Содержание к диссертации
Введение
1. Воспалительные заболевания органов женской репродуктивной системы и молекулярно-генетические маркеры в диагностике вагинитов и хронического эндометрита (обзор литературы) 21
1.1 Клинико-эпидемиологические аспекты воспалительных заболеваний слизистой влагалища и эндометрия 21
1.1.1 Воспалительные заболевания слизистой влагалища: распространение, симптомы, этиология и факторы риска развития заболевания 21
1.1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин репродуктивного возраста 24
1.1.3 Хронический эндометрит: распространение, патогенез и факторы риска развития заболевания 29
1.2 Механизмы иммунной защиты половых путей женщин 32
1.3 Клинико-лабораторная диагностика вульвовагинитов и хронического эндометрита 53
1.3.1 Диагностика воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы 53
1.3.2 Клинико-лабораторная диагностика хронического эндометрита 60
1.4 Методы исследования маркеров локальных воспалительных процессов 62
1.4.1 Микроскопия мазков с подсчетом числа лейкоцитов 64
1.4.2 Метод лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител 65
1.4.3 Метод иммуноферментного анализа. 66
1.4.4 Технология мультиплексного иммуноанализа для исследования цитокинового профиля генов иммунного ответа 68
1.4.5 Методы иммуногистохимического исследования 69
1.4.6 Определение транскрипционных профилей генов 70
1.4.7 Полиморфизмы генов иммунной системы и современные методы их идентификации 72
1.4.8 Ассоциация полиморфизмов генов иммунной системы с предрасположенностью к развитию инфекционно-воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы 81 Резюме 84
2. Материалы и методы 85
2.1 Материалы исследования 85
2.2 Объем исследования 85
2.3 Методы исследования 88
2.3.1 Определение состава микрофлоры влагалища 88
2.3.2 Определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа 90
2.3.3 Определение замен одиночных нуклеотидов 91
2.3.4 Дополнительные клинико-лабораторные методы 91
2.4 Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени 92
2.5 Нормировка 92
2.6 Статистика 93
2.7 Метод бинарной логистической регрессии 94
2.8 ROC-анализ 95
2.9 Характеристики диагностических тестов 95
3. Результаты собственных исследований 97
3.1 Разработка систем для оценки профиля экспрессии мРНК генов иммунной системы 97
3.1.1 Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб 97
3.1.2 Проверка праймеров и зондов 101
3.1.3 Выбор референсных генов и разработка алгоритмов нормировки, оптимальных для оценки уровней экспрессии мРНК генов человека в тканях эндометрия и влагалища 106
3.1.4 Апробация метода исследования транскрипционных профилей на образцах тканей эндометрия двух стадий менструального цикла 107
3.2 Прикладные аспекты идентификации молекулярно-генетических маркеров с использованием ПЦР в реальном времени 113
3.2.1 Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей 113
3.2.1.1 Характеристика состава микробиоценоза влагалища небеременных женщин 114
3.2.1.2 Характеристика состава микробиоценоза влагалища беременных женщин 116
3.2.1.3 Типирование и количественная оценка лактобактерий 119
3.2.1.4 Транскрипционные профили генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища 123
3.2.1.5 Характеристика уровней представленности транскриптов генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища. 123
3.2.1.6 Зависимость транскрипционных профилей от стадии менструального цикла 125
3.2.1.7 Сравнение транскрипционных профилей генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов у беременных и небеременных женщин 126
3.2.1.8 Особенности экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов в норме, при вагините и БВ 127
3.2.1.9 Корреляция Lactobacilus iners с уровенем экспрессии генов 131
3.2.1.10 Разработка способа оценки локальной воспалительной реакции 133
3.2.1.11 Преимущества использования индексов и интегральной оценки локального воспаления 136
3.2.1.12 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с клиническими данными 139
3.2.1.13 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с методом подсчета числа лейкоцитов в мазке 143
3.2.2 Осложнения родов и послеродового периода у пациенток с вагинитами и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл 144
3.2.3 Определение ассоциаций полимофизмов генов цитокинов с предрасположенностью к развитию вагинитов 146
3.2.4 Хронический эндометрит 154
3.2.4.1 Идентификация микроорганизмов в полости матки 154
3.2.4.2 Локальный транскрипционный профиль при хроническом эндометрите 156
4. Обсуждение результатов 164
4.1. Молекулярно-генетические маркеры при вагинитах 164
4.1.1. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа в норме и его зависимость от фазы менструального цикла в тканях эндометрия 164
4.1.2. Зависимость транскрипционных профилей генов иммунного ответа в клетках соскобов из влагалища от беременности 167
4.1.3. Доминирование в составе биоценозов влагалища лактобактерий – механизм защиты плода и новорожденного от условно-патогенных микроорганизмов 168
4.1.4. Ассоциация L.iners и L.gasseri с дисбиотическими и воспалительными процессами во влагалище 170
4.1.5. Транскрипционные профили в клетках соскобов слизистой влагалища при вагинитах 173
4.1.6. TNF, TLR4, GATA3 и IL18 – маркеры объективной интегральной оценки локальной воспалительной реакции во влагалище 180
4.1.7. Актуальность определения дисбиотических и воспалительных процессов во влагалище для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений 183
4.1.8. Генетически обусловленная пониженная экспрессия TNF- и TGF-1 – фактор предрасположенности к развитию вагинитов 184
