Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Полиморфные маркеры 8
1.1.1. Типы полиморфизмов и методы их исследования 8
1.1.2. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний 15
1.2. Сахарный диабет типа 1: общая характеристика заболевания 21
1.2.1. Основные аспекты этиологии и патогенеза СД типа 1 21
1.2.2. Генетические факторы риска развития СД типа 1 23
1.3. Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров 46
1.3.1. Тирозиновая фосфатаза Т-лимфоцитов типа 22 (PTPN22) 46
1.3.2. Тирозиновая фосфатаза Т-лимфоцитов типа 2 (PTPN2) 47
1.3.3. Рецептор эпидермальных факторов роста типа 3 (ERBB3) 49
1.3.4. Тирозиновая фосфатаза Т-лимфоцитов типа 11 {PTPN11) 50
1.3.5. Адаптерный белок Lnk (SH2B3) 51
1.3.6. Представитель семейства лектинов типа С (CLEC16A) 52
1.3.7. Альфа-цепь рецептора интерлейкина 2 (IL2RA) 54
1.3.8. Инсулин (INS) 56
2. Материалы и методы 58
2.1. Реактивы и ферменты 58
2.2. Буферные растворы 58
2.3. Формирование групп больных и здоровых индивидов 59
2.4. Выделение геномной ДНК человека методом фенол-хлороформной экстракции 59
2.5. Амплификация ДНК 60
2.6. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами 63
2.7. Детекция флуоресценции «по конечной точке» (TaqMan) 63
2.8. Электрофоретическое разделение ДНК 63
2.9. Анализ блоков неравновесия по сцеплению и выбор полиморфных маркеров 65
2.10. Статистическая обработка результатов 65
2.10.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов 65
2.10.2. Оценка относительного риска. Odds ratio 66
3. Результаты и их обсуждение 67
3.1. Общая характеристика исследованных групп 67
3.2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с СД типа 1 68
3.2.1. Исследование ассоциации полиморфного маркера -2ЗНрЫ(rs689) гена INS с СД типа 1 68
3.2.2. Исследование ассоциации полиморфного маркера С1858Т (rs2476601) гена PTPN22 с СД типа 1 72
3.2.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs2542151, rs2847281, rs3737361, rs547268 и rs2542156 генаPTPN2 с СД типа 1 73
3.2.4. Исследование ассоциации полиморфных маркеров rsl7696736, rsl2425405, rsl 1066284, rs7974468 и rsl 1066301 rmaPTPNll с СД типа 1 78
3.2.5. Исследование ассоциации полиморфного маркера rs2292239 гена ERBB3 с СДтипа 1 83
3.2.6. Исследование ассоциации полиморфного маркера Trp262Arg (rs3184504) rmaSH2B3 с СД типа 1 84
3.2.7. Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs2903692 и rs725613 гена CLEC16A с СД типа 1 87
3.2.8. Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs41295061 и rsl 1594656 гена IL2RA с СД типа 1 90
Заключение 92
Выводы 94
Список литературы 96
- Генетические факторы риска развития СД типа 1
- Исследование ассоциации полиморфного маркера -2ЗНрЫ(rs689) гена INS с СД типа 1
- Исследование ассоциации полиморфного маркера Trp262Arg (rs3184504) rmaSH2B3 с СД типа 1
- Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs2903692 и rs725613 гена CLEC16A с СД типа 1
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сахарный диабет типа 1 (СД типа 1) - широко распространенное, тяжело протекающее заболевание, приводящее к ранней инвалидности и преждевременной смерти больных. СД типа 1 относится к одному из наиболее серьезных эндокринных заболеваний человека. В Российской Федерации насчитывается более 5 млн. больных с этой формой диабета. СД типа 1 является наследственным аутоиммунным заболеванием и представляет собой не только медицинскую, но и серьезную социальную проблему. В целом средняя продолжительность жизни больных СД типа 1, заболевших в детстве, на 20 лет меньше, чем средняя продолжительность жизни в общей популяции.
