Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8-34
1.1. Современные направления исследований в генетике мультифакториальных заболеваний 8-15
1.2. Молекулярные основы этиологии и патогенеза хронического гломерулонефрита 16-19
1.3. Генетические исследования хронического гломерулонефрита 19-25
1.4. Интерлейкины, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение 25-34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35-49
2.1. Характеристика обследованных групп 35-37
2.2. Молекулярно-генетические методы 37-47
2.3. Генетико-статистические методы 47-49
ГЛАВА 3. Полиморфизм генов интерлеикинов и особенности формирования и прогрессирования хронического гломерулонефрита 50-97
3.1. Изучение ассоциаций полиморфных маркеров генов интерлеикинов с развитием хронического гломерулонефрита 50-55
3.2. Исследование взаимосвязей генетических полиморфизмов интерлеикинов с качественными и количественными патогенетически значимыми для хронического гломерулонефрита признаками 55-82
3.3. Изучение взаимосвязей полиморфных маркеров генов интерлеикинов со скоростью прогрессирования ХГН 83-97
Обсуждение 98-109
Выводы
Список литературы
- Молекулярные основы этиологии и патогенеза хронического гломерулонефрита
- Интерлейкины, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение
- Молекулярно-генетические методы
- Исследование взаимосвязей генетических полиморфизмов интерлеикинов с качественными и количественными патогенетически значимыми для хронического гломерулонефрита признаками
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время хронический гломерулонефрит (ХГН) представляет серьезную проблему современной медицины в связи с тяжестью болезни и широкой распространенностью в разных регионах мира [Полещук, 2006]. В нашей стране ежегодно с диагнозом хронический гломерулонефрит госпитализируется около 1-2% от всех терапевтических больных. В структуре всей почечной патологии, составляющей около 200 случаев на 100 тыс. населения, ХГН является наиболее частым заболеванием, доля которого достигает 40% [Мартынов, 2006]. Следует отметить, что заболевание поражает преимущественно лица трудоспособного возраста, что наносит значительный социальный и экономический ущерб [Кутырина, 2006]. ХГН нередко приводит к летальности в связи с достижением терминальной стадии хронической почечной недостаточности [Картамышева и др., 2006; Ермоленко, 2006; Бадаева, 2006].
Хронический гломерулонефрит является генетически детерминированным иммуновоспалительным заболеванием [Шулутко, 2006], важное значение в развитии которого, как свидетельствуют данные литературы, играют интерлейкины [Корякова, 2006; Петросян, 2006; Симбирцев, 2006]. Интерлейкины - полипотентные вещества белковой природы, обладающие множественными биологическими эффектами [Хабелова, 2007]. Являясь начальным звеном активации иммунного ответа, они определяют эффективность и тип иммунного реагирования на инфекционные и неинфекционные агенты, принимают непосредственное участие в регуляции иммунологической защиты [Кетлинский, 2008; Галова, 2008].
Гены интерлейкинов обладают значительной популяционной вариабельностью. Определенные мутации в генах, кодирующих соответствующие интерлейкины, значительно изменяют уровень их экспрессии, что может влиять на развитие хронического воспалительного процесса [Симбирцев, 2006]. Однако результаты молекулярно-генетических исследований хронического гломерулонефрита разных авторов часто различаются и не дают однозначного ответа на вопрос о патогенетической роли отдельных полиморфизмов генов интерлейкинов [Acharya, 2005; Петросян, 2006; Chen, 2008; Mtiller- Berghaus, 2008]. Кроме того, в России такие исследования затрагивают лишь ограниченный набор локусов: гены ренин-ангиотензиновой системы [Кутырина, 2006; Шарнова, 2006], интегральных мембранных белков [Шестаков, 2006], ряда интерлейкинов [Петросян, 2006], факторов некроза опухоли [Некипелова, 2007]. Данные по изучению ассоциаций генов антагониста рецептора интерлейкина 1, интерлейкина 1А, интерлейкина
1В, интерлейкина 5, интерелейкина 9 с ХГН в отечественной литературе отсутствуют, а в мировой литературе малочисленны [Kim, 2004; Buraczynska, 2006; Dashash, 2007]. Это диктует необходимость проведения дальнейших исследований в данной области.
Цель исследования: Изучить полиморфизмы генов интерлейкинов и оценить их патогенетическую значимость для хронического гломерулонефрита.