4.2. Молекулярно-генетические маркеры при хроническом эндометрите 187
4.2.1. Особенности транскрипционного профиля генов иммунного ответа при фиброзе стромы эндометрия 187
4.2.2. Роль инфекционных агентов в патогенезе хронического эндометрита 189
4.2.3. Особенности транскрипционных профилей при полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы 190
Выводы 193
Список литературы 204
- Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин репродуктивного возраста
- Дополнительные клинико-лабораторные методы
- Транскрипционные профили генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища
- Доминирование в составе биоценозов влагалища лактобактерий – механизм защиты плода и новорожденного от условно-патогенных микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность
Открытие и внедрение в практику в конце 80 годов метода полимеразной
цепной реакции (ПЦР) внесло огромный вклад в развитие современной биологии и
медицины. В настоящее время данный метод широко используется для решения
целого ряда фундаментальных и прикладных задач, включающих в себя
определение генетических заболеваний, вариантов полиморфизма генов,
функциональной активности генома, а также изучение воздействия на организм человека биотических факторов окружающей среды (бактерий, грибов, вирусов). Следует отметить, что каждая из выше перечисленных задач может решаться как самостоятельно, так и в составе комплексного исследования. В данной работе комплексный подход предложен для решения фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на примере воспалительных процессов, сопровождающих заболевания органов женской репродуктивной системы.
Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей (вульвиты,
вагиниты) являются одной из наиболее распространенных причин обращения
женщин к врачу акушеру-гинекологу [Hainer B.L., 2011]. От неспецифического
вагинита страдает почти каждая пятая пациентка гинекологической практики
(19,2%), а среди пациенток с патологическими белями частота его выявления
возрастает в 4 раза [Анкирская A. C., 2005]. Известно, что в основе репродуктивных
неудач (трубно-перитонеальный фактор бесплодия, самопроизвольные выкидыши),
акушерских осложнений родов и послеродового периода, таких как
преждевременное излитие околоплодных вод, внутриутробное и интранатальное инфицирование плода и новорожденного, мертворождение, хориоамнионит в родах, послеродовые гнойно-септические осложнения, также лежат те или иные воспалительные заболевания половых органов [Кира Е. Ф., 2008].
Воспаление чаще всего вызвано действием патогенных и условно-патогенных
микроорганизмов, идентификация которых чрезвычайно важна при выборе терапии.
Однако в значительной степени развитие инфекционного процесса определяется
состоянием локального (мукозального) иммунитета и зависит от иммунологической
реактивности макроорганизма. В патогенезе заболевания микробный фактор играет
такую же роль, как и состояние макроорганизма, и те обстоятельства, которые
изменяют его иммунобиологические свойства [Серов В.Н., 2006]. В связи с этим
изучение мукозального иммунитета представляет чрезвычайный интерес. В то же время, спектр методов исследования мукозального иммунитета остается весьма ограниченным из-за малого количества материала и наличия слизи в образцах. В ходе исследований возникают вопросы, связанные с нормировкой материала, способов его взятия и транспортировки. Вследствие этого существующие знания об изменении различных иммунологических показателей (цитокинов, дефензинов, иммуноглобулинов, рецепторов иммунокомпетентных клеток и др.) при вагинитах не получили должного применения в клинической практике. Основным, и зачастую, единственным методом оценки состояния локального иммунитета в рутинной практике в настоящее время остается микроскопия мазка с подсчетом числа лейкоцитов. Альтернативой подсчету числа лейкоцитов может служить оценка иммунологических показателей (как пример, транскрипционный профиль генов цитокинов).
В настоящее время накоплены многочисленные данные о зависимости экспрессии цитокинов не только от влияния внешних патогенных факторов, но и от генетической вариабельности кодирующих их генов. В частности, получены данные об ассоциациях отдельных полиморфизмов генов цитокинов с такими нозологическими формами как вульвовагинальный кандидоз [Johnson M. D., 2012] и бактериальный вагиноз [Cauci S., 2007; Genc M. R., 2004, Gomez L. M., 2010]. Оригинальность настоящего исследования состоит в том, что различные нозологические формы вагинитов были исследованы в совокупности, включая случаи воспаления неустановленной этиологии. Использование такого подхода обосновано тем, что зачастую воспалительная реакция является неспецифической в отношении инициирующего патологического агента.
Кроме того, большое внимание исследователей привлечено к проблеме
воспалительных заболеваний органов малого таза, среди которых хронический
эндометрит (ХЭ) является наиболее распространенным. ХЭ выявляется примерно у
10% женщин репродуктивного возраста, но у пациенток с нарушениями
генеративной функции частота его обнаружения увеличивается до 23–57%
[Назаренко Т. А., 2007]. Среди женщин с ХЭ 80–90% составляют женщины
детородного возраста. ХЭ обуславливает у них нарушения менструальной и
репродуктивной функций, приводя, в конечном итоге, к развитию бесплодия,
неудачам в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО),
невынашиванию беременности и осложненному течению гестационного процесса и родов [Унанян А. Л., 2012].