В настоящее время СД типа 1 относят к многофакторным, полигенным заболеваниям. Многофакторная модель наследования предполагает, что проявление болезни определяется взаимодействием средовых и генетических факторов. Под генетическими факторами при этом подразумевают определенные аллели ряда полиморфных генов, вовлеченных в развитие СД типа 1, которые в клинической практике получили название аллелей, предрасполагающих к развитию СД типа 1. До настоящего времени в русской популяции с использованием подхода «ген-кандидат» удалось надежно идентифицировать только две хромосомные области, содержащие гены, связанные с предрасположенностью к развитию СД типа 1. Это локус МНС (главный комплекс гистосовместимости) и ген CTLA4, кодирующий поверхностный рецептор Т-клеток.
В последние годы обнаружена ассоциация с СД типа 1 ряда новых локусов, в том числе и на основе полных геномных поисков с использованием микрочипов высокой плотности. Однако эти данные относятся, главным образом, к больным СД типа 1, происходящим из Великобритании. Необходимость проведения аналогичных исследований на русской популяции не вызывает сомнений, так как известно, что вклад различных генов в формирование предрасположенности к СД типа 1 существенно различается в разных популяциях, а вычисление генетического риска для пациента требует наличия информации о распределении частот аллелей и генотипов для популяции, к которой он принадлежит, что исключает использование данных, полученных для других популяций.
Установление ассоциации полиморфных маркеров с СД типа 1 у больных русского происхождения поможет разработать дифференцированный подход к профилактике и лечению данной патологии.
Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с развитием сахарного диабета типа 1. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов, кодирующих ти-розиновые фосфатазы типа 2, 11 и 22 (PTPN2, PTPN11, PTPN22), тирозиновую киназу, являющуюся рецептором эпидермальных факторов роста типа 3 (ERBB3), представителя семейства лектинов типа С (CLEC16A), адаптерный белок Lnk (SH2B3), проинсулин (INS) и альфа-цепь рецептора интерлейкина 2 (IL2RA) в группе больных СД типа 1 и группе здоровых индивидов среди русских г. Москвы.
Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров данных генов-кандидатов в исследованных выборках больных и здоровых индивидов для выявления ассоциации изученных маркеров с развитием болезни и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к СД типа 1.
Научная новизна работы. В данной работе впервые в России исследована ассоциация полиморфных маркеров -23HphI (rs689) гена INS, Trp262Arg (rs3184504) гена SH2B3, С1858Т (rs2476601) гена PTPN22, rs2847281, rs2542151, rs3737361, rs547268 и rs2542156 гена PTPN2, rs2903692 и rs725613 гена CLEC16A, rs2292239 теплЕКВВЗ, rsl7696736, rsl2425405, rsll066284, rs7974468 и rsl 1066301 гена/T/Wll, rs41295061 и rsl 1594656 тепл1Ь2КА с СД типа 1. Обнаружена ассоциация полиморфных маркеров генов INS, SH2B3, PTPN22, PTPN11, PTPN2 и CLEC16A с развитием СД типа 1. Все вышеизложенные результаты получены впервые.
Практическая ценность работы. Показано, что исследованные полиморфные маркеры генов INS, SH2B3, PTPN22, PTPN11, PTPN2 и CLEC16A могут использоваться для количественной оценки генетического риска возникновения сахарного диабета типа 1 в популяции русских. Несомненно, что понимание механизма патогенетического развития СД типа 1 со временем позволит создать новые лекарственные средства, предохраняющие от развития этого заболевания у генетически предрасположенных индивидов.
Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» 2 апреля 2010 г. Результаты настоящей работы докладывались на V-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, г. Москва (21 - 27 июня, 2009 г.) и на 45-ом ежегодном Конгрессе Европейской ассоциации по изучению диабета, г. Вена, Австрия (20 сентября - 2 октября 2009 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 статьи.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 121
странице машинописного текста и содержат 29 таблиц и 9 рисунков. В работе процитировано 226 зарубежных и 5 отечественных литературных источников.
