Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
1. Методы психиатрической генетики 9
2. Гены и генетические полиморфизмы, ассоциированные с различными формами анормального поведения 12
2.1. Серотониновая система 12
2.2. Дофаминовая система 16
2.3. Ферменты, инактивирующие нейромедиаторы 22
2.4. Другие гены 25
3. Алкоголизм и ферменты, утилизирующие этанол 35
5. Генетика внимания 35
6. Выводы из обзора литературы 39
Материалы и методы 41
1. Выборка больных шизофренией 41
2. Выборка, использованная при поиске генов, ассоциированньіх с избирательным вниманием 41
3. Выборка, исследованная с помощью лабораторной игры «диктатор». Описание игры 42
4. Подготовка образцов крови 42
5. Выделение днк из крови с помощью набора «днк-сорб-а» '. 43
6. Выделение днк из волосяных луковиц 44
7. Выделение днк из образцов крови фенол-хлороформным методом 45
8. 5'-нуклеазный анализ 46
8.1. Генотипирование с помощью 5'-нуклеазного анализа 49
8.2. Нуклеотидные последовательности флуоресцентных зондов ипраймеров 50
9. Аллель-специфическая пцр 53
9.1. Генотипирование с помощью аллель-специфической пцр... 54
10.hrm 57
10.hrm 57
10.1. Генотипирование с помощью метода hrm 59
П. Процедура удлинения праймеров (pep) 60
11.1. Генотипирование с помощью метода pep 62
12. Анализ микросателлитов с помощью пцр с флуоресцентно мечеными праимерами с последующим капиллярным электрофорезом 63
13. Статистический анализ 64
Результаты и обсуждение 65
1. Общий ход работы 65
2. Разработка и применение методик генотипирования полиморфных локусов 66
2.1. Разработка методик генотипирования с помощью 5'-нуклеазного анализа. Проверка точности генотипирования с помощью прямого секвенирования геномной днк 66
2.2. Разработка методик генотипирования с помощью метода нем 69
2.3. Анализ полиморфного маркера c861g гена htr1b с помощью аллель-специфической пцр 70
2.4. Анализ полиморфных маркеров генов сож, drd4, igf2, snap-25 с помощю процедуры удлинения праймеров 71
2.5. Результаты генотипирования 71
3. Ассоциация полиморфных маркеров и гаплотипов гена drd2 с шизофренией, алкоголизмом и альтруистическим поведением 78
4. Ассоциация маркера g444a гена dbhc избирательным зрительным вниманием 87
Заключение 93
Выводы 97
Обозначения и сокращения 98
Список литературы
- Дофаминовая система
- Алкоголизм и ферменты, утилизирующие этанол
- Анализ микросателлитов с помощью пцр с флуоресцентно мечеными праимерами с последующим капиллярным электрофорезом
- Разработка методик генотипирования с помощью 5'-нуклеазного анализа. Проверка точности генотипирования с помощью прямого секвенирования геномной днк
Введение к работе
Функционирование центральной нервной системы определяется взаимодействием большого числа различных белков и белковых комплексов, включая рецепторы нейромедиаторов и нейромодуляторов, ферменты, обеспечивающие синтез и распад этих веществ, трансмембранные переносчики, поддерживающие необходимые концентрации нейромедиаторов в клеточных компартментах и синаптических щелях, факторы роста нейронов и многие другие. Первоочередное значение имеет активность таких нейротрансмитте-ров, как моноамины (дофамин, серотонин, норадреналин, глутамат) и гамма-аминомасляной кислоты. Рїх воздействие на различные нейроны определяет выраженность всевозможных психических проявлений, включая особенности темперамента и когнитивные функции, а нарушения в работе моноами-ноергических систем являются причиной развития ряда психических заболеваний, например, аддиктивных, тревожных и личностных расстройств, а также эндогенных психозов (биполярного аффективного расстройства и шизофрении).
