Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Полиморфные маркеры 8
1.1.1. Типы полиморфизмов и методы их исследования 8
1.1.2. Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний 18
1.2. Ишемическая болезнь сердца и острый коронарный синдром 20
1.2.1. Основные аспекты этиологии и патогенеза ишемической болезни сердца... 20
1.2.2. Генетические факторы риска развития ишемической болезни сердца 21
1.2.3. Острый коронарный синдром 22
1.3. Система гемостаза 27
1.3.1. Система свертывания крови 28
1.3.1.1. Факторы системы свертывания 29
1.3.1.2. Коагуляционный каскад...,t 39
1.3.1.3. Факторы, противодействующие тромбоооразованию. Антикоагулянтная система крови 41
1.3.2. Система фибринолиза 51
1.3.2.1. Плазминоген 51
1.3.2.2. Активаторы плазминогена 53
1.3.2.3. Пути активации фибринолиза 55
1.3.2.4. Ингибиторы фибринолиза 56
1.3.3. Каскадно-матричная теория свертывания крови 58
1.4. Характеристика исследованных в работе генов и полиморфных маркеров 64
1.4.1. Фактор свертывания крови V. Ген F5. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС 64
1.4.2. Фактор свертывания крови VII. Ген F7. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС 67
1.4.3. Тромбомодулин. Ген THBD. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС 69
1.4.4. Белок С. Ген PROC. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС... 72
1.4.5. Ингибитор активатора плазминогена типа 1. Ген PLANH1. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС 74
2. Материалы и методы 77
2.1. Объект исследования. Критерии включения пациентов в исследование 77
2.2. Реактивы и ферменты 81
2.3. Выделение геномной ДНК 82
2.4. Амплификация ДНК 82
2.5. Статистическая обработка результатов 84
3. Результаты и обсуждение 84
3.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров с ОКС 84
3.1.1. Исследование ассоциации полиморфного маркера Arg506Gln гена F'5 с ОКС 84
3.1.2. Исследование ассоциации полиморфного маркера G5393A гена с ОКС 87
3.1.3. Исследование ассоциации полиморфного маркера Arg353Gln гена F7 с ОКС 89
3.1.4. Исследование ассоциации полиморфного маркера АIa455 Val гена THBD с ОКС 92
3.1.5. Исследование сочетанной ассоциации полиморфного маркера А1а455 Val гена THBD и полиморфного маркера Arg353Gln гена F7 с ОКС 95
3.1.6. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(-2б7б)Т гена PROC с ОКС 97
3.1.7. Исследование ассоциации полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PLANHlcOKC 99
4. Выводы 103
Список литературы 104
- Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний
- Факторы, противодействующие тромбоооразованию. Антикоагулянтная система крови
- Тромбомодулин. Ген THBD. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС
- Исследование ассоциации полиморфного маркера АIa455 Val гена THBD с ОКС
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) — полигенное, многофакторное заболевание, являющееся наиболее частой причиной смерти среди мужчин старше 45 лет и женщин старше 65 лет во многих странах Европы, в том числе и в России. Больной, перенесший обострение ИБС, попадает в группу высокого риска повторения эпизода обострения. Предотвращение этих заболеваний представляет одну из основных задач, как практической медицины, так и медицинской науки (Оганов и соавт., 2008).
Известно, что сердечно-сосудистые патологии – многофакторные заболевания с многочисленными звеньями патогенеза. Для таких заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. При этом для каждого конкретного заболевания можно выделить группу, так называемых, генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии (Goldbourt et al., 1994).
Генетическую предрасположенность к тому или иному заболеванию чаще всего изучают по принципу “случай-контроль”. Однако для многих исследований этого типа достаточно сложно бывает подобрать правильную контрольную группу, поскольку, во-первых, невозможно бывает выявить доклинические формы проявления заболевания, а во-вторых, учитывать всех умерших к моменту начала обследования. Этих недостатков лишены так называемые проспективные исследования, в которых осуществляется длительное наблюдение за большими группами лиц, входящих в группу риска, с регистрацией «конечных точек» исхода заболевания.