Генетические факторы риска развития СД типа 1
Сахарный диабет типа 1 является многофакторным заболеванием, вызываемым аутоиммунным разрушением Р-клеток, которое приводит к недостаточной выработке инсулина [34]. В развитии СД типа 1 принимают участие множество генетических факторов и факторов окружающей среды [35]. Исследования аутопсийного материала ткани поджелудочной железы показали, что разрушение Р-клеток вызывается лимфоцитарной инфильтрацией островков Лангерганса дендритными клетками (DC), макрофагами и Т-лимфоцитами (CD4+ и CD8+). При этом не затрагиваются а-клетки (секрети-рующие глюкагон) и 8-клетки (секретирующие соматостатин) [36]. Свидетельством аутоиммунного процесса являются выявляемые в сыворотке крови антитела, специфичные для антигенов СД типа 1 [37], самые важные из которых представлены инсулином, GAD65 (декарбоксилаза глутаминовой кислоты) и ІА2 (внутриклеточная тирозинфосфатаза). Оба типа Т-лимфоцитов вовлечены в патогенез СД типа 1, при этом Т-хелперы (CD4+) распознают внеклеточные антигены и стимулируют воспаление посредством высвобождения цитокинов, а цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+) реагируют на эндогенные антигены (например, вирусные) и уничтожают клетки-мишени.
К тому времени, как симптомы заболевания приводят к клиническому диагнозу, значительная часть Р-клеток уже оказывается уничтоженной, таким образом, прогноз вероятности заболевания и предупреждение возникновения СД типа 1 являются ключевыми задачами и понимание генетических основ патологии приблизит их решение.
Большое количество информации уже получено из эпидемиологических и функциональных исследований человека и двух моделей спонтанного диабета у грызунов - мышей линии NOD (non-obese diabetic - диабет без ожирения) и крыс линии BBDP (BioBreed diabetes-prone - предрасположенные к диабету) [38, 39]. В обеих моделях развивается нехватка инсулина в результате разрушения Р-клеток с помощью Т-лимфоцитов, при этом у мышей линии NOD, в отличие от крыс линии BBDP и человека, превалирует заболеваемость самок. Все модели зависят от ряда аллелей генов главного комплекса гистосовместимости (МНС), наличие которых являются важным, но недостаточным условием развития диабета. Также требуется нарушение регуляции иммунной системы, что в случае мышей линии NOD включает в себя множество различных локусов, определяющих устойчивость Т-лимфоцитов к апаптозу и дефекты созревания макрофагов и NK-лимфоцитов [40]. Крысы линии BBDP, напротив, имеют, вероятно, моногенный фенотип лимфопении [39], вызываемый сдвигом рамки считывания в гене IAN5 [41], механизм которого еще предстоит изучить. Исключая МНС, генетические локусы предрасположенности почти не пересекаются между моделями, но при этом возможно существенное совпадение продуктов генов в метаболических путях с поправкой на различия между линиями грызунов и человеком.
Генетика.
Более 30 лет назад были получены первые свидетельства вовлеченности хромосомной области 6р21, содержащей гены главного комплекса гистосовместимости (HLA) в развитие СД типа 1 [42]. К началу эпохи полногеномных поисков было установлено и подтверждено как минимум четыре локуса предрасположенности: регион генов HLA (6р21) [42-46], локус, содержащий ген проинсулина INS (11р15) [47-51], локус, содержащий ген CTLA4 (2q31-q33) [52-54], и ген PTPN22 (1р13) [55-58]. Локусы HLA и INS объясняют 60-70% генетического риска развития СД типа 1, но в некоторых популяциях их вклад составляет менее 50%, поэтому предпринимался ряд попыток установить другие локусы, которые могут содержать гены, определяющие развитие СД типа 1.