За последнее время появилось много работ, в которых были получены доказательства связи между генами моноаминоергических систем и психическими проявлениями. Были обнаружены конкретные полиморфные участки в этих генах, с которыми эти проявления ассоциированы. Так, показано, что полиморфизмы гена, кодирующего дофаминовый рецептор D4 вносят вклад в межиндивидуальные различия по чертам личности, связанным с экстраверсией и поиском новизны, а полиморфизм Vall58Met гена, кодирующего фермент катехол-0-метилтрансферазу, который принимает участие в распаде дофамина в передней коре, связан с функциями внимания и рабочей памяти, а также ассоциирован с шизофренией. Выявлены аллельные варианты генов серотонинергической системы, в том числе переносчика серотонина и рецепторов серотонина типа 2А и 2С, которые связаны с выраженностью призна-
ков тревожного ряда, а также предрасположением к развитию клинической депрессии.
Следует отметить, что одни и те же полиморфизмы исследованных генов могут быть связаны с различными сферами психики и соответственно с нарушениями в функционировании этих сфер. Этот факт свидетельствует в пользу теорий единого механизма, лежащего в основе разных психических нарушений, которые выдвигаются в последнее время в психиатрии. Активно обсуждается проблема генетической общности эндогенных психозов, в том числе, шизофрении и биполярного аффективного расстройства.
Учитывая исключительную сложность нервной системы, очевидно, что подтверждение этих гипотез требует проведения большого числа исследований. В частности, информативность такого рода исследований может быть повышена, если определенный набор молекулярных маркеров будет проверен на ассоциацию как с различными психическими проявлениями в норме, так и с психическими болезнями.
Для анализа такого набора маркеров в больших выборках необходима надежная и воспроизводимая методика генотипирования. Современные методы молекулярной биологии, такие как ПЦР в режиме реального времени и другие технологии, основанные на ПЦР, позволяют с большой точностью различать аллельные варианты различных полиморфных сайтов.
Целью данной работы являлся генетический анализ полиморфных маркеров набора генов кандидатов, связанных с функционированием центральной нервной системы, в выборках психически здоровых людей, а также в выборках больных шизофренией, биполярным расстройством, алкоголизмом и лиц, совершивших самоубийство.
Были поставлены следующие задачи:
1. Выбрать полиморфные локусы, имеющие ключевое значение для функционирования нейрохимических систем, либо локусы, сцепленные с предполагаемыми функциональными вариантами.
Разработать методы определения генотипов данных полиморфных маркеров.
Провести генотипирование образцов ДНК и установить распределение частоты аллелей генетических вариантов в используемых выборках.
Провести статистический анализ полученных данных для выявления ассоциации между генетическими, вариантами и психическими нарушениями, а также для оценки вклада генетических вариантов в вариативность психологических признаков.
Дофаминовая система
Дофаминовые рецепторы играют ключевую роль в поведении, связанном с поощрением, предполагается, что благодаря их стимуляции возникает тяга к алкоголю. Шизофрению также связывают с повышенной активностью дофаминовых нейронов.
Ген DRD1, кодирующий D1 рецептор дофамина.
Было показано, что дети с СДВГ с большей вероятностью получают от родителей аллель С полиморфизма rs4532, и аллель А полиморфизма rs265981 (Bobb, Addington et al. 2005).
DRD2. Данный рецептор встречается в двух формах - короткой и длинной - что является результатом альтернативного сплайсинга. Короткие рецепторы расположены пресинаптически и предположительно регулируют синтез и высвобождение дофамина (Dick and Foroud 2003).
Одна из распространённых гипотез о причинах шизофрении связывает её возникновение с гиперактивностью дофаминовой системы. Почти все ан типсихотические препараты являются антагонистами или частичными агони-стами рецептора дофамина D2. У больных существенно повышена концентрация данных рецепторов, однако увеличение концентрации рецепторов может являться ответом на воздействие нейролептиков (Kukreti, Tripathi et al. 2006).
Традиционно наибольшее число работ рассматривают маркер SNP TaqlA, один из первых обнаруженных полиморфизмов гена.