Поскольку нарушения функции системы гемостаза, приводящие к тромбообразованию, являются важным звеном в формировании патогенеза ишемической болезни сердца (Сидоренко и соавт., 2008), гены, кодирующие белковые компоненты этой системы, можно рассматривать как гены-кандидаты, ассоциированные с обострением ИБС, и эти гены совершенно необходимо включать в проспективные исследования.
Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного пациента. Подобные исследования позволяют точнее и надежнее оценивать генетический риск развития заболевания и прогнозировать его течение (Gibbons et al., 2004).
Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов, продукты которых являются белковыми
компонентами системы гемостаза, с неблагоприятным исходом у больных, перенесших острый коронарный синдром. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить аллели и генотипы полиморфных маркеров генов, кодирующих факторы свертывания крови V (F5) и VII (F7), белок С (PROC), тромбомодулин (THBD) и ингибитор активатора плазминогена типа 1 (PLANH1).
-
Провести сравнительный анализ времени дожития до конечных точек у больных, перенесших острый коронарный синдром, - носителей различных генотипов полиморфных маркеров выбранных генов-кандидатов для выявления вклада генетических факторов в развитие неблагоприятных исходов.
Научная новизна работы.
В данной работе впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров Arg506Gln и G5393A гена F5, Arg353Gln гена F7, С(–2676)Т гена PROC, Ala455Val гена THBD и 4G(–675)5G гена PLANH1 с развитием острого коронарного синдрома.
Обнаружена ассоциация полиморфного маркера G5393A гена F5 с повышенным риском развития неблагоприятного исхода в группе женщин, перенесших острый коронарный синдром. Установлено, что носительство генотипов GA и AA полиморфного маркера G5393A гена F5 независимо связано с наступлением таких неблагоприятных исходов как нефатальный и фатальный инфаркт миокарда (ИМ), а также нефатальный и фатальный инсульт.
Обнаружена сочетанная ассоциация комбинации генотипов полиморфного маркера Arg353Gln гена F7 и Ala455Val гена THBD с повышенным риском развития неблагоприятного исхода в группе женщин, перенесших острый коронарный синдром.
Практическая ценность работы. Выявление ассоциации полиморфных маркеров генов с развитием острого коронарного синдрома (ОКС) открывает новые перспективы в выделении групп пациентов с высоким риском развития патологии. Полученные данные об ассоциации полиморфных маркеров G5393A гена F5, Arg353Gln гена F7 и Ala455Val гена THBD с повышенным риском развития неблагоприятного исхода в группе женщин, перенесших эпизод обострения ИБС, позволяют внедрить генетическое тестирование больных ИБС для выделения лиц, имеющих максимальную предрасположенность к развитию неблагоприятных исходов, и указывают на возможное направление разработки новых лекарственных средств.
Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» 26 октября 2011 г. Материалы работы были представлены на Х-ой ежегодной
международной молодежной конференции ИБХФ РАН – ВУЗЫ «Биохимическая физика» (г. Москва, Россия, 8-10 ноября 2010 г); 79-ом съезде Европейского Атеросклеротического общества (г. Гетеборг, Швеция, 26-29 июня 2011); II-ой международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (г. Донецк, Украина, 19-22 сентября 2011 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, включая 3 статьи, а также материалы конференций.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста и содержат 8 таблиц и 15 рисунков. В работе процитированы 185 зарубежных и 23 отечественных литературных источника.
Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний
Изучение наследственной предрасположенности к многофакторным заболеваниям крайне важно для их диагностики и терапии. Для оценки роли наследственных факторов в развитии многофакторного заболевания, как правило, используют анализ сцепления, анализ ассоциации или экспериментальные модели развития заболевания на животных {Иванов, 2005).
Большую практическую ценность представляет исследование сцепления или ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов, продукты которых вовлечены в патогенез многофакторного заболевания Чаще всего такие исследования связи проводятся с использованием метода «случай-контроль» (case-control). При этом проводят анализ распределения аллелей и генотипов исследуемого генетического маркера в выборке из неродственных здоровых лиц (популяционный контроль) и в группе больных (группа «случай») с тем, чтобы выявить значимые различия в частоте генетического маркера (аллеля). Генетический маркер считается ассоциированным с болезнью, если его частота среди больных значимо выше, нежели в контрольной выборке. Наличие ассоциации либо свидетельствует о прямой связи между исследованным локусом и наследственной патологией, либо в основе ассоциации может лежать неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом, обуславливающим развитие болезни, если эти локусы расположены достаточно близко друг от друга.
