3 раза.
Практическая значимость работы.
Установлено, что полиморфизм rs2736990 в гене SNCA ассоциирован с риском развития болезни Паркинсона и в дальнейшем может быть включён в панель маркеров для определения индивидуального риска развития БП. В будущем, результаты данного исследования могут быть использованы для создания единого комплексного генетического теста, выявляющего риск развития БП.
Установлен разный спектр направлений изменения экспрессии генов GSK3B, SNCA, ST13 у пациентов с БП и в группах сравнения. В дальнейшем эти гены могут быть включены в панель экспрессионных маркеров для диагностики БП и в первую очередь на ранних её стадиях.
Показано, что при изучении транскриптома при БП в периферической крови необходимо использовать в качестве групп сравнения больных с другими неврологическими заболеваниями и в первую очередь с церебральным атеросклерозом.
Нейропатология и течение болезни Паркинсона
Нейродегенеративные изменения при БП связаны с селективной гибелью различных типов нейронов. В первую очередь наблюдается уменьшение дофаминэргических нейронов в компактной части черной субстанции, базальных ядрах, покрышке среднего мозга. Гибель нервных клеток черной субстанции приводит к снижению уровня дофамина (ДА) в скорлупе и полосатом теле, что приводит к появлению двигательных симптомов: тремора, ригидности, и, самое главное, брадикинезии. В настоящее время считается, что характерные для БП клинические признаки появляются при гибели 60-80% дофаминэргических нейронов (ДА нейроны) компактной части черной субстанции и 80 % снижение уровня дофамина в скорлупе (Bemheimer и др., 1973, Cookson и др., 2008).
Одним из важнейших гистологических признаков БП является наличие эозинофильных фибриллярных внутриклеточных включений в телах и отростках нейронов. Это так называемые тельца Леви и нейриты Леви. Они представляют собой сферические агрегаты различных белков, жиров и полисахаридов. Основными белковыми компонентами телец и нейритов Леви являются альфа-синуклеин, нейрофиламенты, убиквитин, паркин и синфилин. Однако в настоящее время остаются неизвестными как механизмы инициации образования телец Леви, так и хронологический порядок их формирования (Beyer и др., 2009).
Еще одной характерной чертой нейродегенеративных изменений при БП является развитие у больных глиоза (Elbaz и др., 1999, Огг и др., 2002). В полосатом теле и черной субстанции наблюдается аномальное усиление пролиферации различных типов клеток глии. Ведущую роль в развитии глиоза при БП, скорее всего, играет активация микроглии, которая очень значима при воспалительных процессах.
Согласно классификации Браака последовательных стадий БП (рисунок 1) (Braak и др., 2004, Braak и др., 2003) в доклинической (премоторной, продромальной, пресимптоматической) фазе (стадии 1 и 2) патология Леви ограничивается серым веществом в двух областях -обонятельной луковице/переднем обонятельном ядре и продолговатом мозге/покрышке варолиева моста. Таким образом, ещё до появления классических двигательных симптомов при БП у больных могут развиваться неспецифические расстройства: аносмия, нарушения поведения во сне, депрессия, синдром беспокойных ног, хроническая усталость, запоры, некоторые пациенты незадолго до появления симптомов паркинсонизма бросают курить. Все эти симптомы могут служить ранними маркерами БП, которые отражают распространение нейродегенеративного процесса в эти области мозга.
Тем не менее, паркинсонический синдром развивается, когда погибает около 70% клеток черной субстанции, что соответствует 80%-ному снижению уровня дофамина в стриатуме и 3-й стадии по Брааку (рисунок 1). Основные нейродегенеративные изменения наблюдаются в первую очередь в ДА нейронах компактной части черной субстанции, базальных ядрах, покрышке среднего мозга. Изменение концентрации дофамина приводит к нарушениям метаболизма других нейротрансмиттеров (серотонина, норадреналина, ацетилхолина и глутамина). Снижение дофаминергической активности и преобладание активности глутаматной и холинергической систем в стриатуме приводит к развитию характерных для БП двигательных нарушений.