Аллель TaqlAl представляет собой SNP-вариант с заменой С32806Т. Данный аллель соответствует пониженной (на 30-40%) плотности D2 рецепторов и снижению дофаминэргической функции (Noble 2003).
Было обнаружено, что этот полиморфизм, находящийся на расстоянии 10 кБ от кодирующей последовтельности гена, на самом деле располагается в пределах гена ANKK1 (кодирующего серин-треониновую киназу, принадлежащую к семейству белков, вовлечённых во внутриклеточную передачу сигналов). SNP приводит к аминокислотной замене в последовательности фермента и может изменять его субстратную специфичность (Munafo, Johnstone et al. 2005). Таким образом, известные факты ассоциации данного полиморфизма с психологическими характеристиками и предрасположенностью к шизофрении могут быть объяснены независимо от его связи с геном DRD2. Однако точная функция ANKK1 остаётся неизвестной.
Дети, несущие этот аллель, согласно тесту CBCL чаще демонстрируют проблемное поведение, трудности при обучении чтению, враждебность (Marino, Vanzin et al. 2004).
Среди курильщиков, несущих данный аллель, обнаружена большая склонность к курению в стрессовых ситуациях (Erblich, Lerman et al. 2004).
В одной из выборок обнаружено, что у 77% алкоголиков присутствует аллель А1, вместе с тем у 72% контрольных образцов этот аллель отсутствует. Впоследствие ассоциация А1 аллеля с алкоголизмом подтвердилась при мета-анализе (Noble 2003). Считается, что аллель А1 связан не с алкоголизмом вообще, а скорее с тяжелыми формами алкоголизма, а также импуль сивным поведением, маниакальным поведением, склонностью к азартным играм (Dick and Foroud 2003). В работе (Munafo, Johnstone et al. 2005) показана прямая связь между аллелем А1 и количеством потребляемого человеком алкоголя. Также Taql А Ассоциирован с СДВГ (Faraone, Perlis et al. 2005). Генотип A2/A2 ассоциирован с шизофренией в отдельных популяциях, с резистентностью к нейролептикам у шизофреников, с негативной шизофренией (Голимбет2004), (Kukreti, Tripathi et al. 2006).
Часто сообщения о статистически значимых отличиях частоты тех или иных генотипов либо аллелей у больных шизофренией не подтверждаются при проведении исследований на выборках из других популяций (Spurlock, Williams et al. 1998), (Glatt, Faraone et al. 2004). В связи с этим ведётся поиск характеристик, которые при исследовании в рамках анализа ассоциации давали бы более воспроизводимый результат, чем диагноз шизофрении сам по себе.
Рецепторы D3 подтипа задействованы в эмоциональной и когнитивной деятельности. На молекулярном уровне их действие выражается в ингибиро-вании аденилатциклазы через ингибиторные G-белки.
В гене DRD3 присутствует SNP, который выражается в вариации се-рин/глицин в положении 9. Аллель S, возможно, ассоциирован с шизофренией, шизоаффективным расстройством и другими заболеваниями (Szekeres, Keri et al. 2004).
Была обнаружена позитивная связь между одним этим аллелем и алкоголизмом со слабоумием, но не со всей выборкой алкоголиков (Dick and Foroud 2003).
DRD4. Функции рецептора D4 связывают с модуляцией моторной активности и с ингибированием пассивного избегания. Считается, что активация данного рецептора тормозит активность нейрона.
Алкоголизм и ферменты, утилизирующие этанол
Изучение генетических основ когнитивного функционирования является быстроразвивающейся областью исследований, которые помогут поиску новых способов лечения нейрокогнитивных нарушений, возникающих при многих психиатрических расстройствах и старении. К настоящему времени сообщается об ассоциациях ряда генов-кандидатов с когнитивными функциями (Payton, Holmes et al. 2001).
Нарушения внимания характерны для многих психических расстройств и состояний. Нарушения произвольного внимания у больных шизофренией хорошо выявляются клинически и могут быть измерены с помощью нейрофизиологических и нейропсихологических методов.
