Введение к работе
Актуальность темы.
Для развития биохимии белков в начале 21 -ого века принципиальное значение приобрело широкое применение протеомных и биоинформационных технологий [Арчаков А.И. 2000, Anderson N.G. et al. 2001; Шишкин С. С. 2002; Прим-роуз С, Тваймен Р. 2008 и др.]. Накапливающиеся результаты, представляющие собой совокупности взаимосвязанных сведений, подлежащих совместной обработке, рассматриваются как соответствующие информационные массивы, на основе которых формируются различные общие и специализированные базы данных, размещаемые в сети «Интернет». Среди них надо особо отметить в базе данных UniProt информационный ресурс, названный «Complete proteome of Homo sapiens», который к середине 2012 года включал более 70 000 аннотаций, однако из них только 25 000 аннотаций (35,2%) представляли результаты прямых исследований соответствующего белка. Таким образом, очевидно, что большая часть (64,8%) созданных аннотаций нуждается в дополнительных экспериментальных материалах, при получении которых решающую роль могут сыграть протеомные технологии и дальнейшее развитие информационных ресурсов, что свидетельствует о высокой актуальности подобных исследований.
В первой декаде 21-го века также поступательный импульс получили протеомные исследования, направленные на выявление полиморфных вариантов белков в мышечных органах и выяснение роли белкового полиморфизма при различных физиологических и патологических процессах [Yip Y. et al., 2008; Wei Y.J. et al. 2009; Manning A. et al., 2012 и др.]. Особое внимание при этом уделялось аллельным изоформам, которые характеризуются единичными аминокислотными заменами в аминокислотных последовательностях, поскольку такие замены могут приводить к изменениям функциональных свойств белка (от незначительных до полной потери функции) или не оказывать подобного влияния (так называемые «нейтральные» замены). Уже собранная обширная информация о белковом полиморфизме в различных базах данных (например, в UniProt) включает и сведения о большом числе спорных определений отдельных аминокислот в ряде позиций первичной структуры многих белков, так называемых «аминокислотных конфликтов в последовательности» (Sequence conflict). Соответственно, при исследованиях любого белка разрешение «аминокислотного конфликта» в пользу одного из вариантов представляет значительный интерес, поскольку итоговая детализация первичной структуры может оказать влияние на формирование представлений о пространственной упаковке его полипептидной цепи и других свойствах, включая функциональные особенности.
Наряду с изучением разных аспектов белкового полиморфизма и других фундаментальных проблем биохимии белков мышечных органов протеомные технологии находят все более широкое применение в разработках биомедицинских проблем, ориентированных на решение многих прикладных задач - от выявления потенциальных диагностических белковых биомаркеров, мишеней фармакологических воздействий [Cummings J. et al. 2008; Principe S. et al. 2012 и др.] до создания методов контроля за качеством различных пищевых продуктов, изготавливаемых из мышечных тканей животных [Zapata I. et al. 2009; de Almeida AM, BendixenE. 2012 и др.].
Таким образом, направленность данной работы на построение протеомных баз данных, предназначенных для изучения вопросов, относящихся к биохимии белков мышечных органов, а также для решения комплекса прикладных задач, включающих выявление потенциальных белковых биомаркеров различных форм патологии (в частности, рака простаты) в целом, определяет актуальность избранной темы.
Цель и задачи исследования.
Основной целью данной диссертационной работы стало построение отечественных биоинформационных ресурсов (баз данных, размещённых в сети «Интернет») о белках ряда мышечных органов для оптимизации поисков новых белковых изоформ и определения тканеспецифичных белковых маркеров. Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:
-
Провести изучение протеомных профилей и анализ белкового полиморфизма в различных мышечных органах человека, а также некоторых культивируемых клеточных линиях, направленных на выявление изоформ с единичными аминокислотными заменами.
-
Изучить биохимические проявления дифференциальной генной экспресии при клеточной дифференцировке и в онтогенезе мышечных органов человека.
-
Разработать общие принципы построения многомодульных протеомных баз данных и создать на их основе отечественную базу данных «Протеомика мышечных органов» для определения тканеспецифичных белков и анализа белкового полиморфизма в различных мышечных органах человека.
-
Сформировать новую версию отечественной базы данных «Протеомика рака простаты», включающую комплексные модули, обобщающие результаты проте-омного анализа отдельных белковых препаратов, для определения потенциальных биомаркеров этого заболевания
-
Провести с помощью построенных протеомных баз данных поиск так называемых безымянных (unnamed), гипотетических (hypothetical) и других малоизу-
ченных белков в образцах тканей и культивируемых клеточных линиях человека.
6. Разработать на основе протеомных исследований метод, пригодный для контроля качества мясной продукции по белковому составу с определением видовой специфичности мышечных белков и выявлением белковых добавок немышечного происхождения.
Научная новизна.
В ходе протеомных исследований в тканях мышечных органов и культивируемых клетках человека выявлены различные варианты биохимического полиморфизма белков, обусловленные единичными аминокислотными заменами (single amino acid substitution, SAAS), включая новый вариант триозофосфатизо-меразы 1 (SAAS 233G—»D), определены частоты встречаемости в славянских выборках аллельных вариантов с SAAS 41Е—»А АЗ,5-А2,4-диеноил-коэнзим А изомеразы и мышечной енолазы с SAAS 71 N—» S, а также разрешены в одну из сторон «конфликтные» определения (по 135 позициям) в аминокислотных последовательностях 59 белков человека.