Было найдено более 20 регионов [59, 60, 68, 76-78], большинству из которых присвоено название IDDM (Insulin-Dependent Diabetes Mellitus) и порядковый номер (таблица 3), но ни один из найденных локусов не показал столь же сильного влияния на развитие СД типа 1, как IDDM1 (HLA) и IDDM2 (INS), более того, дополнительные сложности возникли и при попытках воспроизведения исследований ряда локусов на других популяциях. Подобные неудачи могут объясняться ложноположительными результатами или, что более вероятно, различными комбинациями вкладов предрасполагающих локусов в структуру генетического риска развития СД типа 1 в различных популяциях [76, 79].
Недавние работы по точному картированию локусов предрасположенности с помощью подходов tag-SNP и полногеномных поисков на микрочипах высокой плотности выявили гены с относительно слабым эффектом на развитие заболевания, что не позволяло обнаружить эти локусы в более ранних исследованиях по сцеплению. Таблица 4 суммирует современные данные по наиболее важным и подтвержденным в независимых исследованиях локу-сам предрасположенности к СД типа 1, а рис. 2 дает представление об участии продуктов генов-кандидатов в механизме формирования центральной и периферической толерантности к аутоантигенам.
Главный комплекс гистосовместимости класса II (HLA)
Регион HLA на хромосоме 6р21 представляет собой кластер генов, кодирующих мембранные белки, делящиеся на классы І (А, В и С) и II (DP, DQ и DR), называемые белками главного комплекса гистосовместимости (МНС). Белки МНС высокополиморфны и играют важнейшую роль в иммунной системе. Одноцепочечные молекулы класса I широко экспрессируются во всех типах клеток и представляют внутриклеточне антигены С08+-лимфоцитам. Молекулы класса П экспрессируются главным образом в антиген-представляющих клетках (макрофаги, В-лимфоциты и эпителий тимуса), состоят из двух цепей А и В и отвечают за представление внеклеточных антигенов лимфоцитам CD4+.
Обнаружено, что гены класса II вносят большой вклад в предрасположенность к СД типа 1. Два гаплотипа DR4-DQ8 и DR3-DQ2 присутствуют у 90% пациентов с диагнозом СД типа 1. DR15-DQ6, напротив, встречается менее чем у 1% больных СД типа 1, при том, что его частота в общей популяции составляет 20%, таким образом, этот гаплотип является защитным [34, 46]. Известно, что гаплотипы DR-DQ не полностью объясняют сцепление региона HLA с СД типа 1, но из-за неравновесия по сцеплению до недавних пор было сложно определить более слабый вклад других генов этого региона. Исследование большой группы пациентов с помощью регрессионного анализа позволило обнаружить влияние генов HLA-A и HLA-B на развитие заболевания [85].
Роль HLA-DR и HLA-DQ в патогенезе СД типа 1 была продемонстрирована на трансгенных мышах [80, 81]. Экспрессия человеческого DR3 и/или DQ8 в не предрасположенных к диабету линиях мышей вызывала потерю иммунологической толерантности к декарбоксилазе глутаминовой кислоты (GAD), потенциальному аутоантигену р-клеток [80, 81]. У мышей, экспрес-сирующих обе молекулы, также развивался инсулит (воспаление островков Лангерганса), хотя и не переходивший в диабет [81]. Однако, в мышах, экс-прессирующих DR3-DQ8 наряду с DQ6.2, реактивности к GAD обнаружено не было [80], что подтверждает наблюдение о доминирующей защитной роли DQ6.2. Человеческие DR4 и DQ8 также могут вызывать спонтанный аутоиммунный диабет у мышей, экспрессирующих молекулу В7.1 на поверхности своих Р-клеток. Связывание В7.1 с рецептором CD28 ведет к активации Т-лимфоцитов, которые теряют толерантность к аутоантигенам панкреатических клеток [82].