Все предложенные в данной работе молекулярно-генетические маркеры (транскрипты генов иммунной системы, полиморфизмы генов, а также возбудители воспалительных заболеваний) могут быть идентифицированы в одном и том же образце с использованием одного универсального метода – полимеразной цепной реакцией, что сокращает время для проведения исследований.
Цель и задачи работы Цель работы:
Разработать комплексный подход к характеристике воспалительных
процессов органов женской репродуктивной системы на основе молекулярно-
генетических маркеров, включающих количественную идентификацию
инфекционных агентов, определение транскрипционного профиля генов иммунной
системы и генетических особенностей организма.
Задачи:
-
Для оценки профиля экспрессии генов иммунного ответа разработать тест-системы на основе метода количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
-
Выявить особенности экспрессии мРНК генов иммунного ответа (цитокины, рецепторы, транскрипционные факторы и др.) при вагинитах и хроническом эндометрите.
3. Установить распределение аллельных вариантов генов иммунного ответа,
ассоциированных с предрасположенностью к развитию вагинитов у женщин
репродуктивного возраста.
4. Провести характеристику состава микроорганизмов, способствующих
развитию воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы
(вагиниты, хронический эндометрит).
5. Разработать способы идентификации локальной воспалительной реакции
при вагинитах и хроническом эндометрите на основе интегральной оценки
транскрипционных профилей генов иммунного ответа.
6. Определить наиболее важные молекулярно-генетические маркеры
воспалительного процесса, позволяющие одновременно получать информацию о
полиморфизмах и активности генов иммунной системы, а также вирусологическом
и бактериологическом фоне.
Научная новизна исследования
Впервые разработан и апробирован метод комплексной оценки клинического биоматериала на молекулярно-генетическом уровне при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы, позволяющий одновременно получать информацию о вирусологическом и бактериологическом фоне, а также полиморфизмах и активности генов иммунной системы.
Впервые при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы на основе метода ОТ-ПЦР проведено исследование представленности транскриптов широкого спектра генов иммунного ответа (цитокины IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционные факторы (ТВХ21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобные-рецепторы (TLR2, TLR4, TLR9), клеточные маркеры иммунной системы (IL2Ra, CD45, CD68, CD69), а также гранулизин GNLY). Выбраны наиболее информативные маркеры воспалительного процесса при вагините (TNF, IL18, TLR4, GATA3) и хроническом эндометрите (IL1B, IL2, IL10, Foxp3, TLR9, IL2Ra).
Впервые применен способ интегральной оценки представленности транскриптов генов иммунного ответа при вагинитах и хроническом эндометрите, позволивший охарактеризовать состояние локального иммунитета и предложить новый молекулярно-генетический метод определения воспалительных процессов слизистой влагалища и эндометрия.
Впервые при исследовании транскрипционных профилей использован метод определения индекса соотношения уровня экспрессии генов, позволяющий осуществлять анализ без нормировки на референсные гены, что существенно упрощает и снижает стоимость исследования, делает его доступным для рутинной диагностики.
Впервые получены данные об ассоциации Lactobacillus iners с состоянием локального иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L.iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 и снижению уровня экспрессии мРНК IL18 по сравнению с образцами, в которых доминирует L.crispatus.
Определены генетические предикторы предрасположенности к развитию вагинитов. Впервые установлено, что генетическая предрасположенность к
пониженной экспрессии TNF- и TGF-1, обусловленная генотипом GG локуса TNF -238 G>A и генотипом СС локуса TGFB1 -509 C>T, является фактором риска развития вагинита.
Научно-практическая значимость
Представленная работа является фундаментально-прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для развития как фундаментальных, так и прикладных аспектов иммунологии, молекулярной биологи и медицины.
Созданный в ходе работы методический подход позволяет получить более полную информацию об активности генов иммунной системы при воздействии на организм женщин биотических факторов (бактерий, грибов, вирусов) при вагинитах и хроническом эндометрите.
Определены перспективы использования комплексного подхода к диагностике воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы в гинекологической практике для объективной оценки локальных воспалительных реакций, индивидуального прогноза развития заболевания, для количественного определения микроорганизмов с целью выбора оптимальных схем терапии. В акушерской практике предлагаемый подход может быть использован для предупреждения и профилактики родовых и послеродовых осложнений.
В работе использована отечественная приборная и технологическая база с целью импортозамещения в области инновационных прикладных молекулярно-генетических исследований.
По результатам диссертационной работы поданы 2 заявки на патент и 1 на регистрационное удостоверение:
Патент на изобретение № 201147924 от 25.11.2011 г.: «Способ диагностики неспецифических вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Меджидова М.К, Непша О.С, Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.
