Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Полиморфные маркеры 8
1.1.1. Типы полиморфизмов и методы их исследования 8
1.1.2. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний 15
1.2. Ишемическая болезнь сердца и ОКС 18
1.2.1. Основные аспекты этиологии и патогенеза ишемической болезни сердца 18
1.2.2. Генетические факторы риска развития ишемической болезни сердца 22
1.2.3. Острый коронарный синдром 23
1.3. Система гемостаза 28
1.4. Система липидного обмена 32
1.5. Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров 36
1.5.1. Липопротеины. Ген LPL. Пролиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС 36
1.5.2. Аполипротеин В. Ген АРОВ. Пролиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС . 40
1.5.3. Аполипротеин Е. Ген АРОЕ. Пролиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС. 46
1.5.4. Фибриноген. Ген FGB. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС 51
1.5.5. Белок С. Ген PROC. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС 57
2. Материалы и методы 59
2.1. Объект исследования. Критерии включения пациентов в исследование 59
2.2. Реактивы и ферменты 64
2.3. Буферные растворы 65
2.4. Выделение геномной ДНК 65
2.5. Амплификация ДНК 66
2.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами 61
2.7. Электрофоретическое разделение ДНК 67
2.8. Статистическая обработка результатов 69
2.8.1.Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов 69
2.8.2. Построение кривых Каплана-Мейера 70
2.8.3. Коррекция уровня значимости 70
3. Результаты и их обсуждение 71
3.1 Исследование ассоциации полиморфных маркеров с ОКС 71
3.1.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров Ser447Ter гена LPL с ОКС 71
3.1.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров T(-93)G гена LPL с ОКС 74
3.1.3. Исследование ассоциации полиморфного маркера T(-219)G гена АРОЕ с ОКС 75
3.1.4. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(-516)Т гена АРОВ с ОКС 78
3.1.5. Исследование ассоциации полиморфного маркера G(-455)A гена FGB с ОКС 80
3.1.6. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(-1654)Тгена PROC с ОКС 83
4. Выводы 92
5. Список литературы 93
- Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний
- Аполипротеин В. Ген АРОВ. Пролиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС
- Расщепление продуктов амплификации рестриктазами
- Исследование ассоциации полиморфных маркеров Ser447Ter гена LPL с ОКС
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной инвалидности и смертности в экономически развитых странах, при этом на долю ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда приходится примерно две трети случаев смерти от сердечно-сосудистых заболеваний.
К настоящему моменту описано большое количество факторов, определяющих повышенную вероятность неблагоприятного исхода после эпизода обострения ишемической болезни сердца (ИБС). Однако, выявление среди всех больных тех, у кого риск таких осложнений максимален, все еще остается до конца не решенной задачей. Влияние факторов гемостаза, воспаления, липидов крови, глюкозы и веществ, участвующих в ее метаболизме, изучалось во многих научных работах. Большинство авторов отмечают их взаимосвязь с развитием неблагоприятного исхода у больных ИБС.
В то же время, роль генетических факторов в развитии обострений ИБС изучена недостаточно. При этом следует отметить, что исследования, проведенные на парах сибсов, показали значительно более высокую конкордантность развития ИБС и его осложнений у однояйцовых близнецов, чем у разнояйцевых близнецов, а также при семейной отягощенности (De Faire and Pedersen, 1994). Эти данные позволяют уверенно говорить о существенной роли генетической предрасположенности в развитии атеросклероза и производных от него осложнений.
В развитии осложнений ИБС ключевую роль играют процессы, объединяемые сегодня термином «атеротромбоз» (Балуда, 1980; Фермилен, 1986). При этом нарушения в системах гемостаза и липидного обмена могут усугубляться генетическими особенностями, влияющими на структуру и скорость формирования этих процессов. Гены, кодирующие эти факторы, можно рассматривать в качестве кандидатов для изучения наследственной предрасположенности к осложнениям ИБС (Pratt, 1999). Носительство определенных аллельных вариантов этих генов может быть связано с повышенным риском развития заболевания и/или его осложнений.
Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного
пациента. Подобные исследования позволяют точнее и надежнее оценивать генетический риск развития заболевания и прогнозировать его течение.
Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с неблагоприятным исходом у больных, перенесших острый коронарный синдром. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Определить аллели и генотипы полиморфных маркеров генов, кодирующих липазу липопротеинов (LPL), аполипопротеин Е (АРОЕ), аполипопротеин В (АРОВ), фибриноген (FGB) и белок С (PROC).
Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров данных генов-кандидатов в исследованной выборке больных для выявления вклада генетических факторов в развитие различных типов неблагоприятного исхода у больных, перенесших острый коронарный синдром.
Изучить ассоциацию факторов риска с неблагоприятными исходами. Научная новизна работы. В данной работе впервые исследована ассоциация
полиморфных маркеров Ser447Ter и T(-93)G гена LPL, T(-219)G тепа АРОЕ, С(-516)Т гена АРОВ, G(-455)A гена FGB и С(-1654)Т гена PROC с развитием острого коронарного синдрома.
Обнаружена ассоциация полиморфного маркера С(-1654)Т гена PROC с повышенным риском развития неблагоприятного исхода в группе больных, перенесших эпизод обострения ИБС. Установлено, что носительство генотипов СТ и ТТ полиморфного маркера С(-1654)Т гена PROC, которые ассоциированы с меньшим уровнем белка С, ответственного за антикоагулянтную активность системы гемостаза, независимо связано с наступлением таких неблагоприятных исходов как нефатальный и фатальный инфаркт миокарда (ИМ), нефатальный и фатальный инсульт, нестабильная стенокардия (НС), потребовавшая госпитализации, внезапная коронарная смерть и смерть от других причин.
Практическая ценность работы. Выявление ассоциации полиморфных маркеров генов с развитием острого коронарного синдрома (ОКС) открывает новые перспективы в выделении групп пациентов с высоким риском развития патологии. Полученные данные об ассоциации полиморфного маркера С(-1654)Т гена PROC с развитием неблагоприятного исхода в группе больных, перенесших эпизод обострения ИБС, позволяют внедрить генетическое тестирование больных ИБС для
выделения лиц, имеющих максимальную предрасположенность к развитию неблагоприятных исходов, и указывают на возможное направление разработки новых лекарственных средств.
Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 10 ноября 2010 г. Результаты настоящей работы докладывались на IV-ой международной конференции "Перспективное прогнозирование в биологии" (о. Санторин, Греция, 21 -23 сентября 2008 г.); на Российском национальном конгрессе кардиологов "Повышение качества и доступности кардиологической помощи" (г. Москва, Россия, 07 - 09 октября 2008 г.), Российском национальном конгрессе кардиологов "Кардиология: реалии и перспективы"(т. Москва, Россия, 06 - 08 октября 2009 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, включая 2 статьи, а также материалы конференций.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и содержат 20 таблиц и 10 рисунков. В работе процитированы 201 зарубежный и 42 отечественных литературных источника.
Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний
Изучение наследственной предрасположенности к много факторным заболеваниям крайне важно для их диагностики и терапии. Для оценки роли наследственных факторов в развитии многофакторного заболевания, как правило, используют анализ сцепления, анализ ассоциации или экспериментальные модели развития заболевания на животных [38].
Большую практическую ценность представляет исследование сцепления или ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов, продукты которых вовлечены в патогенез многофакторного заболевания [38]. Анализ сцепления основан на определении вероятности совместного наследования фенотипического признака (заболевания) и исследуемого маркера в семье. При этом исследуют совместную сегрегацию генов при передаче от родителей к потомкам в ряду поколений [38].
При использовании метода идентичных по происхождению аллелей (IBD, identical by descent) информацию о сцеплении получают в результате анализа наследования аллелей полиморфных маркеров в парах больных родственников без предварительного выбора типа наследования и других характеристик. Данный подход заключается в оценке того, насколько чаще по сравнению со случайной сегрегацией пара больных родственников (чаще всего для анализа используют сибсовые пары) наследует один и тот же аллель [39]. Анализ сцепления может проводиться с исследованием как ядерных (оба сибса больны), так и простых (один сибс болен, а один здоров) семей. При этом оцениваются шансы (вероятности) за и против сцепления в данной семье.