Хотя эти исследования и подтверждают непосредственное участие молекул DR и DQ в патогенезе заболевания, они не могут объяснить механизм влияния на риск развития патологии. Общепринятая гипотеза предполагает, что предрасполагающие аллели связывают аутоантигенные эпитопы с меньшей эффективностью и это приводит к недостаточному развитию толерантности как в тимусе, так и на периферии.
Понимание этих взаимодействий и идентификация вовлеченных в процесс эпитопов может привести к разработке различных стратегий стимулирования развития толерантности с помощью экзогенных пептидов высоких концентраций для компенсации сниженной аффинности молекул HLA к аутоантигенам.
Исследование ассоциации полиморфного маркера -2ЗНрЫ(rs689) гена INS с СД типа 1
Этот полиморфный маркер находятся в интроне 1 гена INS в 6 п.н. от Зл-сайта сплайсинга первого интрона (рис. 6).
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера -23НрЫ гена INS выявил статистически значимые различия в группе больных сахарным диабетом типа 1 и группе здоровых индивидов. Достоверное увеличение частоты аллеля A (OR = 2,03, р -4,0x10"5) в группе больных СД типа 1 говорит об ассоциации аллеля А с повышенным риском развития данной патологии и повышенном риске развития СД типа 1 у носителей генотипа АА (OR = 2,04, р = 4,0x10"5) (таблица 11). В то же время была установлена ассоциация аллеля Т с пониженным риском развития СД типа 1 (OR = 0,49, р = 4,0x10"5), что свидетельствует о корреляции носительства генотипа ТТ (OR = 0,25, р = 3,7х10"4) со сниженным риском развития этого заболевания. Таким образом, можно сделать вывод, что полиморфный маркер -23HphI гена INS у русских ассоциирован с СД типа 1.
Полиморфный маркер -23НрЫ расположен в полипиримидиновом тракте, служащим сигналом для сплайсинга У -конца интрона 1, который разделяет кодирующий и некодирующий экзоны. Замена А на Т может влиять на эффективность сплайсинга и приводить к появлению транскрип-тов с длинным 5,-нетранаслируемым участком, что, в свою очередь, скажется на эффективности трансляции мРНК [207]. Различия в длинах транс-криптов гена INS уже обнаруживали ранее, но авторы не обсуждали данные наблюдения [208]. В 2006 г. была предпринята попытка выяснить влияние полиморфного маркера -23НрМ на транскрипцию гена INS [209]. Обнаружено 6 различных изоформ мРНК, три из которых подвергались правильному сплайсингу интрона 2, а три были лишены 5"-конца экзона 3 (кодирует С-пептид и А-цепь инсулина), что подтвердило более ранние наблюдения [210]. Вариант с заменой Г содержал значительно меньше нефункциональных изоформ с отсутствующим экзоном 2 и оставшимся нитроном 1, чем вариант с А, что говорит о более эффективном сплайсинге пре-мРНК, содержащей аллель Т полиморфного маркера -23HphI. Эксперименты с клеточными линиями (клетки 293Т и линии, полученные из (3-клеток) показали, что пре-мРНК с аллелем Т дает большее относительное содержание полнофункционального транскрипта проинсулина и более низкий уровень экспрессии, в то время как аллель А приводит к повышению экспрессии и к большему разнообразию изоформ.
Недавно было обнаружено, что клонированные Т-лимфоциты, взятые у пациентов с СД типа 1 и с предрасполагающим HLA-гаплотипом DR4, специфически узнают эпитоп А1-15 проинсулина [211-213]. Эти 15 аминокислот А-пептида кодируются 5 -концом экзона 3, который отсутствует в ряде изоформ, что влияет на развитие аутоиммунной толерантности (рис. 6). Несмотря на подтверждение эффекта альтернативного сплайсинга [214], необходимы дальнейшие эксперименты для выяснения тканеспецифичных профилей экспрессии у человека, так как повышенная экспрессия большого количества изоформ проинсулина в Р-клетках (ассоциирована с аллелем А) может стимулировать аутоиммунный ответ, а различные уровни экспрессии в поджелудочной железе и тимусе могут объяснить влияние генетических факторов на развитие СД типа 1 [215].