Патент на изобретение № 2013145241 от 9.10.2013 г.: «Способ определения локальной воспалительной реакции у женщин репродуктивного возраста по уровню экспрессии мРНК генов цитокинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С, Тютюнник В.Л., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.
Регистрационное удостоверение № 3756 от 7.02.2014 г. на Набор
реагентов для оценки локальной воспалительной реакции влагалища методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Экспрессия генов. Воспаление влагалища) по ТУ производства ООО «Научно-производственного объединение ДНК-Технология».
Положения, выносимые на защиту
-
Для исследования функциональной активности генов иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы разработаны 32 тест-системы на основе количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
-
Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, IL10, CD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF, снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC.
-
Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей аллеля С локуса TGFB1 -509 C>T и протективная роль аллеля А локуса TNF -238 G>A в развитии вагинитов.
-
Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышена экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, TNF, TGFB1, Foxp3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFA, TLR2. Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, IL8, IL12A, TGFB1, Foxp3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFA, TLR2, IL18, IFNG и TLR4.
-
Определены ассоциации различных видов лактобактерий с состоянием микробиоты влагалища и местного иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L.iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 и снижению IL18.
-
При хроническом эндометрите в полости матки определена ведущая роль бактериального фона, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Enter obacteriaceae, Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp./ Porphyromonas spp., Ureaplasma spp).
7. Предложены способы оценки функционального состояния местного иммунитета при вагинитах и хроническом эндометрите с фиброзом стромы эндометрия по транскрипционному профилю генов иммунного ответа, основанные на методах многофакторного анализа.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на
Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и
симпозиумах: итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за
2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-
технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007 г.); XI и XII
Всероссийские научные форумы «Мать и дитя» (Москва, 2010 г., 2011 г.); VI
Региональный научный форум «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012 г.);
Всероссийский конгресс «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и
перспективы» (Москва, 2011 г.); III и IV междисциплинарные научно-практические
конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-
лабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2010 г.; Москва, 2011 г.);
54 научная конференция МФТИ «Проблемы фундаментальных и прикладных
естественных и технических наук в современном информационном обществе.
Молекулярная и биологическая физика». (Москва, 2011 г.); XXIV Международный
Конгресс c курсом эндоскопии (Москва, 2011 г.); V и VI Международный конгресс
по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи» (Москва, 2011 г.,
2012 г.); V Российская конференция "Иммунология репродукции. Теоретические и
клинические аспекты" (Иваново, 2012 г.); 7 и 8 Европейские конгрессы по
иммунологии репродукции (Афины, Греция, 2009 г.; Мюнхен, Германия, 2010 г.); 14
Всемирный конгресс по репродукции человека (Aвстрия, 2011 г.); 4
Международный конгресс IVI-клиник (Валенсия, Испания, 2011 г.); I Конференция по биомаркерам в репродуктивной медицине: возникновение нового направления исследования (Валенсия, Испания, 2012 г.); Всемирный конгресс по гинекологии, бесплодию и перинатологии (Барселона, Испания, 2012 г.).
Диссертация частично выполнена в рамках работ по Государственным контрактам Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011 года и №16.512.11.2093 от 22 февраля 2011 года.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 54 печатные работы, в том числе 30 статей в 11 рецензируемых научных изданиях, 3 патента, 21 публикация в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.
Объем и структура диссертации
Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин репродуктивного возраста
У здоровых женщин репродуктивного возраста общее количество микроорганизмов во влагалищном отделяемом составляет 106–108,5 КОЕ/мл. В состав микрофлоры влагалища входит свыше 400 видов микроорганизмов, включая бактерии, вирусы и грибы [34]. Микробиоценоз влагалища в норме состоит из постоянно обитающих микроорганизмов (индигенная или автохтонная микрофлора) и транзиторных (аллохтонная или случайная микрофлора). Автохтонная микрофлора представлена в основном Lactobacillus spp., она составляет до 95-100% численности микроорганизмов в составе микробиоценоза влагалища [31]. Общая численность транзиторных микроорганизмов в норме не превышает 15–20% от всего пула микроорганизмов [5; 107; 134; 326] Доминирование лактобактерий в составе микробиоценоза влагалища определяется высоким фоном эстрогенов, которые индуцируют накопление в вагинальном эпителии гликогена, являющегося идеальным субстратом для роста лактобактерий. Лактобактерии расщепляют гликоген с образованием молочной кислоты, которая поддерживает рН среды на низком уровне (3,8 4,5), что ограничивает рост условно-патогенных микроорганизмов. Помимо молочной кислоты защитные механизмы лактобактерий обусловлены выработкой бактериоцинов и перекиси водорода [182]. Исследования последних лет показали, что лактобактерии выделяют во внеклеточную среду экзополисахариды, способствующие их адгезии на слизистом