Группы сравнения должны быть правильно подобраны и хорошо охарактеризованы клинически и биохимически. Необходимо, чтобы они были гомогенны по негенетическим факторам риска. Но, несмотря на это, ассоциация может оказаться мнимой за счет негомогенности популяции, малочисленности выборок и некорректности критериев отбора при формировании выборок больных и здоровых индивидов. Нежелательных эффектов, связанных с этнической неоднородностью популяции, можно избежать, проводя анализ ассоциации в гомогенных изолированных популяциях. Также для увеличения достоверности ассоциации желательно проводить исследование на достаточно большой панмиксной популяции (Сох and Bell, 1989).
Кроме того, в анализ методом «случай-контроль», как правило, не входят пациенты, ранее умершие от данного заболевания. Этих недостатков лишены так называемые проспективные исследования, в которых осуществляется длительное наблюдение за большими группами лиц, входящих в группу риска, с регистрацией «конечных точек» исхода заболевания. Проспективные исследования — самые продуктивные и доказательные. Они не исключают всех возможных ошибок, но ближе всего подводят к пониманию причинно-следственных отношений. Главная особенность таких работ — полная определенность наблюдаемой группы, выявляемых состояний, методов обследования и прочих деталей до начала исследования. Это позволяет контролировать возможные систематические ошибки (предвзятость) при анализе результатов. Принципы организации проспективных исследований детально описаны и непрерывно совершенствуются. Метод поиска ассоциации между полиморфными маркерами определенных локусов, содержащих гены-кандидаты, и клиническим проявлением заболевания - это единственно возможная стратегия генетического анализа при отсутствии семейного материала.
Именно поэтому в нашем исследовании ставится задача определения частоты развития осложнений ИБС на большой группе пациентов, перенесших острый коронарный синдром. Параллельно в этой же группе пациентов будет осуществляться определение аллелей и генотипов полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов, что позволит изучить вклад генетических факторов в развитие различных типов неблагоприятного исхода у больных с ИБС.
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) - это обусловленное расстройством коронарного кровообращения поражение миокарда, возникающее в результате нарушения равновесия между коронарным кровотоком и метаболическими потребностями сердечной мышцы. При этом заболевании нарушается соответствие между потребностями сердца в кровоснабжении и его реальными возможностями (Карпов и Дудко, 1998).
Основными факторами риска ИБС являются: артериальная гипертензия, гиперхолестеринемия, курение, сахарный диабет, воспалительные процессы гиподинамия, ожирение и генетическая предрасположенность.
Главной причиной развития ИБС является атеросклероз коронарных артерий - заболевание, при котором под эндотелием формируется атеросклеротическая бляшка, образованная ЛГШП и окружающими их гладкомышечными клетками и соединительной тканью. Такая атеросклеротическая бляшка сужает просвет сосуда. Разрыв атеросклеротической бляшки, по-видимому, способствует острому проявлению ИБС. На развитие острого тромбоза в суженном сосуде может влиять не только разрыв бляшки, но и повышенная свертываемость крови, что чаще отмечается у курильщиков, у лиц, пользующихся оральными контрацептивами, и у молодых пациентов, перенесших ИМ (Hamsten et ah, 1985).
В случае, когда тромб не полностью перекрывает просвет сосуда, развивается клиническая картина по типу НС. Когда же тромб в венечном сосуде вызывает полную его окклюзию, развивается ИМ. Если коронарная окклюзия тромботическими массами возникает в проксимальном участке, может развиться обширный инфаркт с опасными для пациента последствиями: внезапная смерть, формирование аневризмы, снижение насосной функции сердца. Вероятно, существует и другая форма коронарного тромбоза, заключающаяся в дисперсной микроэмболии при изъязвлении атеросклеротической бляшки, расположенной в венечной артерии. Эти эмболы закупоривают периферические артериолы, создавая островки ишемии миокарда.