В современных работах по вниманию большое внимание уделяется различению произвольного и непроизвольного внимания, которое восходит еще к У. Джеймсу (1902). Произвольное внимание направляется на объект под влиянием намерения субъекта, требует усилий, осознается и подчинено прямому контролю с его стороны. Автоматическое, или непроизвольное, возникает в результате воздействия сенсорного раздражителя. С этой дихотомией тесно связаны представления о двух видах переработки информации - «сверху-вниз» и «снизу-вверх». Процессы первого рода, или концептуально-ведомая переработка, требующие произвольного внимания, находятся под строгим контролем в соответствии со стоящими перед человеком задачами, управляются его знаниями и ожиданиями. Процессы второго рода, или ведомые данными, запускаются характеристиками внешних объектов, вовлекая все более высокие уровни переработки информации, необходимые для идентификации стимулов. Важно подчеркнуть, что автоматическое и произвольное внимание не являются дискретными категориями, между двумя видами имеется ряд переходных процессов. В то же время процессы, объединяемые в рамках одной категории, не являются нейробиологически однородными, имея различный нейрональный субстрат. Эти многослойные системы позволяют организму отфильтровывать тривиальные сигналы и концентрировать усилия на обработке значимых стимулов, тем самым, повышая эффективность деятельности.
Избирательность является одной из основных характеристик внимания, и заключается в способности субъекта выбирать из множества сигналов, находящихся в его сеносорно-перцептивной зоне, только некоторые из них в соответствии с поставленной задачей. Избирательность внимания может быть охарактеризована со стороны скорости и точности выбора стимула из множества других.
Нарушение внимания является одной из ключевых особенностей патогенеза шизофрении. В частности, характеристики произвольного внимания занимают первоочередное место среди ряда показателей, для которых наблюдаются наибольшие различия между больными шизофренией и кон трольными группами (Heinrichs 2004). Многие исследователи рассматривают его в качестве эндофенотипа этого заболевания.
Большое число исследований посвящено поиску генов, ассоциированных с различными параметрами внимания, как избирательного так и автоматического, и другими когнитивными характеристиками.
К настоящему времени в ряде работ найдены ассоциации ряда генов с параметрами внимания как в норме (Caldu, Vendrell et al. 2007; MacDonald, Carter et al. 2007), так и у больных с различными психическими патологиями (Oh, Shin et al. 2003; Kieling, Roman et al. 2006; Straub, Lipska et al. 2007; Ucok, Alpsan et al. 2007; Opgen-Rhein, Neuhaus et al. 2008; Голимбет et al. 2008).
Одним из наиболее вероятных генов-кандидатов является ген кате-хол-О-метилтрансферазы. Носители аллеля Met лучше выполняют Wisconsin Card Sorting Test (рабочая память). В этой же выборке Val-вариант был ассоциирована с шизофренией.
Когнитивные способности зависят от активности лобных долей, и соответственно, от уровня дофамина в этих областях. Дофамин модулирует активность нейронов, вовлечённых в осуществление таких функций, как рабочая память (Malhotra, Kestler et al. 2002).
Предполагается, что дофамин улучшает нейрофизиологическое соотношение «сигнал/шум» в поясной коре. Таким образом СОМТ, как фермент, утилизирующий дофамин, существенным образом регулирует уровень ней-ромедиатора в лобных долях, и влияет на активность последних.
Гомозиготы Val/Val демонстрируют большую активность и худшее выполнение тестов, связанных со вниманием. Чем больше необходимость в удерживании внимания при выполнении теста, тем более значимы эти результаты (Blasi, Mattay et al. 2005).
Анализ микросателлитов с помощью пцр с флуоресцентно мечеными праимерами с последующим капиллярным электрофорезом
Микросателлиты представляют собой другой распространенный тип генетического полиморфизма, наряду с SNP. Повторы двух-, трёх- и четы-рёхнуклеотидных участков встречаются в различных последовательностях генома, в том числе в кодирующих последовательностях генов. Анализ ассоциации с использованием микросателлитных маркеров представляет собой ценный инструмент поиска генов, ассоциированных с теми или иными признаками.