эпителии, обеспечивающие стабильность мукозального слоя слизистых и резистентность к УПМ [124]. Описано свыше 120 видов лактобактерий, входящих в состав микробиоценозов; из них только 20 видов колонизируют слизистую влагалища, такие как L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri, L.acidophilus, L.johnsoni, L.vaginalis, L.amylolyticus, L.amylovorus, L.gallinarium, L.fermentum, L.brevis, L.rhamnosus, L.salivarius и другие [182]. При этом чаще всего основу микробиоты влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста составляют 4 вида: Lactobacillus crispatus, L.iners, L.gasseri и L.jensenii [42; 327]. Несмотря на то, что L.iners в норме присутствует в составе микробиоты влагалища достаточно часто, ее протективное значение остается спорным, а некоторые авторы даже полагают, что L.iners играет негативную роль и участвует в патогенезе бактериального вагиноза [327]. Сдвиг баланса в сторону условно-патогенных микроорганизмов приводит к дисбиотическим состояниям. В свою очередь дисбиозы могут протекать как без видимых клинических проявлений, так и сопровождаться такими симптомами, как обильные выделения из половых путей с неприятным запахом, зуд, жжение, диспареуния, т.е. сопровождаются признаками вагинитов. В случае преобладания в составе микрофлоры облигатно-анаэробных микроорганизмов, таких как Gargenerella vaginalis, Mobiluncus spp., Atopobium vaginalis, Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Prevotella spp., Prophyromanas spp., Peptostreptococcus spp., речь идет о бактериальном вагинозе. В мазках при микроскопии обнаруживаются грамвариабильные палочки и «ключевые клетки», образующиеся в результате адгезии анаэробов на десквамированном эпителии. Распространенность БВ составляет до 30 процентов [64]. БВ в зарубежной печати рассматривается в качестве одной из наиболее распространенных причин воспалительных заболеваний влагалища. В противоположность зарубежным исследованиям большинство отечественных ученых традиционно считает БВ инфекционным полимикробным невоспалительным синдромом, характеризующимся резким снижением или отсутствием лактофлоры и ее заменой на полимикробные ассоциации строгих анаэробов [8; 40].
Бактериальный вагиноз является самой распространенной причиной патологических выделений из влагалища и неприятного запаха из половых путей. Рыбный запах, обусловленный производством анаэробными бактериями аминов, является наиболее патогномоничным признаком БВ. Характерный запах становится наиболее выраженным при увеличении рН после полового акта или во время менструации при наличии крови [193].
В половине случаев бактериальный вагиноз протекает бессимптомно, не вызывает воспаление слизистой оболочки вульвы и влагалища, редко вызывает зуд вульвы [281].
По данным литературы сам по себе бактериальный вагиноз не связан с риском развития воспалительных заболеваний органов малого таза, однако, даже при бессимптомном носительстве наличие БВ ассоциировано с высоким риском возникновения эндометрита и воспалительных заболеваний органов малого таза после инвазивных гинекологических процедур и абортов [228].
Как симптоматические так и бессимптомные формы бактериального вагиноза ассоциированы с повышенном риском заражения возбудителями ИППП [94; 199; 319], в частности вирусом иммунодефицита человека ВИЧ -1 (OR= 1,89 , 95% ДИ от 1,46 до 2,43 ) [199]. Бактериальный вагиноз может стать причиной преждевременных родов [187; 260; 291], преждевременного разрыва плодных оболочек [180] и послеродового эндометрита [163]. В патогенезе преждевременных родов при инфекции существенное влияние может иметь повышение TNF-, который стимулирует синтез простагландинов [259], металлопротеиназ [123; 311] и апоптотических каспаз [206], которые в свою очередь оказывают влияние на разрыв плодных оболочек и преждевременное «созревание» шейки матки.
Как полагают, в основе механизмов срочных и преждевременных родов может быть повышенный синтез провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8 и TNF- в плаценте [238; 265; 332]. Родовая деятельность находится под контролем нескольких медиаторов: окситоцина, простагландинов, гистамина, прогестерона, кортизола и активно взаимодействиующих с ними цитокинов.
В норме началу родов предшествует инфильтрация плаценты лейкоцитами (макрофагами, тучными клетками и гранулоцитами). Все эти клетки начинают активно вырабатывать провоспалительные цитокины, которые увеличивают синтез простагландинов Е2 и F, стимулирующих сокращение мускулатуры матки. Помимо этого IL-1 и IL-6 вызывают усиление синтеза экспрессии окситоцина и рецепторов окситоцина в миометрии [126; 254]. Именно окситоцин служит одним из основных медиаторов родовой деятельности, вызывая стимуляцию сокращения гладкой мускулатуры миометрия матки. Преждевременные роды ассоциированы с увеличением уровня провоспалительных цитокинов - одной из причин необычно раннего повышения цитокинов может быть наличие инфекции. Патогены могут проникать в матку в силу несостоятельности защитных механизмов, в норме предохраняющих плод от инфицирования. Патогены активируют TLR и запускают развитие локальной воспалительной реакции, сопровождающейся синтезом провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, усиливают синтез простагландина Е2, вызывающего сокращение гладкой мускулатуры матки. Внутриматочные инфекции обычно затрагивают амнион и амниотическую жидкость, в которых также возрастает синтез провоспалительных цитокинов. По данным Hagberg H. и соав. почти у половины обследованных женщин с преждевременными родами в амниотической жидкости были повышены уровни IL-1, IL-6, IL-8 и они коррелировали с микробной колонизацией и клинической картиной воспаления у матери [140]. Маркером риска преждевременных родов также является повышение концентрации IL-6 в цервикальном канале у матери, как правило повышение IL-6 ассоциировано с дисбиотическими процессами во влагалище [131].