Задачи исследования:
1. Изучить распространенность полиморфизмов по шести точечным заменам (-511С/Т IL-1B, -889С/Т IL-1, С-703Т IL-5, Т113М IL-9, -592С/А IL-10, -4257G/A IL-13) и одному локусу с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR IL-IRa) генов интерлейкинов у больных хроническим гломерулонефритом и в популяционном контроле.
2. Установить роль молекулярно-генетических маркеров в формировании хронического гломерулонефрита.
3. Провести анализ ассоциаций полиморфизмов генов интерлейкинов с качественными патологическими фенотипами ХГН.
4. Оценить влияние аллельных вариантов генов интерлейкинов на изменчивость клинически значимых количественных признаков ХГН.
5. Определить взаимосвязи генетических полиморфизмов с почечной выживаемостью и скоростью прогрессирования хронического гломерулонефрита.
Научная новизна.
Впервые комплексно изучен полиморфизм генов интерлейкина 1В (- 511С/Т IL-1B), интерлейкина 1А (-889С/Т IL-1), интерлейкина 5 (С-703Т IL-5), интерлейкина 9 (Т113М IL-9), интерлейкина 10 (-592С/А IL-10), интерлейкина 13 (-4257G/A IL-13) и локусу с вариабельным числом тандемных повторов антагониста рецептора интерлейкина 1 (VNTR IL- lRa) у больных хроническим гломерулонефритом русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ. Впервые выявлены ассоциации полиморфных маркеров генов интерлейкинов с особенностями проявления хронического гломерулонефрита.
Впервые показан аддитивный характер взаимодействий генов интерлейкинов при развитии заболевания и их плейотропное действие на формирование клинически значимых качественных и количественных признаков хронического гломерулонефрита.
Впервые установлено значимое влияние генетических полиморфизмов интерлейкинов на почечную выживаемость и характер прогрессирования ХГН. Научно-практическое значение.
Результаты работы вносят вклад в расшифровку механизмов патогенеза хронического гломерулонефрита, формирование представлений о молекулярно-генетических основах заболевания.
Выделены генетические факторы риска развития неблагоприятных качественных и количественных клинически значимых признаков ХГН. Определены генетические маркеры раннего развития хронической почечной недостаточности.
Установлены неблагоприятные прогностические факторы, снижающие почечную выживаемость - аллели -889СС IL-1A, -592A IL-10,
•511 С/Т IL-1B в сочетании с паратипическими факторами.
Генотипирование больных ХГН по генам интерлейкинов позволит определять индивидуальную предрасположенность к тяжелому течению болезни, с целью разработки комплекса лечебно-профилактических мероприятий, направленных на предотвращение неблагоприятного исхода Положения, выносимые на защиту:
1. Полиморфизмы генов интерлейкинов ассоциированы с клинически значимыми качественными и количественными признаками хронического гломерулонефрита.
2. Молекулярно-генетические маркеры проявляют плейотропное действие при формировании ХГН.
3. Аллельные варианты генов интерлейкинов оказывают аддитивное влияние на патогенетически значимые признаки ХГН.
4. Скорость развития терминальной хронической почечной недостаточности на 10-16% определяется генетическим полиморфизмом VNTR IL-IRa и сочетанием С-703ТIL-5 с VNTR IL-IRa или -592С/А IL-10.
5. Полифакторность и разнонаправленность генетической и средовой детерминации почечной выживаемости.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: Годичной научной конференции сотрудников Белгородского государственного университета (Белгород, 2006, 2007, 2008), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), Международной конференции "Генетика в России и мире", посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006), Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), 71-й и 72-ой научных конференциях КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2006, 2007), 73-й итоговой межвузовской научной конференции молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 в журналах из списка ВАК.
Молекулярные основы этиологии и патогенеза хронического гломерулонефрита
Исследование генетических основ формирования, течения и лечения хронического гломерулонефрита является актуальной проблемой для современных отечественных [Петросян и др., 2006а; Шарнова и др., 2006а; Шестаков, 2006а] и зарубежных [Masutani К., 2003; Tuglular, 2003; Babel, 2006; Manchanda, 2006; Mittal, 2007, и др] ученых, вплотную занимающихся данным вопросом.
Следует отметить, что подавляющее число молекулярно-генетических работ, посвященных изучению роли генетических факторов ХГН связано с поиском ассоциаций полиморфизмов генов ренин-ангиотензиновой системы с развитием ХГН [Кутырина, 1999; Solini, 2002; Andersen, 2003; Rook, 2005]. Lee D.Y. и соавт. (1997) установили, что для больных с нефротическим синдромом в популяции Кореи, имеющих генотип DD гена ангиотензинпревращающего фермента терапия кортикостероидами малоэффективна. Эти выводы подтверждаются исследованиями Sasongko Т.Н. (2005) на индонезийской популяции.