Количественным показателем сцепления является логарифм соотношения шансов (правдоподобия) за и против сцепления - лод-балл (от английского «logarithm of odds ratio»). Сцепление считается подтвержденным, если лод-балл превысит значение 3,0 (т.е. вероятность совместного наследования признака и маркера в 1000 раз больше, нежели вероятность их раздельного наследования) [40]. Если ни на одной из проанализированных семей не обнаруживается статистически значимое сцепление, лод-балл рассчитывают, используя суммарные данные для нескольких семей. При этом необходим тщательный отбор семей из общей группы по фенотипическим признакам, позволяющих объединить их в одну подгруппу [41].
В настоящее время активно используют мультилокусный анализ сцепления, при котором рассчитывается соотношение вероятностей для каждого интервала между двумя соседними из десятков и сотен полиморфных маркеров, распределенных по всему геному. Интервалы, для которых значения лод-балла превышают 3,0, считают наиболее вероятными областями локализации гена, ассоциированного с конкретной патологией.
Наряду с анализом сцепления, при использовании которого необходимы полные семьи с двумя сибсами, в методе неравновесной передачи аллелей (TDT, transmission disequilibrium test) могут использоваться семьи с единственным потомком. Этот метод основан на анализе частот передачи аллелей полиморфных маркеров, расположенных в интересующей исследователя области генома, от гетерозиготных по данному маркеру родителей к больному потомку. Для сравнения используют аналогичные гетерозиготные семьи, но со здоровым потомком [42].
Чаще всего исследования связи между генетическими маркерами и наследственными заболеваниями проводятся с использованием метода «случай-контроль» (case-control). При этом проводят анализ распределения аллелей и генотипов исследуемого генетического маркера в выборке из неродственных здоровых лиц (популяционный контроль) и в группе больных (группа «случай») с тем, чтобы выявить значимые различия в частоте генетического маркера (аллеля). Генетический маркер считается ассоциированным с болезнью, если его частота среди больных значимо выше, нежели в контрольной выборке [443]. Наличие ассоциации либо свидетельствует о прямой связи между исследованным локусом и наследственной патологией, либо в основе ассоциации может лежать неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом, обуславливающим развитие болезни, если эти локусы расположены достаточно близко друг от друга [443].
Группы сравнения должны быть правильно подобраны и хорошо охарактеризованы клинически и биохимически. Необходимо, чтобы они были гомогенны по негенетическим факторам риска. Но, несмотря на это, ассоциация может оказаться мнимой за счет негомогенности популяции, малочисленности выборок и некорректности критериев отбора при формировании выборок больных и здоровых индивидов. Нежелательных эффектов, связанных с этнической неоднородностью популяции, можно избежать, проводя анализ ассоциации в гомогенных изолированных популяциях. Также, для увеличения достоверности ассоциации желательно проводить исследование на достаточно большой панмиксной популяции [44].
Кроме того, в анализ методом «случай-контроль», как правило, не входят пациенты, ранее умершие от данного заболевания. Именно поэтому в нашем исследовании ставится задача определения частоты развития осложнений ИБС на большой группе пациентов, перенесших острый коронарный синдром. Параллельно в этой же группе пациентов будет осуществляться определение аллелей и генотипов полиморфных маркеров большой группы генов-кандидатов, что позволит изучить вклад генетических факторов в развитие различных типов неблагоприятного исхода у больных с ИБС.
Метод поиска ассоциации между полиморфными маркерами определенных локусов, содержащих гены-кандидаты, и клиническим проявлением заболевания - это единственно возможная стратегия генетического анализа при отсутствии семейного материала.
Аполипротеин В. Ген АРОВ. Пролиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС
Аполипопротеин В (АроВ) — один из основных белков, входящих в состав ЛПОНП и J ШИП. Он является компонентом всех классов липопротеинов, с которыми связывают развитие атеросклероза, причем повышенная концентрация ароВ в плазме — фактор риска ИБС и развития атеросклероза у лиц с ожирением. АроВ необходим для синтеза и секреции хиломикронов и ЛПОНП и является основным лигандом для рецептора ЛПНП. Помимо этого, он принимает участие в транспорте холестерина и триглицеридов в составе липопротеинов.