Факторы, противодействующие тромбоооразованию. Антикоагулянтная система крови
Ингибиторы ферментов делятся на две группы: ингибиторы сериновых протеиназ н неспецифические ингибиторы протеиназ (а2-макроглобулин). К сериновым протеиназам (протеиназы, содержащие в каталитическом центре серии) относят большинство ферментов свертывающей и фибринолитической систем, ряд ферментов системы комплемента, эластаза, трипсин, химотрипсин и другие. Ингибиторы сериновых пгротеиназ (серпины) представляют собой довольно обширное семейство белков. Большинство серпинов взаимодействует с протеиназами по субстрат-подобному механизму («канонические ингибиторы»). Молекулы серпинов имеют на мембране специфическую структуру «петлю связывания», в которой располагается расщепляемая пептидная связь, образующая реактивный центр ингибитора.
Антитромбин III. Ранее вся антитромбиновая активность плазмы крови приписывалась антитромбину III (было описано шесть видов антитромбина, из них активны первые три). Сейчас установлено, что антитромбиновая активность плазмы крови определяется тремя различными белками: ингибитором С1-эстеразы, а2-макро-глобулином и а2-глобулином. Международный комитет по тромбозу и гемостазу рекомендовал использовать термин «антитромбин III» для обозначения ос2-глобулина.
Антитромбин III — гликопротеид с молекулярной массой 58 кДа, синтезируется в печени, является наиболее значимым антикоагулянтом. Он связывается в отношении 1:1 с остатками серина в активных центрах сериновых протеиназ (инактивирует тромбин, факторы ХПа. XIa, Ха, 1Ха и калликреин). Скорость данной реакции многократно увеличивается при связывании антитромбина III с гепарансульфатом гликокаликса эндотелиальных клеток или с гепарином, вырабатываемым тучными клетками. Гепарин связывается с центрами антитромбина III и действует как аллостерический регулятор. После образования комплекса сериновой протеиназы с антитромбином III гепарин высвобождается и связывается с другими молекулами антитромбина III. Образующийся комплекс тромбин— антитромбин III неактивен, в нем тромбин быстро теряет свою протеолитическую активность. Комплекс тромбин—антитромбин III быстро метаболизируется в печени. Антитромбин III наиболее активно связывается со свободными факторами свертывания. В составе протромбиназного комплекса, содержащего также кислые фосфолипиды мембран, Са2+ и фактор Va, фактор Ха лучше защищен от антикоагулянтного действия комплекса антитромбин III—гепарин {Olson et al, 2002).
Механизм антикоагулянтного действия гепарина не исчерпывается только активацией антитромбина III. Установлено, что гепарин стимулирует синтез ингибитора внешнего пути свертывания крови и ингибирует тромбоцитарный фактор 4.
Кофактор гепарина II является высокоспецифичным ингибитором тромбина. Другими субстратами кофактора гепарина II могут быть химотрипсин и катепсин Н. Ингибитор С1-эстеразы — серпин, ингибитор факторов контактной активации (ХИа, Х1а, калликреина) и плазмина. Дефицит его не сопровождается нарушениями в функционировании системы гемостаза.
Альфа2-макроглобулин — крупный гликопротеид с молекулярной массой 725 кДа, неспецифический ингибитор протеиназ. Действие а2-макроглобулина основано на принципе мышеловки — протеиназа, связавшись с а2-макроглобулином, оказывается не способна расщепить такой крупный субстрат. Захлопывание ловушки определяется объемом блокированных протеиназ. Альфа2 макроглобулин имеет большую емкость связывания, но низкую специфичность, при этом способен инактивировать большинство протеиназ систем свертывания крови и фибринолиза.