В исследовании Penno G. (1998) выявлена связь генотипа II гена АСЕ со снижением концентрации альбумина в моче у пациентов с сахарным диабетом. В работе Solini А. и соавт. (2002) исследовалась связь инсерционно-делеционного полиморфизмом гена ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) с развитием ХГН. Авторы пришли к заключению, что наличие в генотипе аллеля D определяет высокий риск прогрессирующей потери почечной функции, особенно у пациентов с сахарным диабетом. Полученные результаты подтверждаются более поздними исследованиями Rook М. и соавт. (2005). По данным авторов у 90% больных сахарным диабетом с прогрессирующей потерей почечной функции наблюдался генотип DD гена АСЕ. Выявлена ассоциация аллеля D с более ранним возрастом начала ХГН, а также установлено, что генотип DD влечет за собой развитие почечной патологии, не сопровождающейся отечностью.
Andersen S. и соавт. (2003) выявили снижение скорости клубочковой фильтрации у пациентов с диабетом I типа, несущих в генотипе аллель D гена АСЕ. Изучению распределения полиморфизма гена АПФ и его связи с активностью АПФ у больных ХГН посвящена работа Калиева Р. Р. и соавт (2004), которые обнаружили, что у больных ХГН с DD-генотипом отмечается значительно более высокая активность АПФ. Наряду с этим такая же взаимосвязь была выявлена и у здоровых лиц. Косвенным подтверждением взаимосвязи АПФ с системным артериальным давлением при ХГН в данном исследовании послужило обнаружение более высоких цифр общего холестерина сыворотки крови у больных с DD-генотипом. Авторы предположили, что принадлежность к генотипу DD может предопределять более частые осложнения со стороны сердечно-сосудистой системы в форме атеросклеротического процесса и не исключают вовлечение в патологический процесс почек.
В работе Buraczynska М. et. al. (2005) была показана связь генетического полиморфизма ренин-ангиотензиновой системы (АСЕ, AGT, AT1R) с почечной патологией у пациентов, получавших заместительную почечную терапию по поводу терминальной стадии ХГН. В группе больных с ТХПН частоты аллеля Т гена AGT и аллеля С гена AT1R значительно превышали частоты этих аллелей в контрольной группе. Исследователями установлено, что у пациентов, несущих аллель С гена AT1R, время достижения ТХПН было значительно короче, чем у больных с гомозиготным генотипом АА (4,7 года против 12,6 лет). Наблюдаемый эффект не был связан с гипертонией. Результаты исследования демонстрируют ассоциацию полиморфного локуса AT1R А/С с развитием хронической почечной недостаточности, причем генотипы СС и АС этого гена могут служить маркером раннего достижения терминальной стадии ХПН и должны учитываться при выборе стратегии лечения заболевания.
Weekers L. и соавт. (2005) исследовали почечный кровоток в условиях нормо- и гипергликемии, вызывающей клубочковую капиллярную гипертонию, которая в свою очередь приводит к нефропатии. Результаты исследования продемонстрировали, что изменения почечной гемодинамики значительно выше у пациентов, несущих аллель D гена АСЕ. Кроме того, у больных сахарным диабетом с генотипом II гипергликемия провоцировала снижение внутриклубочкового давления.
Шарнова Ж.П. (20066) исследовала роль полиморфизма генов ангиотензин-превращающего фермента (I/D), ангиотензиногена (М235Т и Т174М) и рецептора ангиотензина II 1-го типа (А1166С) в развитии и прогрессировании нефротического синдрома у детей. В результате работы была установлена ассоциация генотипа ММ гена ангиотензиногена (полиморфизм М235Т) и генотипа АС гена рецептора ангиотензина II 1-го типа (полиморфизм А1166С) с развитием нефротического синдрома у детей. Эти генотипы являются предрасполагающими факторами развития изолированного стероидрезистентного нефротического синдрома и нефротического синдрома с гематурией. Развитие нефротического синдрома с артериальной гипертензией и гематурией у детей связано с генотипом АС гена рецептора ангиотензина II 1-го типа. Кроме того, были выявлены генотипы, ассоциированные с развитием отека при нефротическом синдроме: ММ гена ангиотензиногена (полиморфизм М235Т) и генотип АС гена рецептора ангиотензина II 1-го типа (полиморфизм А1166С). Генотип DD гена АПФ (полиморфизм I/D) предрасполагает к развитию безотечной формы нефротического синдрома.