В рамках нашей работы было проведено генотипирование следующих микросателлитов: AR (CAG)„, ER (GGGA)n, GRIN2A (GT)n, AVPRla RSI, AVPRlaRS3.
Для генотипирования проводили ПЦР с использованием праймеров, ограничивающих участок, содержащий полиморфный маркер. Один из праймеров был модифицирован специфическим красителем. Продукты реакции анализировались с помощью капиллярного электрофореза. Применение различных красителей и подбор ампликонов разной длины позволил анализировать одновременно несколько микросателлитных маркеров. С помощью данного метода также были проанализированы образцы из коллекции боль ных психозами и здоровых людей, охарактеризованных с помощью ряда психологических тестов. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc.).
Различия в частоте генотипов между группами при анализе ассоциации рассчитывали с помощью критерия %2 Пирсона, дополненного показателем OR (отношение шансов), оценивающим риск развития заболевания. Для оценки ассоциации между полиморфным маркером G444A гена DBH и параметрами, полученными с помощью теста Мюнстерберга, был проведён дисперсионный анализ (ANOVA). Оценивалось различие между средними значениями параметров в группах испытуемых с одинаковым генотипом.
Частоты гаплотипов рассчитывались с помощью ELB-алгоритма в программах Arlequin 3.0 (Excoffier, Laval et al. 2005) и Unphased (Dudbridge 2008).
Мета-анализ проводили с помощью программы EasyMA (Cucherat, Boisseletal. 1997).
В нашем распоряжении имелось несколько выборок, охарактеризованных по различным психологическим и психиатрическим показателям: выборка больных шизофренией; выборка больных алкоголизмом; выборка людей, склонных к суицидальному поведению и контрольная выборка, состоящая из психически здоровых людей. От каждого участника были получены образцы биологических тканей (кровь либо волосяные луковицы) и выделена геномная ДНК. Таким образом, мы имели возможность проверить наличие ассоциации генов-кандидатов с тем или иным фенотипом.
Для этого были выбраны полиморфные маркеры ряда генов, активных в центральной нервной системе. Основаниями для выбора служили данные литературы. В первую очередь в список вошли хорошо известные марке-ры,такие как СОМТ Val58Met или DRD2 TaqlA, для которых накоплено много данных об их возможной связи с поведением. Также были выбраны менее известные полиморфизмы, предположительно имеющие функциональное значение (DRD2 rs6277), и несколько маркеров, которые ранее не анализировались пи в одной выборке {DRD2 rs 1800498, маркеры генаЖМТ).
Для каждого маркера была разработана методика генотипирования. Предпочтение отдавалось методу 5 -нуклеазного анализа, как наиболее удобному и эффективному для генотипирования небольших количеств полиморфных сайтов. В тех случаях, когда особенности последовательности геномной ДНК, окружающей полиморфный локус (например, низкий GC-состав), или иные обстоятельства препятствовали созданию эффективных праймеров и зондов, создавалась альтернативная методика на основе технологий HRM или аллель-специфической ПЦР. Для проверки валидности ме тода часть образцов дополнительно анализировалась с помощью секвениро-вания или PEP.
Часть образцов была дополнительно генотипирована по ряду маркеров с помощью методик, разработанных в Исследовательской лаборатории им.С.Херцог (Иерусалим, Израиль). При этом использовались методы PEP (для анализа однонуклеотидных замен) и ПЦР с флуоресцентными прайме-рами с последующим капиллярным электрофорезом (для анализа вариантов микросателлитов).
После генотипирования проводилась статистическая обработка результатов: сравнивались частоты различных аллелей, генотипов и гаплотипов. Для анализа количественных признаков проводился дисперсионный анализ.