Двигательные симптомы обычно дебютируют с тремора покоя; тугоподвижности или неловкости одной конечности, постепенно вовлекая другую ипсилатеральную (на той же стороне тела) конечность, шею, туловище, и, наконец, противоположные конечности, при этом постоянно сохраняется асимметрия симптомов с преобладанием на стороне дебюта. Мышечная ригидность обычно начинается с шеи, далее распространяясь в нисходящем направлении. Стадия гемипаркинсонизма продолжается от нескольких месяцев до нескольких лет и соответствует 3,5-4 стадии по Брааку (1-1,5 стадии БП по шкале Хен и Яра). Иногда возникает двустороннее начало заболевания. По мере прогрессирования заболевания и распространения нейродегенеративного процесса на сенсорную, а затем и моторную кору больших полушарий мозга (рисунок 1) присоединяется постуральная неустойчивость, что соответствует 5-й стадии по Брааку (3 стадии болезни по шкале Хен и Яра). Именно на пятой стадии становятся особенно заметными многие недвигательные проявления БП, которые на поздних стадиях (5,5-6 по Брааку или 4-я и 5-я стадии по Хен и Яра) нередко инвалидизируют больных в большей степени, чем моторные симптомы. Как уже было сказано в части 1.1.2 Главы 1, при БП выделяют семейную и спорадическую формы. В настоящее время считается, что семейная форма заболевания наблюдается у 10-15% больных (Огг и др., 2002). У большинства больных развитие заболевания носит спорадический характер и определяется сложным взаимодействием между генетической конституцией организма и факторами внешней среды. При этом сочетание сходного генетического фона и образа жизни повышает риск развития заболевания у родственников больных спорадическим паркинсонизмом в 2-7 раз (Elbaz и др., 1999).
На данный момент в геноме человека картированно 17 локусов семейной формы БП, причём, только несколько из них ответственны за развитие заболевание в достаточно большом количестве семей (более 10). В таблице 1 приведен список картированных локусов, связанных с развитием семейных форм БП. При этом хотелось бы обратить внимание на то, что далеко не для всех локусов в настоящее время идентифицированы гены, связанные с заболеванием, а для пяти локусов окончательно не выяснен характер наследования БП. Таким образом, изучение моногенных форм БП нельзя считать законченным — возможна как идентификация генов, расположенных в картированных локусах, так и выявление новых генетических вариантов БП.
Использование ДНК микрочипов при изучении болезни Паркинсона
В 2003 году завершился многолетний проект по установлению нуклеотиднои последовательности генома человека. Для решения такой масштабной задачи потребовалась разработка новых более производительных технологий в области определения последовательностей ДНК. Технологический прогресс и накопленные знания о структуре генома привели к разработке и новых методов для быстрого анализа большого количества нуклеотидных последовательностей, таких как ДНК-чиповые технологии.
ДНК-чиповые технологии в настоящее время завоёвывают всё большую популярность. Они нашли своё применение в исследовании экспрессии генов, сайтов метилирования, альтернативного сплайсинга, слияния генов (при онкологических заболеваниях), сайтов связывания ДНК белками, сравнительной геномике, идентификации генов, анализе ОНП, определении нуклеотиднои последовательности.
Данные технологии основаны на принципе гибридизации одноцепочечных комплементарных молекул ДНК и отмывке от неспецифически связавшихся последовательностей. В результате на чипе остаются лишь полностью комплементарно связанные молекулы.
К настоящему времени разработано три основных типа ДНК-чипов: твердофазные, гелевые и чипы с микробусинами. Подложка твердофазных чипов может быть выполнена из стекла, пластика или кремния. На такой чип можно нанести тысячи или даже сотни тысяч микроскопических пятен специфичных зондов: каждое пятно содержит несколько пикомолей зонда одного вида. Твердофазные чипы производят фирмы Affimetrix, Asper BioTech. Особенность гелевого чипа является иммобилизация специфических зондов в полусферических ячейках из полиакриламидного геля, что повышает пространственную плотность зонда. Гелевые чипы разработаны в Институте молекулярной биологии РАН. Чип с микробусинами представляет собой совокупность полистиреновых микроскопических шариков, на каждом из которых иммобилизированы варианты одного специфичного зонда с двумя или более красителями (отличными от красителей на молекуле-мишени). Чипы с микробусинами являются разработкой фирмы Illumina.
Для обнаружения относительного количества связавшихся молекул-мишеней могут использоваться флуоресцентные или хемилюминесцентные красители. Как правило, такие красители химически или с помощью фермента связывают с молекулой-мишенью либо до гибридизации, либо сразу после неё. Таким образом, связанная с зондом на чипе молекула-мишень оказывается меченной красителем, который можно выявить. Очевидно, что сила сигнала напрямую зависит от количества гибридизованных на чипе молекул-мишеней. Поскольку известно расположение каждого зонда на чипе, определение молекул-мишеней - чисто, техническая задача.