Наряду с работами по изучению роли генов ренин-ангиотензиновой системы в формировании ХГН проведено ряд исследований, рассматривающих некоторые другие «кандидатные» гены данной патологии. Так, Yoon Н. J. и соавт. (2003) показали, что аллель С гена CD 14 -159 достоверно чаще встречался у больных IgA-нефропатией (IgAN), в сравнении с контрольной группой. Авторами был рассчитан показатель отношения шансов для группы больных с IgAN, причем гомозиготный генотип СС выступил в качестве фактора риска развития данного заболевания (OR=3,2). Таким образом, в результате исследования было установлено, что полиморфизм CD 14 -159 является важным маркером прогрессирования IgA-нефропатии.
Интерлейкины, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение
Среди интерлейкинов, как свидетельствуют данные литературы, важное значение в развитии иммуновоспалительных заболеваний имеют интерлейкины 1А, 1В, антагонист рецептора интерлейкина 1, интерлейкин 5, интерлейкин 9, интерлейкин 10, интерлейкин 13 [Bidwell, 1999; Пузырев, 2002; Фрейдин, 2002; Дубаков, 2004; Сазонов, 2005; Liu, 2005; Acharya, 2005; Петросян, 2006; Шабалдин, 20066].
Данные интерлейкины синтезируются сразу же после стимуляции инфекционными и воспалительными медиаторами, обладают множеством биологических эффектов и действуют как системно, так и локально [Тареева, 1998; Корякина, 2001]. Мутантные аллели генов интерлейкинов способны изменять уровень секреции соответствующих интерлейкинов (табл. 1) [Рапу, 1999; Hutyrova, 2002, Mathieson, 2002; Tenbrock, 2002; Ruzzo, 2005; Ulukaya, 2008; Girnita, 2008 и др.].
Семейство интерлейкіша 1 (IL-1).
Семейство IL-1 включает два агониста- IL-1A и IL-1B и их специфический антагонист IL-IRa [Титов В. Н., 2003; Имангулова, 2005; Arman, 2006]. Это семейство - член суперсемейства, в которое также входят гены, связывающих гепарин ростовых факторов (HBGF), ингибиторов трипсина (STI) и гистактофилина. Кластер генов IL-1 (430 Kb) находится на 2ql3 хромосоме и содержит гены IL-1A, IL-1B, рецептора IL-IRe и IL-IRa, строение которых достаточно консервативно [Arend et al., 2002]. Равновесие между продукцией, экспрессией и ингибицией синтеза белков этого семейства играет одну из ключевых ролей в развитии воспалительного процесса [Шаимова, 2004; Рябичева, 2007]. Установлена ассоциация носительства отдельных аллелей генов семейства IL-1 с рядом аутоиммунных, инфекционных и воспалительных заболеваний [Громова, 2005а; Rogus, 2008].
IL-1 - цитокин с широким диапазоном биологических и физиологических эффектов. Этот цитокин полифункционален и выполняет не менее 50 различных функций, мишенями которых служат клетки практически всех органов и тканей [Dinarello, 1996; Симбирцев, 1998; Кулаков, 1998]. Интерлейкин 1 участвует в формировании местной воспалительной реакции, острофазного ответа при инфекционном поражении. Индуцирует синтез ИЛ-2, ИЛ-4, осуществляет стимуляцию продукции ИЛ-6, фактора некроза опухоли. Оказывая ростостимулирующее действие на В-клетки, активирует АРС и CD4 лимфоциты. Кроме того, этот интерлейкин стимулирует миелопоэз и ранние этапы эритропоэза. Интерлейкин 1 (IL-1) - цитокин с фиброгенетическими и провоспалительными свойствами [Hutyrova, 2002; Hefler, 2002].