АроВ известен в двух основных формах: ароВ-100, синтезирующийся в печени, и ароВ—48, синтезирующийся в кишечнике и связанный с транспортом хиломикронов и ЛПОНП из кишечной стенки в лимфу, а оттуда в кровь. В отличие от ароВ-100, ароВ-48 не способен связываться со специфическими рецепторами и связывание липопротеиновых частиц, содержащих этот апобелок происходит при участии аполипопротеина Е, передаваемого на них с ЛПВП. Примечательно, что АроВ-100 в составе ЛПОНП может взаимодействовать с рецепторами только после воздействия на эти липопротеины липазы липопротеинов, так как до этого частицы липопротеинов находятся не в той конформации, которая необходима для связывания, и ароВ не может взаимодействовать с рецептором.
Аминокислотная последовательность АроВ-100 расшифрована полностью. Этот белок с молекулярной массой 512 кДа содержит 4536 аминокислот и сигнальный пептид из 27 аминокислот [128, 130]. Ген аполипопротеина В расположен на хромосоме 2 в области 2р23-р24 и в нем обнаружено несколько полиморфных участков.
Ген аполипопротеина В человека содержит 29 экзонов и 28 интронов, и его общая длина составляет 43 т.п.о. Расположение интронов ассиметрич-ное, большинство их расположено в 5 -концевой трети гена. Ген АРОВ имеет 2 необычно длинных экзона (1906 и 7572 пар оснований). Длина мРНК этого гена составляет 14 тысяч оснований [127].
В середине самого большого экзона 26 в положении 6666 расположен кодон САА, кодирующий глутамин. Некоторые из мРНК, подвергаются редактированию в положении 6666. Молекулярным механизмом редактирования мРНК гена АРОВ является специфическое дезаминирование цитозина с помощью цитидиндезаминазы. Замена остатка С на остаток U приводит к образованию стоп-кодона UAA и синтезу более короткой мРНК длиной в 7 тысяч оснований [127].
В результате трансляции редактированных мРНК образуется укороченный белок апоВ-48 (241 кДа), который содержит 2152 N-концевых аминокислотных остатков апоВ-100. В функциональном отношении этот белок остается полностью активным, однако у него отсутствует С-концевой домен апоВ-100, который отвечает за связывание с рецептором липопротеинов низкой плотности.
Повышенный уровень АроВ ассоциирован с сердечно-сосудистыми заболеваниями и атеросклерозом. Уровень АроВ в плазме выше у больных, перенесших ИМ, в сравнении с больными без ИБС (1,12 ± 0,57 против 0,86 ± 0,27 г/л, р = 0,0001). Многофакторный анализ показал, что уровень апоВ свыше 1,7 г/л коррелирует с ИМ (OR = 3,96; 95% СІ 2,87-5,02, р = 0,001) [131].
Повышенный уровень АроВ является независимым фактором риска развития ИБС [132, 132, 135, 136]. В популяции датчан было проведено обследование 9231 человек без симптомов сердечно-сосудистых заболеваний. Наблюдение за ними проводилось в течение- 8 лет, за это время были зафиксированы следующие события: ИБС - у 591, ИМ - у 278, ишемические цереброваскулярные события - у 313, ишемический инсульт - у 229, любое ишемическое сердечно-сосудистое событие у 807 больных [133]. Авторы показали, что уровень АроВ позволяет предсказывать ишемические сердечно-сосудистые события у больных лучше, чем уровень холестерина в составе ЛПНП.
В одном из мета-анализов было показано, что наследственно опосредуемый уровень липидов ухудшает прогноз и риск прогрессирования ИБС в 1,5 раза [134] и сопоставим со значимостью таких факторов, как курение, возраст и пол. В качестве потенциальных генов-кандидатов, определяющих состояние сердечно-сосудистой системы, могут рассматриваться гены аполипопро-теинов, в частности АРОВ. Аполипопротеин В — один из наиболее важных структурных апобелков частиц хиломикронов, липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). Он также играет важную роль в сборке и секреции частиц хиломикронов из тонкой кишки и ЛПОНП из печени, а также является лигандом для рецепторов, связывающих ЛПНП, таким образом, опосредуя поступление холестерина внутрь клеток [137].