Система тромбомодулин-белок С. Компонентами этой системы являются следующие факторы: Белок С (ПрС), его кофактор белок S (TIpS), тромбомодулин, эндотелиальный рецептор ПрС, С4Ь-связывающий белок и др. (Рис.5). Белок С (ПрС) - витамин-К-зависимый белок плазмы, синтезируется в печени. Активированный ПрС является специфической сериновой протеиназой, гомологичной другим витамин-К-зависимым сериновым протеиназам (тромбин, факторы Vila, ГХа, Ха). Основная функция его в гемостазе — инактивация факторов Va и Villa. Помимо этого он ингибирует ингибитор активатора плазминогена типа 1 (PAI-1), что приводит к усилению фибринолиза (Dahlback and Villoutreix, 2005). ПрС состоит из домена у-карбоксиглутаминовой кислоты (Gla-домен), двух EGF - подобных доменов, короткого активаторного пептида и домена сериновой протеиназы (SP-домен). Молекула ПрС подвергается посттрансляционной модификации с участием витамина К — карбоксилированию остатков глутаминовой кислоты домена у-карбоксиглутаминовой кислоты, в результате чего образуется его активная форма. При активации ПрС в присутствии комплекса тромбин— тромбомодулин и эндотелнального рецептора ПрС происходит отщепление активаторного пептида от молекулы ПрС, благодаря чему домен сериновой протеиназы переходит в активную конформационную форму.
ПрС активируется на поверхности эндотелнальных клеток путем протеолиза. ПрС, связывается с эндотелиальным рецептором ПрС и комплексом тромбин— тромбомодулин. Комплекс тромбин— тромбомодулин более чем в 1000 раз увеличивает скорость активации ПрС (Van de Wouwer et ah, 2004).
Тромбомодулин. Ген THBD. Полиморфные маркеры гена и их ассоциация с ИБС
Фактор VII (проконвертин) представляет собой витамин К-зависимый гликопротеин. Фактор VII является неактивным зимогеном, активация которого происходит в результате расщепления пептидной связи между остатком Arg в положении 152 и остатком Не в положении 153. Образующиеся две полипептидные цепи связаны между собой за счет дисульфидного мостика.
Активная форма фактора VII - это сериновая протеаза с аргинин-эстеразной активностью, первый фермент в каскаде свёртывания крови по «внутреннему пути» (Bajaj et al, 1981; Зубаиров, 2000). Помимо протеолитической активации ферментов свертывания крови, фактор VII активирует клетки, повышая концентрацию ионов кальция и инициируя фосфорилирование ряда протеинкиназ (Офозу, 2002).
Была показана вовлеченность фактора VII в развитие сердечнососудистых заболеваний. Повышенный уровень фактора VII в плазме приводит к возрастанию риска развития атеротромбозов (Tamaki et al, 1999; Smith et al, 2005). Известно, что тромбоз лежит в основе наиболее острых проявлений атеросклероза коронарных артерий, в том числе, инфаркта миокарда (Арутюнов, 2004; Сидоренко и соавт., 2008). Разрыв бляшки, и, как следствие, контакт тканевого фактора с кровью и его связывание с циркулирующим фактором свертывания VII считается главной причиной тромбоза при инфаркте миокарда (Crawley et al, 2000).
Дефицит фактора VII, вызванный снижением продукции или активности этого белка, обычно сопровождается склонностью к повышенной кровоточивости. Однако, даже значительное снижение уровня фактора VII в крови не фатально, что было показано в экспериментах на мышах (Аасрум и Придз, 2002). На концентрацию фактора VII в крови влияют как генетические факторы, так и приобретённые состояния. Установлено, что возраст, индекс массы тела, а также приём оральных контрацептивов влияют как на концентрацию, так и на активность фактора VII в крови. Также уровень фактора VII несколько выше у женщин {Simpson et al, 1983). Особую роль на количество и активность фактора VII в плазме оказывает концентрация триглицеридов в крови {Drenos et al, 2009). Активация фактора VII триглицеридами может быть ещё одним объяснением наличия положительной корреляции между уровнем триглицеридов в крови и ССЗ. Предпологается, что повышенная активность фактора VII связана с его прикреплением к триглицерид-богатым частицам, что позволяет ему избежать протеолиза {Atta et al, 2008), либо с превращением в активную двуцепочечную форму при высвобождении жирных кислот в процессе гидролиза липопротеинов. Также есть работы указывающие на прямую зависимость каталитической активности фактора VII от уровня общего холестерина крови.