Так как на чипе могут быть расположены десятки тысяч зондов, то с помощью такой технологии возможно одновременное проведение множества экспериментов. Таким образом, использование этого подхода позволило значительно ускорить и упростить многие типы исследований, и, в первую очередь, поиск ассоциаций полиморфных вариантов генов с различными заболеваниями, например, БП. Изучение таких ассоциаций проводят на довольно больших выборках популяционного контроля и пациентов, от нескольких сотен до тысяч, в рамках так называемых полногеномных исследований ассоциаций — Genome-wide association study (GWAS).
К настоящему времени проведено более десятка полногеномных исследований ассоциаций у пациентов с БП (Allen and Satten, 2009, Fung и др., 2006а, Gao и др., 2009, Latourelle и др., 2009, Lesnick и др., 2007, Maraganore и др., 2005, Pankratz и др., 2009, Srinivasan и др., 2009). Однако ассоциации во многих исследованиях, как, например, в работах Marganore и др., Latourelle и др. и Fung и др., не были статистически значимыми согласно позднее появившемуся критерию р 5-10" (Dudbridge and Gusnanto, 2008, Pe er и др., 2008). По этой причине, вероятно, их результаты не смогли повторить в ряде других работ (Allen and Satten, 2009, Evangelou и др., 2010, Sharma и др., 2009). Не исключено также, что отдельные ОНП могут быть специфичны для разных популяций, и потому результаты одних исследователей не могут быть повторены другими (Sharma и др., 2009). К тому же, несмотря на многочисленные свидетельства связи различных ОНП с развитием БП, результаты только по нескольким из них удалось независимо воспроизвести в других исследованиях (таблица 2).
Полимеразная реакция удлинения праймера на микрочипе
ДНК-чиповые технологии являются весьма перспективным подходом для поиска и определения генетических маркеров риска развития самых разнообразных заболеваний, в том числе и БП. Основная задача, которую ставят перед собой учёные в таких исследованиях, как полногеномный анализ ассоциаций или более детальный анализ генов, основанных на ДНК-чиповых технологиях, заключается в поиске генетических маркеров, которые бы показали чёткую связь маркера и развития спорадической формы БП. Это позволило бы быстро, надёжно и с малыми затратами выявлять лиц с предрасположенностью к БП из всей популяции. В рамках поиска и анализа генетических маркеров БП мы также решили изучить распределение частот генотипов некоторых ТМ и ОНП в генах, так или иначе вовлечённых в патогенез БП.
Анализ ТМ и ОНП проводился с помощью ДНК-чипа и согласно методам, описанным в частях 2.2.1.1 и 2.2.2 Главы 2. Такой анализ ТМ и ОНП с помощью ДНК-микрочипа основан на принципе гибридизации одноцепочечных комплементарных молекул ДНК, полученных в ходе предварительной ПЦР. Одновременно с гибридизацией осуществляют однонуклеотидную достройку ОНП-специфичного олигонуклеотида (зонда) терминирующим дидезоксинуклеотидтрифосфатом (ддНТФ), меченным флуоресцентным красителем. После гибридизации и достройки (так называемая реакция удлинения праймера, Arrayed Primer Extension - APEX) осуществляют отмывку от неспецифически связавшихся последовательностей и свободных ддНТФ. В результате на чипе остаются лишь полностью комплементарно связанные флуоресцентно меченые молекулы. На ДНК-чипе, используемом в настоящей работе, содержались олигонуклеотидные последовательности для анализа ТМ и ОНП в генах, представленных в таблице 4. При создании этого чипа были выбраны наиболее часто (более чем в двух семьях) встречающиеся ТМ в генах моногенных форм БП и целый ряд ОНП, расположенных в генах, вовлечённых в патогенез данного заболевания. Таким образом, мы проанализировали 68 точковых мутаций и 31 ОНП в генах PARK2, PARK7, LRRK2, PINK1, STH/Tau haplotype, МАРТ, UCHL1, NR4A2 (NURR1), PSEN1, SNCB, WFS1, РОМС. Необходимо отметить, что большинство ТМ и ОНП, представленных на чипе, располагается в генах PARK2 и LRRK2, что составляет соответственно более 58% и 19% от всех ТМ и ОНП на чипе.