Возможно, предрасполагающая роль аллеля А и сцепленного с ним VNTR-повтора класса I объясняется пониженной экспрессии изоформ проинсулина в тимусе (но не в Р-клетках) и снижением эффективности центральной толерантности против всех возможных эпитопов инсулина, представляемых р-клетками. На участие именно антигенных детерминант инсулина в развитии СД типа 1 указывает тот факт, что ассоциации полиморфных маркеров гена INS с СД типа 2 обнаружено не было и, вероятно, различия в уровнях экспрессии проинсулина носителями различных генотипов VNTR-повтора и полиморфного маркера —23НрЫ гена INS регулируются компенсаторными механизмами и не влияют на возникновение СД типа 1 [216].
Исследование ассоциации полиморфного маркера Trp262Arg (rs3184504) rmaSH2B3 с СД типа 1
Однонуклеотидному полиморфизму Т/С (rs3184504) в экзоне 3 гена SH2B3 соответствует аминокислотный полиморфизм Trp262Arg (рис. 8).
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs3184504 гена SH2B3 выявил статистически значимые различия в группах больных сахарным диабетом типа 1 и здоровых индивидов. Достоверное увеличение частоты аллеля Т (OR = 1,94, р = 6,4x10"6) и генотипа ТТ (OR = 2,76, р = 3,0x10"6) в группе больных СД типа 1 говорит об ассоциации аллеля Т с повышенным риском развития данной патологии и повышенном риске развития СД типа 1 у носителей генотипа ТТ (таблица 24). В то же время установлена ассоциация аллеля С с пониженным риском развития СД типа 1 (OR = 0,52, р = 6,4x10"6), что свидетельствует о корреляции носительства генотипа СС (OR = 0,49, р = 3,0x10"5) со сниженным риском развития этого заболевания. Таким образом, можно сделать вывод, что полиморфный маркер rs3184504 (Trp262Arg) гена SH2B3 у русских ассоциирован с СД типа 1.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs3184504 гена SH2B3 в группах "СД1+" и "СД1-".
Ген SH2B3 находится в хромосомной области 12q24.12 в блоке неравновесия по сцеплению кластера генов SH2B3-ATXN2RAFD1-PTPN11. В ряде исследований обнаружена ассоциация этого гена как с СД типа 1, так и с заболеваниями, в основе которых лежат воспалительные или аутоиммунные процессы - атеросклероз, болезнь Крона и т.п. [165-168]. По-видимому, этиологическим маркером является именно аминокислотный полиморфизм Trp262Arg (rs3184504) гена SH2B3, который в случае СД типа 1 для популяции русских показывает степень ассоциации, сравнимую с полиморфным маркером С1858Т гена PTPN22, при этом вклад локуса SH2B3 при использовании мультипликативной (аллельной) модели риска можно оценить приблизительно в 2-3%. Следует отметить, что исследования ассоциации этого полиморфного маркера с СД типа 1 на европейских выборках показали среднюю степень его влияния на развитие патологии (OR для предрасполагающего аллеля равно 1,25-1,33), что может объясняться или гетерогенностью европейских выборок, или, что более вероятно, неодинаковым вкладом в патогенез заболевания разных генов в различных популяциях.
Аминокислотный полиморфизм Trp262Arg гена SH2B3 расположен внутри домена РН, который служит для прикрепления белка LNK к фосфо-липидам мембран [169]. По всей видимости, функциональная значимость аллеля повышенного риска Тгр262 связана с тем, что изофермент с остатком триптофана в положении 262 менее эффективно связывается с мембраной и, как следствие этого, передает сигнал от тирозиновых киназ внутрь Т-клеток менее эффективно. Вполне логично предположить, что пониженная эффективность передачи сигнала может приводить к тому, что часть аутореактивных Т-клеток, которые должны были бы быть удалены при негативной селекции в тимусе, выживает у носителей генотипов Тгр/Тгр и Arg/TrprensiSH2B3.