Дополнительные клинико-лабораторные методы
Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК». Метод основан на лизисе клеток в 4М растворе гуанидинтиоцианата и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя с последующими отмывками этанолом и ацетоном. В случае наличия в образце большого количества материала (ткани эндометрия) использовали метод фенол-хлороформной экстракции [267]. Реакцию обратной транскрипции (синтез кДНК из полученной РНК) проводили в объеме 40 мкл. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали оригинальные специфичные олигонуклеотиды и обратную транскриптазу M-MuLV. Реакцию проводили при температуре 40С в течение 30 минут, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95С в течение 5 минут. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM на каждом цикле при температуре отжига праймеров. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Для постановки ПЦР в реальном времени использовали обычную Taq-полимеразу с обеспечением «горячего старта» с помощью парафина или Taq-полимеразу с AT (Taq-AT), позволяющую осуществить реализацию «горячего старта» без применения парафина. Taq-AT использовалась при работе с автоматическими станциями в формате 384-луночного планшетного раскапывания реактивов и кДНК.
Спектр исследованных мРНК-маркеров при вагинитах и хроническим эндометрите представлен в таблице 7.
Нормировка уровня экспрессии исследуемых генов осуществлялась методом сравнения пороговых циклов (метод Cq) по 4 референсным генам (B2M, GUSB, TBP и HPRT1) и значению медианы уровня экспрессии в группе сравнения, которую принимали равной 1.
Для определения SNP ДНК выделяли из ядер лимфоцитов. Метод основан на разрушении лимфоцитов с помощью лизирующего буфера, не влияющего на целостность мембран ядер лимфоцитов [150]. ДНК из ядер выделяли с использованием наборов «Проба ГС».
Для типирования однонуклеотидных полиморфизмов генов иммунного ответа использована ПЦР с плавлением продуктов реакции в присутствии «примыкающих» олигонуклеотидов (вариант метода adjacent probes, kissing probes). Высокая достоверность полученных результатов обеспечивалась получением кривых плавления по двум каналам флуоресценции (FAM и HEX).
Спектр исследованных полиморфизмов представлен в таблице 7. Дополнительные клинико-лабораторные методы при вагинитах: сбор анамнестических данных, жалоб пациентки; осмотр вульвы, слизистых влагалища и шейки матки в зеркалах, бимануальное гинекологическое исследование; микроскопия мазков, окрашенных по Граму; культуральное исследование. при хроническом эндометрите: клинические (анализ жалоб, анамнеза, определение гинекологического статуса); гистероскопия, диагностическое выскабливание эндометрия; гистологическое исследование; ультразвуковое исследование органов малого таза. Дополнительные клинико-лабораторные исследования были выполнены врачами и сотрудниками ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова».
Cq (или Ср) - значение характеристического цикла амплификации, автоматически определяемое детектирующим амплификатором (пороговый или индикаторный цикл). Slope - разница в значениях Ср (Ср) при разведении образца в 10 раз. Эффективность амплификации оценивали по формуле: или ( ) ( ) (формула 1). Уровень экспрессии мРНК исследуемого гена X относительно мРНК одного референсного гена N определяли по формуле: ]/ N/ (формула 2), где EN, EX - эффективности амплификации, CpN,CpX - значения пороговых циклов.
Нормировка Нормировка по нескольким референсным генам производилась методом сравнения пороговых циклов (метод Cq с нормировкой на референсные гены и значение медианы уровня экспрессии в группе сравнения). Для каждого образца на основании уровней экспрессии 4 референсных генов вычислялся нормировочный фактор (NF) - среднее арифметическое значений Cр референсных генов.
Транскрипционные профили генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища
В то время как для идентификации возбудителей помимо микробиологического исследования используются и другие альтернативные методы, включая ПЦР, микроскопия мазка остается единственно доступным методом оценки локальной воспалительной реакции. Обнаружение во влагалищных мазках более 10 лейкоцитов в поле зрения микроскопа (более 20 у беременных женщин) является признаком воспаления. Известно, что персистирование патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на слизистой влагалища приводит к стимуляции клеток иммунной системы и эпителия, что проявляется в изменении профиля цитокинов, экспрессируемых клетками. Вероятно, что данные маркеры могут быть использованы для оценки локальной воспалительной реакции во влагалище. С целью наиболее оптимальных маркеров был исследован широкий спектр транскриптов генов иммунного ответа (30 маркеров).
