Введение к работе
Актуальность проблемы. Настоящая работа посвящена изучению роли пространственной конфигурации геномного локуса в процессе переключения экспрессии глобиновых генов у кур. Домены альфа- и бета-глобиновых генов позвоночных животных уже в течение нескольких десятилетий остаются одними из самых популярных моделей в изучении механизмов регуляции транскрипции у высших эукариот. На сегодняшний день накоплен большой массив данных о том, какую роль в контроле транскрипции глобиновых генов играют разнообразные белковые факторы, некодирующие РНК, метилирование ДНК, а также ковалентные модификации гистонов в составе нук-леосом. Тем не менее механизм переключения экспрессии, состоящий в том, что на разных этапах онтогенеза транскрибируются разные гены внутри альфа- и бета-глобиновых кластеров, изучен далеко не полностью. Не вполне ясно, что именно является движущей силой этого переключения. В предыдущих работах было показано, что определенную роль в данном процессе играет изменение спектра транскрипционных факторов в эритроидных предшественниках, а также изменение профилей эпигенетических модификаций хроматина внутри доменов глобиновых генов. У ряда изученных организмов, например, у мыши взаимная сближенность в трехмерном пространстве ядра регуляторных участков ДНК и подконтрольных им глобиновых промоторов коррелирует с запуском транскрипции глобиновых генов в определенных клеточных типах и на определенных этапах онтогенеза. Мы использовали метод фиксации конформации хромосомы (Chromosome conformation capture, ЗС) для того, чтобы выяснить, как пространственная конфигурация доменов глобиновых генов кур соотносится с транскрипционным статусом генов, расположенных внутри этих доменов. Результаты работы свидетельствуют о том, что переключение экспрессии глобиновых генов коррелирует с определенными изменениями конфигурации активаторных хромати-новых блоков - крупных ДНК-белковых комплексов, включающих в себя ре-гуляторные элементы доменов и промоторы глобиновых генов, которые, согласно общепринятой концепции, обеспечивают запуск транскрипции глобиновых генов. В то же время наши данные свидетельствуют и о том, что в доменах глобиновых генов кур не существует однозначного соответствия между привлечением гена к активаторному комплексу и его транскрипцией. Это расширяет современные представления о том, как пространственная конфигурация геномного локуса соотносится с транскрипционным статусом расположенных внутри него тканеспецифичных генов. Следует отметить, что изучение процесса переключения экспрессии глобиновых генов важно не только с точки зрения фундаментальной науки. Нарушения сбалансированной экспрессии глобиновых генов, в том числе и связанные с несвоевременным переключением транскрипции разных представителей семейств альфа- и бета-глобиновых генов, приводят к возникновению гемоглобинопатии человека и хозяйственно-значимых животных.
Цель и задачи исследования. В данной работе мы изучали пространственную организацию доменов альфа- и бета-глобиновых генов кур в ряде клеточных типов с целью выяснить, изменяется ли спектр пространственных взаимодействий регуляторных элементов и промоторов внутри доменов при переключении программы экспрессии. Для ответа на этот вопрос были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Проанализировать спектр пространственных взаимодействий внутри домена альфа-глобиновых генов кур до момента переключения экспрессии (в эритроидных клетках 3-дневных куриных эмбрионов). Сравнить результаты с ранее полученными данными о конфигурации домена в эритроидных клетках 10-дневных эмбрионов, после переключения программы экспрессии.
-
Охарактеризовать спектр пространственных взаимодействий внутри домена бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках до и после переключения экспрессии.
-
Охарактеризовать спектр пространственных взаимодействий внутри домена бета-глобиновых генов кур в клетках неэритроидного происхождения. Выяснить, существуют ли в таких клетках взаимодействия удаленных элементов домена.
Для решения поставленных экспериментальных задач мы использовали метод фиксации конформации хромосомы, ранее разработанный для детектирования пространственных взаимодействий участков ДНК в хроматине (Dekker et al, 2002).
Научная новизна и практическая ценность работы. Несмотря на то, что домены глобиновых генов кур в течение нескольких десятилетий являются популярными моделями в исследованиях механизмов регуляции транскрипции у высших эукариот, пространственная организация этих геномных локусов до последнего времени оставалась совершенно не исследованной. В предыдущих работах нашей лаборатории была изучена пространственная конфигурация домена альфа-глобиновых генов кур в культуре клеток куриных преэритробластов до и после индукции к терминальной дифференциров-ке и синтезу глобинов. Кроме того, была исследована пространственная конфигурация данного района генома в эритроцитах 10-дневных эмбрионов и в клетках неэритроидного происхождения. В настоящей работе впервые была охарактеризована пространственная организация домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных клетках раннеэмбрионального типа. Сравнение пространственной организации домена альфа-глобиновых генов кур в эритроидных клетках до и после переключения программы экспрессии позволило выявить изменения в спектрах взаимодействий регуляторных элементов домена, коррелирующие с подавлением транскрипции эмбрионального альфа-глобинового гена и запуском активной транскрипции генов, кодирующих альфа-цепи гемоглобина взрослых животных. Продемонстрировано, что транскрипционно активный ген эмбрионального альфа-глобина в эритроидных клетках до переключения экспрессии не участвует в формировании ста-
бильных пространственных комплексов с удаленными регуляторными элементами домена. Эти данные важны для более полного понимания механизмов регуляции экспрессии глобиновых генов на самых ранних этапах онтогенеза.
Также в данной работе впервые были подробно картированы пространственные взаимодействия основных регуляторних элементов домена бета-глобиновых генов кур как в эритроидных клетках, так и в клетках неэритро-идного происхождения. Показано, что переключение экспрессии бета-глобиновых генов коррелирует с реконфигурацией активаторного хромати-нового блока. Продемонстрировано, что домен бета-глобиновых генов в эритроидных клетках находится в петле хроматина, образованной посредством взаимодействия пограничных инсуляторов домена. Это дает хорошее объяснение ранее сделанному наблюдению, согласно которому границы области предпочтительной чувствительности к ДНКазе І в домене бета-глобиновых генов кур совпадают с позициями инсуляторов. Показано, что, как и в случае эмбрионального альфа-глобинового гена кур, один из двух эмбриональных бета-глобиновых генов транскрибируется автономно, не участвуя в образовании комплексов с удаленными регуляторными элементами. В то же время второй ген эмбрионального бета-глобина и ген, кодирующий бета-цепь гемоглобина взрослых птиц, образуют стабильный бинарный комплекс, присутствующий также в клетках неэритроидного происхождения. Эти данные демонстрируют, что пространственные взаимодействия удаленных участков тканеспецифичных геномных доменов могут отражать некоторые общие принципы упаковки данных областей генома в составе хромосомы и не иметь прямого отношения к регуляции транскрипции.
С практической точки зрения данная работа важна для понимания базовых механизмов регуляции транскрипции глобиновых генов, что в будущем может способствовать разработке новых подходов генотерапии некоторых гемоглобинопатии.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференции "Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies" (Гиссен, Германия, 2011).
Публикации. По материалам диссертационной работы было опубликовано 8 печатных работ. Из них - 7 статей, материалов конференций - 1.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 23 рисунка и 5 таблиц, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы, включающего 189 источников.