Аполипопротеин В - участник сборки и секреции липидтранспортных частиц - липопротеинов (ЛП), содержащих триглицериды (ТГ) и холестерин как экзогенного, так и эндогенного происхождения. Его роль также незаменима во внутрисосудистом транспорте и опосредованной рецептором элиминации различных классов липопротеинов. Центральная роль, которую играет АРОВ в транспорте липидов, позволяет высказать предположение, что одной из основных причин различия в уровне липидов у разных индивидов, может быть именно носительство определенных аллельных вариантов гена.
В гене АРОВ известен ряд полиморфных участков, один из которых связан с образованием дефектного белка, не связывающегося с рецептором ЛПНП (Arg3500Gln\ а остальные представляют собой по большей части полиморфные участки узнавания рестриктаз (Xbal, EcoRI) и делеции, приводящие к сдвигу рамок считывания и образованию укороченных молекул АРОВ [138, 139]. Для некоторых полиморфных маркеров показана ассоциация с сердечно-сосудистыми патологиями [140], а также с ИМ и макроангиопатиями при диабете типа 2 [119].
Расщепление продуктов амплификации рестриктазами
Больные, у которых в результате ОКС сформировался ИМ с зубцом Q, должны были поступить в стационар не позднее 10 дней с момента начала заболевания и удовлетворять по крайней мере одному из следующих дополнительных критериев: - стойкий подъем сегмента ST не менее 1 мм в двух смежных отведениях от конечностей или не менее 2 мм в двух соседних грудных отведениях; - появление новой блокады левой ножки пучка Гиса; - динамика острого ИМ (появление патологических зубцов Q, снижение зубца R, изменение конечной части желудочкового комплекса); - повышение уровня кардиоспецифических ферментов в крови. Таким образом, в исследование вошли как больные, которые поступили в острой фазе ОКС, так и те, кто перенес наиболее опасный период заболевания "на ногах". Поскольку основная цель исследования состояла в анализе критериев риска развития повторного обострения ИБС, наблюдение за больными начинали на 10 день от развития ОКС при условии стабилизации состояния и при отсутствии в течение предшествующих 10 дней таких событий как: - рецидив ИМ; - повторные симптомы ишемии длительностью более 10 мин у больного, получающего оптимальную медикаментозную терапию; - повторные изменения электрокардиограммы, свидетельствующие об ишемии; - повторное повышение уровня кардиоспецифических ферментов. Иначе говоря, в исследование не попадали больные, умершие от ОКС в первые 10 дней обострения ИБС. При контрольных обследованиях регистрировали неблагоприятные клинические исходы, такие как сердечно-сосудистая смерть, нефатальный ИМ, нестабильная стенокардия, нефатальный инсульт, осложненный атеросклероз периферических артерий, потребовавший госпитализации в хирургический стационар. Также учитывали все случаи проведения процедур реваскуляризации. Поскольку в нашей стране хирургическая реваскуляризация миокарда выполняется достаточно редко, состояние больных учитывали только до момента вмешательства на коронарных артериях, в последующем больных считали "потерянными" для наблюдения. Всего обследовано 1145 больных (717 (62,6%) мужчин и 428 (37,4%) женщин). Средний возраст больных составил 61,6 ± 10,2 г. Диагноз ИБС в анамнезе установлен у 67,1% из них, 32,1% перенесли ИМ. Отмечена большая распространенность артериальной гипертонии (81,5%), 56,9% этих больных принимали гипотензивные препараты. Симптоматический периферический атеросклероз диагностирован у 12,9% больных. Указания на недостаточность кровообращения в анамнезе имели 54,1% больных. Инсульт перенесли 9,4% больных. У 14,6% больных в анамнезе отмечен сахарным диабет. Курили на момент госпитализации 38,5% больных, еще 16.2%о курили в прошлом. С учетом изменений на ЭКГ стандартным критериям ИМ с формированием Q зубца отвечали 46,4%, ИМ без зубца Q или нестабильной стенокардии - 53,6%. Конечными точками считались развитие повторного крупноочагового или мелкоочагового ИМ, смерти, ОНМК, а также реваскуляризации, коронарная