Несмотря на определенные успехи в поиске этиологического варианта для СД типа 1 в хромосомной области 12q24.12, представляется интересным исследовать другие гены кластера SH2B3-ATXN2RAFD1-PTPN11, так как блок неравновесия по сцеплению в этой области относительно велик (более 1.5 млн.п.н.) и, возможно, в одном из этих генов существуют другие функционально важные варианты, обладающие меньшим вкладом в развитие СД типа 1, чем маркер Trp262Arg гена SH2B3, и потому не выявляемые при полных геномных поисках, а также при использовании аналогичных методов, накладывающих строгие ограничения на включение определенных полиморфных маркеров в исследование [99].
Стрелками отмечены стадии, протекание которых регулируется продуктами соответствующих генов.
Известно, что передача сигнала внутрь клетки регулируется по принципу обратной связи и равновесие достигается за счет участия ферментов, относящихся к семейству тирозиновых фосфатаз, которые дефосфорили-руют соответствующие фосфорилированные белковые факторы (рис. 9). Ассоциация с СД типа 1 установлена для двух генов PTPN22 и PTPN2, относящихся к этому семейству и кодирующих тирозиновые фосфатазы лим-фоидных клеток [138], и подтверждена нашим исследованием для русской популяции. Выбранный нами ген PTPN11, являющийся наиболее вероятным геном-кандидатом, продукт которого может вносить вклад в развитие СД типа 1, показал наличие независимой ассоциации с заболеванием, но это не исключает существования этиологических вариантов как в других гена кластера SH2B3-ATXN2RAFD1-PTPN11, так и в представителях всего семейства внутриклеточных тирозиновых фосфатаз (PTPN6 и др.)
Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs2903692 и rs725613 гена CLEC16A с СД типа 1
В настоящем исследовании мы изучили ассоциацию полиморфных маркеров rs2903692 и rs725613, которые находятся в частичном неравновесии по сцеплению с полиморфными маркерами, показавшими ассоциацию в других исследованиях.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2903692 гена CLEC16A в группах "СД1+" и "СД1-".
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2903692 гена CLEC16A выявил статистически значимые различия в группе больных сахарным диабетом типа 1 и группе здоровых индивидов. Достоверное увеличение частоты аллеля G (OR = 1,41; р = 0,025) в группе больных СД типа 1 говорит об ассоциации аллеля G с повышенным риском развития данной патологии и повышенном риске развития СД типа 1 у носителей генотипа GG (таблица 25). В то же время была установлена ассоциация аллеля А с пониженным риском развития СД типа 1 (OR = 0,71, р = 0,025), что свидетельствует о корреляции носитель-ства генотипа АА (OR = 0,45, р = 0,040) со сниженным риском развития этого заболевания.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs725613 гена CLEC16A не выявил статистически значимых различий в группе больных сахарным диабетом типа 1 и группе здоровых индивидов (таблица 26). Таким образом, можно сделать вывод, что полиморфный маркер rs2903692, но не маркер rs725613, гена CLEC16A у русских ассоциирован с СД типа 1.
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs725613 гена CLEC16A в группах "СД1+" и "СД1-".
Ген CLEC16A экспрессируется главным образом в клетках иммунной системы, что позволяет предположить его участие в патогенезе СД типа 1. Было показано, что уровень экспрессии CLEC16A зависит от генотипа полиморфного маркера rs2903692, причем носители защитного генотипа АА имеют более высокий уровень экспрессии, чем носители генотипов AG и GG, но о механизмах различий пока ничего не известно [100].
Таким образом, требуются изучение функциональной роли продукта гена CLEC16A и поиск этиологических маркеров заболевания в этой хромосомной области.