Характеристика уровней представленности транскриптов генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища Абсолютный уровень экспрессии мРНК генов иммунного ответа в соскобах был различным, что обусловило необходимость определения среднестатистического транскрипционного профиля. По количеству копий мРНК в биологическом материале все гены можно было условно разделить на 3 группы (рис.22): гены с высоким уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 107 до 105 копий мРНК/мл (IL8, IL1B, IL18, TGFB1, CD68, GATA3); гены со средним уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 105 до 103 копий мРНК/мл (TNF, CD45, IL12A, IL23, TLR2, TLR4, CD69, IL10, RORC) и гены с низким уровнем экспрессии - менее 103 копий мРНК/мл (IL15, Foxp3, LIF, TLR9, GNLY, TBX21, IFNG, IL6, IL2Ra). Следует отметить, что экспрессия последней группы генов довольно часто не детектировалась в клетках соскобов слизистой влагалища, либо из двух повторов положительным был только один.
. Уровень представленности транскриптов генов иммунного ответа в клетках вагинальных соскобов.
Отмечены медианы и межквартильный размах.
С целью выяснения нижних границ линейного диапазона тест-систем были раститрованы образцы кДНК. Например, результаты по референсному гену B2M приведены на рисунке 23. Зависимость порогового цикла от концентрации матрицы была линейной в диапазоне 102,7-106,3 копий/мл, ошибка повторных исследований не превышала 0,2 цикла. Данные по другим тест-системам аналогичны (102,6-103 копий/мл - нижние границы линейного диапазона).
В качестве потенциальных маркеров воспаления было целесообразно использование генов с высоким и средним уровнем экспрессии (с концентрацией матрицы более 103 копий мРНК/мл), экспрессия которых находится в пределах линейного диапазона тест-систем. Маркеры с низким уровнем экспрессии были проанализированы как качественные показатели по частоте выявления в группах. Они были исключены из дальнейшего рассмотрения в качестве маркеров локального воспаления.
Учитывая цикличность менструального цикла и чувствительность органов женской репродуктивной системы к влиянию стероидных гормонов, была исследована зависимость транскрипционного профиля генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов от стадии цикла в группе сравнения (рис.24). Экпрессия мРНК TGFB1 была выше в 2 раза в секреторную фазу цикла по сравнению с пролиферативной фазой (р=0,045). Использование данного маркера не желательно для оценки воспалительной реакции.
Достоверных различий по другим маркерам не выявлено.
Доминирование в составе биоценозов влагалища лактобактерий – механизм защиты плода и новорожденного от условно-патогенных микроорганизмов
Высокий иммуносупрессорный фон во время беременности должен был бы способствовать обострению оппортунистических генитальных инфекций, но колонизационная резистентность, обусловленная доминированием в составе нормофлоры лактобактерий, подавляет рост условно-патогенных микроорганизмов. Под колонизационной 168 резистентностью подразумевается совокупность механизмов, придающих индивидуальную стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения организма хозяина патогенными или условно патогенными микроорганизмами [51]. Этот простой микробиологический механизм доминирования в составе нормофлоры лактобактерий связан с высоким эстрогеновым фоном. Но реализован он по сути дела только у женщин репродуктивного возраста и, очевидно, направлен на противоинфекционную защиту эмбриона, плода и новорожденного во время беременности на фоне иммуносупрессии. У девочек и у женщин в менопаузе лактобактерии в составе микробиоценозов влагалища не являются доминирующим видом. Лактобациллы у девочек доминируют в составе флоры влагалища только во II фазу пубертатного периода (14-17 лет) и до 4-6 недель после рождения. Доминирование лактобацилл у новорожденных девочек обусловлено пассивной эстрогеновой насыщенностью в связи с трансплацентарным переходом в кровоток плода половых гормонов, синтезируемых материнским организмом, стимулирующих у плода и новорожденной девочки синтез гликогена в промежуточных клетках вагинального эпителия. В остальные возрастные периоды у девочек микрофлора влагалища представлена стафилококками, энтеробактериями, стрептококками, а также анаэробными микроорганизмами, рН влагалищной среды составляет от 7,2 до 5,8, общая обсемененность влагалища - от 102 КОЕ/мл до 105 КОЕ/мл [3].
В климактерическом периоде дефицит эстрогенов вызывает развитие возрастных атрофических изменений слизистой оболочки влагалища, что приводит к снижению содержания гликогена в эпителии влагалища и снижению колонизации лактобациллами. В связи со сменой флоры происходит увеличение рН влагалищной среды до 5,5–7,5. Влагалище и нижние мочевые пути колонизируют грамотрицательные факультативно-анаэробные виды семейства энтеробактерий, в основном кишечная палочка, и типичные представители микрофлоры кожных покровов. Главный отличительный признак влагалищной атрофии — отсутствие или резкое снижение титра лактобацилл [31].
Ассоциация L.iners и L.gasseri с дисбиотическими и воспалительными процессами во влагалище
Один из механизмов защиты от инфекционных заболеваний нижних отделов половых путей у женщин репродуктивного возраста обусловлен доминированием лактобактерий в составе микробиоценоза влагалища. Персистенция лактобактерий на слизистой влагалища подавляет рост условно-патогенных микроорганизмов за счет синтеза молочной кислоты, поддерживающей кислую рН среды [85], бактериоцинов [234] и перекиси водорода [145; 235; 236].