На основе специально разработанных общих принципов построения многомодульных протеомных базы данных сформирована новая версия отечественной базы данных «Протеомика мышечных белков человека», содержащая новые комплексные модули «Белки миокарда» и «Белки миобластов», а также новая версия (2012 г.) отечественной базы данных «Протеомика рака простаты», содержащая новый комплексный модуль «Белки клеток DU-145», в котором обобщены результаты протеомного анализа суммарных белков этих клеток и отдельных белковых препаратов (ядерные белки, гистоны, фосфопротеины), включая сведения о 78 идентифицированных белках.
Получены новые данные, прямо подтверждающие существование пяти безымянных белков (продуктов локусов ВАС05360, BAG63245, ВАН11721, BAG53005, ВАС05009, зарегистрированных в GenBank) в образцах ряда тканей и клеточных линиях человека.
В биоптатах предстательной железы человека, а также в культивируемых клетках линии DU-145 выявлено семь укороченных белковых продуктов, которые соответствуют белкам человека, предсказанным ранее по материалам исследований геномной ДНК и/или соответствующих мРНК; таким образом, впервые обнаружено существование особых укороченных изоформ у некоторых известных белков (тропомиозина 3, поли (А) связывающего белка 1, фосфоглюкомута-зы 3 и др.).
Научно-практическая значимость.
Сформированные отечественные информационные ресурсы «Протеомика мышечных белков человека» (версия 2012 г., ) и «Протеомика рака простаты» (версия 2012 г., ) доступны пользователям сети Интернет и позволяют оптимизировать соответствующие протеомные исследования, направленные на поиски потенциальных белковых биомаркеров тканевой специфичности. База данных «Протеомика рака простаты» включена в Государственный реестр баз данных (регистрационный номер 2012620676 от 13.07.2012). Результаты этой работы использованы в трех информационно-методических письмах, которые нашли применение в учебном процессе при подготовке врачей-урологов (включены в курс последипломного образования по урологии, кафедра урологии РМАПО), а также в обучении студентов и аспирантов кафедры биохимии РУДН (элективный курс «Клиническая биохимия»).
Показано, что исследования и анализ на основе протеомных баз данных позволяет решать широкий круг биомедицинских вопросов, связанных с обнаружением полиморфных белков, а также с выявлением изменений протеомных профилей в ходе клеточной дифференцировки, онтогенеза мышечных тканей и органов. Обнаружен ряд изменений в протеомных профилях при старении и некоторых формах патологии (злокачественные новообразования и др.)
Проведенное изучение потенциальных белковых биомеркеров рака простаты создало научно-методические основы для организации клинических исследований с целью валидации некоторых из этих маркеров (AGR2, PR02675, Dj-1, серпня НІ и трансгелин). Получен патент на один из потенциальных биомаркеров рака простаты (№ 2360924, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 июля 2009 г., опубликован 10.07.2009, Бюл., №19. С. 1-7.).
В ходе биомедицинских исследований, направленных на определение качества мясных продуктов, выявлены видоспецифические изоформы ряда мышечных белков и предложен метод, пригодный для контроля качества мясной продукции по белковому составу и обнаружения белковых добавок немышечного происхождения, включая установление признаков фальсификаций.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Найдены различные варианты биохимического полиморфизма белков человека: а - обусловленные единичными аминокислотными заменами (single amino acid substitution, SAAS), включая новый вариант триозофосфат изомеразы 1 (SAAS 233G—>D), и разрешены в одну из сторон «конфликтные» определения первичной аминокислотной последовательности по 135 позициям 59 белков че-
ловека, б - в гладкомышечных тканях и органах, содержащих значительное количество гладкомышечных клеток, показана множественность и органоспеци-фичность спектра изоформ трансгелина.
-
Сформированы двуязычная база данных «Протеомика мышечных органов», содержащая 7 модулей и информацию по 510 идентифицированным белкам и новая, расширенная версия (2012 г.) отечественного информационного ресурса - база данных «Протеомика рака простаты», включающая 9 модулей (570 идентифицированных белков), в том числе комплексный модуль «Белки клеток DU-145», обобщающий результаты протеомного анализа суммарных белков этих клеток, а также отдельных белковых препаратов (ядерные белки, гисто-ны, фосфопротеины).
-
Выявлено и охарактеризовано несколько безымянных и других малоизученных белков человека.
-
На основе количественной денситометрии из потенциальных белковых онкомаркеров для рака простаты отобрана панель наиболее перспективных белков для дальнейшего использования.
-
Определены видоспецифичные белковые биомаркеры мышечных тканей, а также белки различных немышечных пищевых добавок, позволяющие характеризовать качество мясной продукции, включая выявление нарушений нормативов ГОСТ и ТУ.
Апробация работы.
Материалы данной работы на протяжении докладывались на международных и российских конференциях, а также на научных съездах и конгрессах, в том числе: II Моск. междун. конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2003. Москва; Intern. Confer., «Chemical and Biological Problems of proteomics», 2004. Novosibirsk; IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 2008, Новосибирск; 10 ESC Meeting, Leuven, Belgium, 2008; XXXVII Eur. Muscle Conference, Oxford, England, 2008; VII Съезд онкологов России 2009, Москва; 25th Anniversary EAU Congress, Barcelona, 2010; III межд. научно-практ. конф. «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань, 2012; Proc. 58th Congr. Meat Science and Technology, Montreal, Canada 2012 и др.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 79 научных работ, среди которых одна монография, две главы в коллективных монографиях, 24 статьи в рецензируемых российских и международных журналах, 5 статей в тематических сборни-
ках, один патент, три информационно-методических письма, 44 тезисов докладов на различных конференциях.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 299 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (708 наименований). Работа содержит 56 таблиц и 114 рисунков.