ангиография, повторные госпитализации, в том числе и по причине не сердечно-сосудистых заболеваний. Определение конечных точек: 1. Острый инфаркт миокарда — это сердечно-сосудистое событие, которое имело следующие критерии: а) типичная динамика биохимических маркеров некроза миокарда до величины свыше двух высших границ нормы (или, если маркеры уже увеличены, более чем на 50% минимального уровня обнаружения фермента по сравнению с исходным уровнем); б) и один из следующих показателей: симптомы ишемии, появление патологических зубцов Q на ЭКГ, изменения ЭКГ, свидетельствующие об ишемии (динамика ST сегмента), вмешательство на коронарных артериях; в) патологоанатомические данные в пользу острого инфаркта миокарда. 2. Перенесенный инфаркт миокарда выявлен на основании появления новых зубцов Q на ЭКГ (в сравнении с ЭКГ от предыдущего визита), а также документированный в другом стационаре инфаркт миокарда. 3. Нестабильная стенокардия была определена как повторяющаяся боль в грудной клетке и/или симптомы ишемии, продолжающиеся более 5 минут, с документированными характерными изменениями ЭКГ, которые свидетельствовали об ишемии, а также отсутствие повышения уровня кардиоспецифических ферментов и маркеров повреждения миокарда. 4. Все случаи смертельного исхода объединены понятием «общая смертность» и разделены по генезу на «обусловленные сердечно-сосудистой патологией» и «не связанные с сердечно-сосудистой патологией». Смертельный исход, «обусловленный сердечно-сосудистой патологией», разделен по генезу на «сердечно-сосудистую смертность» и смертность от «другой сердечно-сосудистой патологии». Смерть, наступившая в результате острого инфаркта миокарда, проведения АКШ, внезапной сердечной смерти отнесены к категории «сердечно-сосудистой смертности».
К категории смерти от другой сердечно-сосудистой патологии отнесены все дополнительные случаи, связанные с сердечно-сосудистой системой (т.е. смерть от инсульта, тяжелого кровотечения, легочной эмболии). К рубрике «не связанные с сердечно-сосудистой патологией смертельные исходы» отнесены все случаи явно не кардиологического генеза (например, смерть от злокачественных новообразований, травм, инфекций и т.п.). Причина смерти устанавливалась на основании данных патологоанатомического исследования.
Исследование ассоциации полиморфных маркеров Ser447Ter гена LPL с ОКС
В промоторной области гена FGB в положении —455 обнаружен однонуклеотидный полиморфизм G/A. Существенно то, что полиморфный маркер G(—455)A гена FGB ассоциирован с уровнем фибриногена в плазме крови, а наличие аллеля А в положении —455 определяет повышенный уровень транскрипции гена FGB [199а]. Аллели данного полиморфного маркера можно идентифицировать с помощью ПЦР с последующим расщеплением продукта амплификации рестриктазой НаеШ. Размер продукта амплификации 227 п.н. Наличие фрагмента длиной 227 п.н. после обработки рестриктазой НаеШ соответствует генотипу АА, двух фрагментов (103 и 124 п.н.) - генотипу GG и трех (227, 124 и 103 п.н.) - гетерозиготному генотипу AG. Длины рестриктазных фрагментов уточнены по последовательности гена, взятой из базы данных OMIM 134830.
В нашей работе полиморфный маркер A(-455)G гена FGB не показал ассоциации с выживаемостью больных, перенесших обострение ИБС. У больных - носителей разных генотипов этого полиморфного маркера, частоты развития неблагоприятного исхода не различались (Табл. 11 и 12, Рис. 6).
Ассоциация этого полиморфного маркера достаточно активно изучалась многими исследователями, но данные, касающиеся ассоциации этого полиморфного маркера с атеросклерозом сосудов и ИБС противоречивы. По данным некоторых авторов генотип аллель А ассоциируется с повышением уровня фибриногена, атеросклерозом периферических артерий [206], а также с быстрым прогрессированием коронарного атеросклероза [207]. Другие исследователи публикуют данные доказывающие, что среди больных перенесших ИМ преобладают носители генотипа GG [211]. В китайской популяции носители аллеля А имели пониженный риск развития инфаркта миокарда [212].