Данная часть работы проводилась на двух выборках пациентов с БП с ранним началом развития, поскольку считается, что именно у этой группы пациентов генетический фактор в развитии заболевания выражен сильнее. Именно поэтому в первую выборку вошёл 21 пациент с ювенильной формой БП, наследуемой по аутосомно-рецессивному типу. Выбор именно этих пациентов для анализа ТМ и ОНП объясняется большой представленностью на чипе ТМ в гене PARK2, которые приводят к развитию семейных форм БП с ранним началом развития и быстрым прогрессированием. Во вторую выборку вошёл 41 пациент со спорадической формой БП также с ранним началом развития, поскольку считают, что к данной форме БП могут приводить мутации в гене PARK2.
Анализ данных, полученных с помощью АРЕХ-технологии, позволил нам выявить аллельные варианты ТМ и ОНП у пациентов с ювенильной формой БП и со спорадической формой БП с ранним началом.
Из 68 изученных нами ТМ мы обнаружили только три различных ТМ в гетерозиготном состоянии в гене PARK2 у трёх различных пациентов со спорадической БП с ранним началом развития. Ранее было показано, что эти три ТМ (MIL, A82G и C253Y) в гене PARK2 приводят в гомозиготном состоянии к развитию БП с наследованием по аутосомно-рецессивному типу (Hedrich и др., 2001, Oliveira и др., 2003, Rawal и др., 2003). Частоты генотипов по выявленным нами ТМ представлены в таблице 5. Частота встречаемости ТМ в гене PARK2 у пациентов с БП из российской популяции составила 0,05.
Согласно литературным данным, различные ТМ в гене PARK2 в разных популяциях (Польша, Италия, Турция, Бразилия, Куба, Северо-Западная Индия, Северная Америка, Австралия) приводят к развитию БП с ранним началом развития реже, чем делеции и дупликации экзонов в этом гене. К тому же, авторы подчёркивают, что существует большое разнообразие ТМ в гене PARK2, каждая из которых сама по себе встречается довольно редко (Abbas и др., 1999, Bertoli-Avella и др., 2005, Koziorowski и др., 2010, Sun и др., 2006, Vinish и др., 2010). Таким образом, можно предположить, что для российской популяции также характерна крайне высокая микрогетерогенность исследованных нами ТМ, и для выявления точного спектра мутаций в генах моногенных форм БП необходим ресиквенс экзонов генов моногенных форм БП и в первую очередь PARK2 и LRRK2. Подобная работа позволит установить характерный для российской популяции (или любой другой) профиль распределения ТМ в генах моногенных форм БП у пациентов как с семейной, так и со спорадической формой данного заболевания.
Нам также удалось выявить 12 ОНП (из 31 представленного на чипе) в генах PARK2, NR4A2, LRRK2 и PARK7. Частоты генотипов выявленных ОНП отражены в таблице 6. Для оценки возможного вклада выявленных нами ОНП в развитие БП мы провели сравнительный анализ распределения генотипов по этим ОНП в центральной европейской популяции (данные по популяции CEU, central Europe, из проекта по картированию гаплотипов НарМар) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) с полученными нами результатами, что также отражено в таблице 6.
Как видно из таблицы 6, частоты как аллелей, так и генотипов большинства выявленных нами ОНП для российских пациентов почти равны или совпадают с таковыми в центральной Европе (CEU). Более подробный анализ ОНП V380L и rs7966550 в генах PARK2 и LRRK2, выделенных в таблице 6 жирным шрифтом, где были обнаружены отличия в частотах распределения генотипов в русской и центральноевропейской (CEU) популяциях, приведён в части 3.1.2 этой главы.
Анализ отобранных однонуклеотидных полиморфизмов в генах LRRK2 и PARK2
Согласно последним данным полногеномных исследований ассоциаций, отражённым в части 1.3 Главы 1, далеко не последнюю роль в развитии БП могут играть ОНП в генах SNCA и МАРТ (Gandhi and Wood, 2010). Так неоднократно была показана ассоциация некоторых ОНП в гене SNCA и локусе МАРТ с риском развития данного заболевания, тем более, что эти гены вовлечены в патогенез БП. Поэтому на основе анализа работ по полногеномному исследованию ассоциаций (Edwards и др., 2010, Simon-Sanchez и др., 2009, Simon-Sanchez и др., 2009) мы выбрали ещё два ОНП в генах SNCA и WNT3, расположенном рядом с МАРТ, - rs2736990 и rs415430 соответственно. Полиморфизм rs2736990 расположен в самом длинном интроне гена SNCA, и, вероятно, может влиять на регуляцию экспрессии этого гена. Функция гена WNT3 пока неизвестна, но белок, кодируемый этим геном, относят к семейству секретируемых сигнальных белков, принимающих участие в некоторых процессах при эмбриогенезе (Liu и др., 1999). Однако, несмотря на это, полиморфизм rs415430 ассоциируют с локусом гена МАРТ.