Согласно данным, полученным в ходе исследования NPHS (Northwick Park Heart Study), повышеный уровень фактора VII является независимым фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний {Meade et al, 1986).
Проведены обширные исследования по выяснению роли гена F7 в патогенезе ИБС. Ген F7, кодирующий фактор свертывания VII, расположен на хромосоме 13q.34. Обнаружена ассоциация нескольких полиморфных маркеров гена F7 с уровнем фактора VII в плазме крови. Из них наиболее изучен полиморфный маркер G/A в положении 10976, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Arg/Gln в положении 353 полипептидной цепи {Girelli et al, 2000). Данный полиморфный маркер расположен в области, кодирующей каталитический домен фактора VII и, по некоторым данным, аллель Gin обладает протективным действием в отношении развития ишемической болезни сердца {Iacoviello et al.,1998).
Проведенные в различных популяциях исследования возможной ассоциации данного полиморфного маркера с сердечно-сосудистыми заболеваниями носят противоречивый характер. Было обнаружено, что аллель Gin ассоциирован с уменьшением риска развития ИМ (Wu and Tsongalis, 2001). В китайской популяции при сравнении группы больных ИБС с контрольной группой ассоциация данного полиморфизма с ИБС не была обнаружена, в том числе и при разбиении групп по половому признаку. Частота встречаемости аллеля Gin была выше в группе больных ИБС по сравнению с группой больных с ИБС и ИМ (Хи et ah, 2003). Однако, при исследовании небольшой выборки пожилых пациентов с ИБС и контрольной здоровой группы, было показано, что уровень VII фактора в плазме крови достоверно различался между двумя группами. При этом он был значительно ниже у носителей аллеля Gin (Lu et ah, 2005). Среди 139 семей с ИБС в анамнезе, проживающих на территории Индии, пониженный уровень фактора VII в плазме крови положительно коррелировал с носительством аллеля Gin (Shanker et ah, 2009). Такие же данные были получены среди новорожденных детей в нескольких популяциях, проживающих в Сингапуре (Quek et ah, 2006).
В итальянской популяции была изучена ассоциация с риском развития ИМ еще одного однонуклеотидного полиморфного маркера, G/A в положении 73 в первом интроне гена F7. У носителей аллеля А наблюдался более низкий уровень фактора VII крови по сравнению с носителями аллеля G. Так же аллель А был ассоциирован с пониженным риском развития ИМ (Peyvandi et ah, 2000).
Кроме того, предполагается возможная связь с уровнем фактора VII в плазме еще нескольких полиморфных маркеров. Это полиморфизм типа вставка-отсутствие вставки в 10 п.н. в положении -323 промоторной области гена F7 и полиморфизм типа VNTR фрагмента 37 п.н. в седьмом интроне {Iacoviello et ah, 1998). Для полиморфизма типа вставка-отсутствие вставки показано, что уровень активности фактора VII в случае вставки понижается.
Исследование ассоциации полиморфного маркера АIa455 Val гена THBD с ОКС
Тромбомодулин является ключевым звеном серии реакций, регулирующих направление и скорость процессов гемостаза. Тромбомодулин в основном экспрессируется на поверхности эндотелия, мегакариоцитов, тромбоцитов и гладкомышечных клеток. Часть молекул тромбомодулина циркулирует в крови. Образовавшийся в ходе свертывания крови тромбин в присутствии ионов Са способен связываться с расположенным на мембране тромбомодулином, при этом тромбин теряет способность расщеплять фибриноген и активирует белок С {Затейщиков и соавт., 2011).
Обнаружена ассоциация нескольких полиморфных маркеров гена THBD с развитием ССЗ. Одним из них является полиморфный маркер С/Т в положении 1578 (rs 1042579), которому соответствует аминокислотный полиморфизм Ala/Val в положении 455 полипептидной цепи. Данные о роли этого полиморфного маркера в патогенезе развития ИБС, имеющиеся в настоящее время, неоднозначны. (Wu et ah, 2001; Ohlin et ah, 2004; Сидоренко и соавт., 2006). Ряд исследований, проведенных по типу случай-контроль, выявили ассоциацию аллеля Vol с ИМ, в том числе и его манифестацией в раннем возрасте, при этом генетическая составляющая вносила наибольший вклад в случае пациентов-курильщиков, а также в группе афроамериканцев. (Konstantoulas et al, 2004).