Частоты аллелей в изученной нами группе больных были близки к частотам, наблюдаемым у европейцев [233]. Результаты, полученные в ходе определения ассоциации полиморфного маркера A (-455JG гена FGB с ИБС и ее осложнениями в разных этнических группах, достаточно противоречивы. В ряде работ показано, что этот фактор несуществен для прогноза ИБС в общей популяции [188, 234, 235]. Отсутствие ассоциации этого полиморфного маркера с ИБС и ИМ обнаружено и в других работах [233, 200, 236].
Результаты нашей работы вступают в определенное противоречие с нашими предыдущими данными [237, 238], в которых было показано, что полиморфный маркер G(—455)A гена FGB ассоциирован с развитием ишемического инсульта у русских, с риском инсульта и его частотой у больных гипертонией или у курильщиков. По всей видимости, такие результаты были получены из-за относительно небольшой выборки и непродолжительного времени наблюдения за больными, что еще раз подтверждает актуальность настоящей работы, где использована большая группа пациентов с длительным сроком наблюдения.
Связи между генотипами полиморфного маркер G(-455)A гена FGB и смертностью, а также риском развития «коронарного» НИ (нефатальный и фатальный ИМ, НС, потребовавшая госпитализации и внезапная коронарная смерть) выявлено не было. После разделения группы больных на мужчин и женщин, ассоциации между генотипами полиморфного маркера маркер G(-455)А гена FGB и дожитием до конечной точки также выявлено не было.
В промоторной области, кодирующего белок С, гена PROC, расположенного на хромосоме 2ql3-ql4, обнаружено несколько полиморфных маркеров: С(-1654)Т, A(-1641)G и А(-147б)Т [217]. В нашем исследовании использовался полиморфный маркер С(—1654)Т,
Аллели данного полиморфного маркера можно идентифицировать с помощью ПЦР с последующим расщеплением продукта амплификации рестриктазои BstF5I. Размер продукта амплификации 147 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Т, расщепляется рестриктазои BstF5I, образуя продукты размером 123 и 24 п.н.; в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель С, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 147 п.н. после обработки рестриктазои BstF5I соответствовало генотипу СС, двух фрагментов (123 и 24 п.н.) - генотипу ТТ, и трех (147, 123 и 24 п.н.) - гетерозиготному генотипу СТ.
В клинических исследованиях показана возможная связь дефицита белка С с артериальными тромбозами. В научной литературе описаны случаи возникновения инфаркта миокарда у больных с дефицитом белка С [219]. Полиморфные маркеры гена PROC приводящие к дефициту этого белка возможно могут влиять на заболеваемость и смертность вследствие ИБС, в связи с чем их изучение представляется перспективным.
Одним из таких маркеров, влияющих на концентрацию белка С в плазме является полиморфной маркер С(-1654)Т гена PROC. Этот полиморфный маркер ассоциирован с уровнем экспрессии гена протеина С и, таким образом, может быть связан с количеством продукта этого гена [217]. По некоторым данным, аллель С полиморфного маркера С(-1654)Т гена PROC недостоверно ассоциировался со сниженной концентрацией белка С в крови [241] и риском развития венозного тромбоза. Изучение ассоциации этого полиморфного маркера с риском развития артериальных тромбозов, заболеваемостью и смертностью пациентов вследствии ИБС ранее не проводилось. В нашей работе были определены частоты развития неблагоприятных исходов в группе больных, перенесших обострение ИБС, в зависимости от генотипов полиморфного маркера С(-1654)Т гена PROC (Табл. 13 и 14). Срок дожития до конечной точки у носителей генотипов ТТ и СТ составил 2,3 + 0,09 года против 2,7 + 0,09 у носителей генотипа СС. Таким образом, у больных нашей группы аллель Т полиморфного маркера С(-1654)Т гена PROC ассоциировался с худшим течением и более коротким сроком дожития до конечной точки.