ОНП rs2736990 и rs415430 были проанализированы на тех же выборках, что и предыдущие два (часть 3.1.2 Главы 3), с помощью ПНР в реальном времени, описанной в части 2.2.5.1 Главы 2. Для анализа этих ОНП нами были разработаны системы «праймеры-зонды» (с помощью программы Beacon designer 7.0) и подобраны соответствующие условия амплификации. Результаты, полученные нами в ходе этого этапа работы, представлены в таблице 8.
Как видно из таблицы 8, присутствие аллеля С в ОНП rs2736990 в гене SNCA достоверно повышает риск развития БП. Таким образом, нам удалось показать чёткую ассоциацию полиморфизма rs2736990 в гене SNCA с риском развития спорадической формы БП в российской популяции. Мы получили соотношение шансов OR =1,70 при доверительном интервале (95% CI) 1,17-2,48 и достоверности р = 0,01, что отражает повышение риска развития БП у носителей аллеля С почти в два раза. Распределение генотипов в популяционной выборке соответствует закону Харди-Вайнберга при Х2= 1,32 и р = 0,25 (при р 0,05 закон Харди-Вайнберга не выполняется). Кроме того, наши данные также сопоставимы с результатами полногеномных исследований Simon-Sanchez и др. и Edwards и др. (OR= 1,29 при р = 0,01, OR= 1,27 при р = 6,17хЮ"13 и OR= 1,23 при р = 2,24x10"16), полученных на больших выборках пациентов с БП (более 2000 и 1700 человек соответственно) (Edwards и др., 2010, Simon-Sanchez и др., 2009, Simon-Sanchez и др., 2009), что свидетельствует о действительном влиянии данного ОНП на риск развития БП в российской популяции.
Как уже было упомянуто выше, а также в Главе 1, разные группы исследователей сообщают, что различные полиморфизмы в локусе МАРТ влияют на риск развития БП. Так в одной из недавних работ Simon-Sanchez и др. было показано, что ОНП rs415430 в гене WNT3, расположенном в локусе. МАРТ, может влиять на риск развития БП (отношение шансов 1,34 при р = 4,5x10" ) (Simon-Sanchez и др., 2009). Поэтому мы также решили сравнить распределение генотипов этого полиморфизма у русских пациентов со спорадической формой БП и в популяционном контроле. Тем не менее, несмотря на обнадёживающие результаты Simon-Sanchez и др. (Simon-Sanchez и др., 2009), нам не удалось показать ассоциации полиморфизма rs415430 в гене WNT3 с риском развития БП в российской популяции.
Как уже было сказано в Главе 1, первые клинические симптомы БП появляются после гибели 60-80% ДА нейронов компактной части чёрной субстанции головного мозга и 80%-ого уменьшения содержания ДА в скорлупе (Bernheimer и др., 1973, Cookson и др., 2008). Однако даже в настоящее время большинство современных методов диагностики БП на ранних стадиях, особенно на доклинической, не дают возможности однозначно поставить диагноз. В связи с этим, поиск и разработка новых доступных методов диагностики пресимптоматических стадий БП, в том числе биомаркеров в крови, позволят выявлять людей, находящихся в группе риска развития БП. Далее уже в этой группе будет возможно проводить более дорогостоящие уточняющие исследования. В частности, такими маркерами БП могут быть относительные уровни экспрессии генов-кандидатов в клетках периферической крови. Поэтому нами был проведён анализ относительной экспрессии генов-кандидатов GSK3B, SLC6A3, МАРТ, PARK2, SNCA, ST13 в периферической крови в двух группах пациентов с БП на ранних стадиях, получавших лечение и не получавших его, и в трёх группах сравнения (пациенты с церебральным атеросклерозом, с различными неврологическими заболеваниями и контрольная группа здоровых добровольцев). Подбор групп сравнения осуществлялся таким образом, чтобы патогенез заболевания у пациентов из группы сравнения принципиально отличался от такового при БП, но затрагивал в основном ЦНС.