Однако функциональное значение данного полиморфизма остается не до конца ясным, поскольку он не влияет на уровень тромбомодулина в плазме крови, что было показано в исследованиях в условиях in vivo {Nakabayashi et al., 1999; Aleksi et al, 2003). Возможно, наличие остатков аланина или валина в положении 455 полипептидной цепи молекулы тромбомодулина, в домене EGF-6, непосредственно связывающем тромбин, приводит к различиям в пространственной ориентации последнего на поверхности эндотелия, что в свою очередь изменяет скорость активации белка С (Yang et al, 2003). Идентификацию аллелей данного полиморфного маркера Ala455Val гена THBD производили с помощью гибридизационно-флуоресцентного анализа TaqMan на амплификаторе в реальном времени. Состав праймеров и зондов представлен в таблице 1
Проведенный анализ выживаемости пациентов показал, что риск развития неблагоприятного исхода после перенесенного острого коронарного синдрома не зависит от генотипов полиморфного маркера Ala455Val гена THBD. Кривые выживаемости больных с различными генотипами полиморфного маркера Ala455Val гена THBD существенно не различались (Рис. 3). При разделении пациентов на группы по половому признаку, в группе женщин наблюдалась слабая тенденция к увеличению числа НИ у носителей аллеля Val (Рис. 12).
Полученные нами данные об отсутствии статистически значимой ассоциации генотипов полиморфного маркера Ala455Val гена THBD с риском развития НИ согласуются с данными, полученными в ряде европейских проспективных исследований (Auro et ah, 2007). Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что полиморфный маркер Ala455Val гена THBD не имеет индивидуального прогностического значения в оценке риска развития НИ у больных, перенесших обострение ИБС. Для проведения дальнейших исследований наиболее целесообразен комплексный подход с использованием комбинации генотипов других полиморфных маркеров гена THBD.
Важную прогностическую роль в проспективных исследованиях с использованием «конечных точек» может играть изучение совместного влияния комбинации генотипов нескольких полиморфных маркеров. Данный подход широко применяется как в современных зарубежных исследованиях {Auro et ah, 2007), так и в России. Наши последние данные, полученные в результате длительного проспективного исследования на группе больных, перенесших обострение ИБС, выявили значительную сочетанную ассоциацию комбинаций генотипов полиморфных маркеров генов, продукты которых участвуют в регуляции воспаления, с развитием НИ {Благодатских и соавт., 2010; Благодатских и соавт., 2011).
Основываясь на этих данных, в проведенном нами многоцентровом проспективном исследовании был применен комплексный подход с использованием комбинаций генотипов исследуемых полиморфных маркеров.
Исследовалось две группы женщин. В первую были включены носители генотипов Ala/Val и Val/Val полиморфного маркера Ala455Val гена THBD и генотипа Arg/Arg полиморфного маркера Arg353Gln гена F7, во вторую группу носители генотипа Ala/Ala полиморфного маркера Ala455Val гена THBD и генотипов Arg/Gln и Gln/Gln полиморфного маркера Arg353Gln гена F7 (Табл. 7).
В первой группе чаще наблюдался неблагоприятный исход (нефаиальный и фатальный инфаркт миокарда, нефатальный и фатальный инсульт) по сравнению со второй группой. Время дожития до конечной точки в первой группе составило 40.5 месяцев (95% О 33,5-47,6) против 51.6 месяцев (95% С1 45.0-58.1) во второй группе (%2 = 4.15/? = 0.042) (Рис. 13).
![Влияние аллелей полиморфных генов системы HLA II класса, фолатного обмена, гемостаза и детоксикации на репродукцию человека [Электронный ресурс]](/i/i/4357/184412.png "Влияние аллелей полиморфных генов системы HLA II класса, фолатного обмена, гемостаза и детоксикации на репродукцию человека [Электронный ресурс] Бескоровайная Татьяна Сергеевна")