LINK4 Разработка методик генотипирования с помощью 5'-нуклеазного анализа. Проверка точности генотипирования с помощью прямого секвенирования геномной днк LINK4
В объединённой выборке были обнаружены статистически значимые различия как для числа слов, найденных как в первой серии (F(2, 287)=3,913, р=0,021), так и во второй (F(2, 287)=3,306, р=0,0381). В обоих случаях носители генотипа АА находят больше слов, носители генотипа GG - меньше, а гетерозиготы демонстрируют средние значения. Таким образом, в данной выборке присутствие аллеля А полиморфного маркера G444A гена DBH оказывает зависимый от дозы аллеля эффект на параметры выполнения теста Мюнстерберга.
При рассмотрении выборок больных и здоровых по отдельности статистически значимое различие наблюдалось только в случае сравнения числа слов наиденных в первой серии в выборке больных шизофренией (F(2, 79)=4, р=0,022). В других сравнениях результаты не соответствовали необходимому уровню значимости (0,05), однако наблюдалась та же тенденция, что и в объединённой выборке - носители генотипа АА выполняли тест лучше. Исключение составили результаты сравнения числа слов, найденных во второй серии больными шизофренией: носители всех трёх генотипов находили приблизительно одинаковое количество слов. Это отсутствие общей закономерности было обнаружено при рассмотрении диагноза шизофрении в качестве дополнительного фактора в дисперсионном анализе. А именно, дисперсионный анализ с рассмотрением числа слов, найденных во второй серии, в качестве зависимой переменной, и генотипа и наличия диагноза шизофрении в качестве независимых факторов показал, что в объединённой выборке имеет место взаимодействие данных факторов (F(2, 284)=3,2, р=0,04).
Отсутствие статистической значимости при разбиении общей выборки на группы в соответствии с наличием диагноза можно объяснить уменьшением размеров выборок в результате разбиения. Принимая во внимание общую тенденцию к зависимости эффективности выполнения теста от генотипа, можно утверждать, что основным фактором, ограничивающим возможности обнаружения статистически значимой зависимости, является именно размер выборок. Отсутствие общей закономерности среди больных (во второй серии теста) можно объяснить относительно небольшим числом испытуемых.
В подтверждение данных литературы (Heinrichs 2004), параметры внимания были значительно снижены у больных (F(l, 288)=40,3, р 0,000001 в первой серии; F(l, 288)=69,5, р 0,000001 во второй серии). Однако, как от мечено выше, частоты генотипов среди больных и здоровых испытуемых значимо не отличались, что позволяет объединить две выборки для исследования влияние генотипа на результативность выполнения теста.
Включение в дисперсионный анализ возраста и пола испытуемых в качестве дополнительных факторов не выявило статистически значимых закономерностей.
Таким образом, мы обнаружили ассоциацию полиморфного маркера DBH G444A и избирательного внимания, оцениваемого с помощью теста Мюнстерберга. Как было показано в работе Cubells et al (Cubells, Kammen et al. 1998), данный маркер ассоциирован с уровнем активности фермента в плазме крови и концентрацией его в спинномозговой жидкости. Поскольку количество дофамин-Р-гидроксилазы является основным фактором, определяющим его активность в плазме и спинномозговой жидкости, эти результаты можно интерпретировать как ассоциацию активности DBH с маркером G444A в обоих случаях. Аллель 444А соответствовал низкой активности, 444G - высокой. На основании данных об уровнях дофамина, норадреналина и их продуктов метаболизма в плазме крови больных СДВГ, предполагается, что низкая активность фермента может соответствовать пониженному вниманию (Kopeckova, Paclt et al. 2006), что не согласуется с нашими данными, показывающими лучшие характеристики избирательного внимания у носителей аллеля 444А.
Однако, в литературе отсутствуют какие-либо сведения о функциональном значении маркера G444A.. Данный маркер расположен в третьей позиции кодона и не приводит к изменениям аминокислотной последовательности белка. Теоретически, полиморфизм может влиять на эффективность альтернативного сплайсинга, поскольку находится на границе между экзо-ном 2 и интроном 2 гена DBH (Kobayashi, Kurosawa et al. 1989), но экспериментальные подтверждения этому не найдены.