Впервые защитные функции лактобактерий были описаны
Додерлейном А. в 1892 году. 1928 году Стэнли Томас определил палочку Додерлейна как Lactobacillus acidophilus, пророчески добавив, что скорее всего, это группа родственных видов [297]. Согласно последним исследованиям в комплекс бактерий, схожих с L.acidophilus, входит целая группа лактобактерий: L.acidophilus, L.amylovorus, L.amyloliticus, L.crispatus, L.gallinarum, L.gasseri, L.johnsonii , L.iners, и L.jensenii [111; 117; 251].
Известно около 20 видов лактобактерий, входящих в состав микробиоценозов влагалища [182]. Основу микробиоты влагалища составляют 4 вида: Lactobacillus crispatus, L.iners, L.gasseri и L.jensenii [107; 327]. Полученные в нашем исследовании результаты (табл.16, рис.21) соответствуют этим данным. Только в одном случае доминирующим видом в составе лактофлоры была L.acidophilus (табл.16). Виды лактобактерий, входящих в состав кисломолочных продуктов (биотехнологические виды L.acidophilus, L.casei/L.rhamnosus, L. plantarum, L. fermentum) в состав влагалищной лактофлоры в доминирующих количествах входят редко, хотя и могут присутствовать в незначительных количествах, поэтому их типирование не целесообразно.
Частоты доминирования различных видов лактобактерий в группе сравнения (рис.21) приблизительно соответствуют данным Дж. Равель для белой популяции женщин [255]. Равель, исследовав около 400 образцов влагалищных мазков женщин северо-американского континента различных рассово-этнических групп (белые, темнокожие, азиатки, испанки) без симптомов воспалительных заболеваний, описал 5 основных кластеров бактериальных микробиотов: 1) доминирование L.crispatus; 2) доминирова ние L.gasseri; 3) доминирование L.iners; 4) доминирование УПМ; 5) доминирование L.jensenii. По результатам исследования Дж. Равель L.crispatus доминировали в 45,4% случаев, L.iners – 26,8%, L.gasseri – 8,2%, L.jensenii – 9,3%, дисбиотические состояния отмечены у 10,3% белых женщин.
Согласно полученным нами результатам доминирование L.crispatus в составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища (табл.16, рис.21). Доминирование L.crispatus было статистически более значимым в группе условно здоровых женщин по сравнению с группами женщин с вагинитами (OR=5(2,9-8,6), p=2,5x10-9) и бактериальным вагинозом (ОR=4,8 (2-11), p=1,3x10-4).
Напротив, доля образцов с доминированием L.iners в составе лактофлоры влагалища была выше при дисбиотических процессах (табл.16, рис.21) и составила 48% при вагинитах (p=2,2х10-4), 38% - при кандидоносительстве (p=0,046), 48% - при условном нормоценозе (p=0,0062) по сравнению с условно здоровыми женщинами (27%). Аналогичная тенденция была получена и для группы женщин с бактериальным вагинозом (р=0,09).
Кроме того выявлено, что в группе женщин с БВ достоверно чаще отмечено доминирование L.gasseri с составе нормофлоры - 30% (p=1,3х10-4) по сравнению с условно здоровыми женщинами (группа сравнения - 8%). 171 Аналогичная тенденция по L.gasseri получена и для группы с вагинитом (р=0,08).
Полученные результаты согласуются с данными, приведенными в ряде публикаций. Защитная роль лактобактерий, по меньшей мере, обусловлена двумя факторами, это выработкой молочной кислоты и перекиси водорода. В работе Дж. Равель показана зависимость рН-среды от вида лактобактерий. Наиболее кислая среда (рН=4,0±0,3) во влагалищном отделяемом была при доминировании L.crispatus, рН=4,4±0,6 – при доминировании L.iners [255]. Antonio M.A. и соавт. отмечают, что большинство штаммов L. crispatus, выделенных из влагалища и кишечника, являются хорошими производители перекиси водорода, в то время как большинство штаммов L. iners ее не продуцируют [72]. Помимо этого Rampersaud R. выделил и охарактеризовал токсин инеролизин, выделяемый L.iners, аналогичный интермедилизину Streptococcus intermedius и вагинолизину Gardnerella vaginalis, роль которых в патогенезе дисбиотических процессов доказана [253].
Согласно литературным данным большинство штаммов L. jensenii, L. gasseri являются хорошими продуцентами H2O2 [302]. Однако при доминировании L.jensenii и L.gasseri влагалищная среда становится менее кислой (соответственно рН=4,7±0,4 и рН=5,0±0,7), чем при доминировании L.crispatus (рН=4,0±0,3) [255]. Verstraelen Н. и соавт., описывая состав микрофлоры влагалища беременных женщин 9 и 32 недели гестации, пришли к заключению, что доминирование L.crispatus обеспечивает стабильное состояние экосистемы. Микрофлора, включающая L. jensenii вызывает промежуточное состояние стабильности, а при доминировании L.iners и L.gasseri состояние системы наименее стабильно [308].