Ген IL-1B содержит 22 экзона, 20 из которых альтернативные (т. е. имеют структурные варианты) и 9 интронов, из которых альтернативных 8. Оба гена имеют нетранслируемые области на 3 и 5 концах. Более того, для них характерна высокая степень гомологии интронных последовательностей, что, как предполагается, играет важную регуляторную роль в экспрессии этих генов. Так, например, интрон 5 содержит последовательность, "чувствительную" к действию глюкокортикоидов, которые являются одними из самых мощных ингибиторов транскрипции IL-1. С другой стороны, в регуляторной области гена IL-1B содержится последовательность ТАТА-Ьох, характерная для многих индуцибельных белков. Однако ее нет у гена ILIA [Имангулова, 2005]. До выявления ассоциаций повышенной выработки IL-1 с определенными аллелями было известно, что некоторые люди производят более высокие уровни IL-1. Причем склонность к более высокой выработке этого цитокина, выявленная в первом исследовании, сохраняется и в более поздних измерениях, а также имеет тенденцию передаваться по наследству. Исследования последних лет показали, что за измененный характер экспрессии и продукции соответствующих белков ответственны некоторые аллельные ассоциации генов семейства IL-1 [Громова, 2005в]. Аллель гена IL-1A, несущий точечную замену в области промотора в позиции (-889), ассоциируется с повышенной продукцией этого цитокина [Trevilatto, 2003].
IL-IRa был впервые выделен из культуральной среды стимулированных моноцитов и обладал способностью ингибировать действие IL-1 на лимфоциты и фибробласты путем блокирования связывания IL-1 с клеточными рецепторами. Результаты структурного анализа молекулы IL-IRa, проведенные после клонирования гена и получения рекомбинантного белка, показали, что IL-IRa имел такую же, как и IL-1 молекулярную массу, а аминокислотная последовательность была на 26% гомологична IL-1B и на 19%-IL-1A [Имангулова, 2005]. Поэтому IL-IRa может считаться одним из белков семейства IL-1. Изменения в его строении по сравнению с молекулами IL-1A и IL-1B привели к утрате способности к проведению сигнала, но сохранили возможность высокоаффинного связывания с рецепторами. Именно это свойство и обусловливает уникальную для биологии цитокинов ситуацию -существование IL-IRa как естественного специфического ингибитора IL-1 [Громова, 20056].
Молекулярно-генетические методы
Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 8-9 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984] в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляли 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCb, ЮмМ трис-HCl (рН=7,6). Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензировали. Затем прибавляли 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубировали образец при 37С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производили отбор водной фазы. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяли в бидистиллированной, деионизованнои воде и хранили при -20С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ всех локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на амплификаторе «Терцик-МС4» производства компании "ДНК-технология" с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы "Силекс-М" и олигонуклеотидных праймеров, синтезированных фирмой «Синтол» (таблица 2).
Гепотипирование ДНК-маркеров производилось методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства ООО "Сибэнзим" (Новосибирск) (табл. 2). После инкубации рестрикционной смеси в течение 16 часов при температуре 37С проводили разделение фрагментов ДНК с помощью вертикального или горизонтального электрофореза на электрофоретических ячейках, производства фирмы «Хеликон» (Россия). В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК использовали агарозный гель 2-3% концентрации, приготовленный на основе ТВЕ-буфера, окрашенный раствором бромистого этидия (0,01%). Визуализация фореграмм осуществлялась в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).
Полиморфизм гена интерлейкина IB (-511 С/Т IL-1 В). Семейство IL-1 включает два агониста - IL-1A и IL-1B и их специфический антагонист IL-lRa. IL-1 А и IL-1B кодируются разными генами, но имеют гомологию в аминокислотной последовательности 26% и обладают практически одинаковой биологической активностью. IL-1 является индуцибельным белком, синтез которого начинается в ответ на внедрение микроорганизмов, таких как микобактерии, либо повреждение тканей и необходим для развития воспаления и осуществления всего комплекса защитных реакций, именуемых острофазовым ответом. Важнейшие свойства IL-1 - стимуляция пролиферации преактивированных антигеном зрелых Т-лимфоцитов, увеличение продукции IL-2, IL-4, INFg и TNFa, а также стимуляция фагоцитоза [Имангулова, 2005].
Ген, кодирующий IL-1B, картирован на длинном плече хромосомы 2, в промоторной части которого, в положении -511 находится SNP полиморфизм.
Анализ локуса -511 С/Т IL-1B осуществлялся с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 2) по методике указанной в работе [Имангулова, 2005]. Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (рН=8,8), 1,25 мМ MgCb, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 95С) выполняли 35 циклов амплификации по схеме: денатурация - 30 с. при 95С; отжиг праймеров - 30 с. при 55С; элонгация - 40 с. при 72С. Затем пробы выдерживали 10 мин при 72С и охлаждали. После ПДРФ-анализа продукты рестрикции разделяли в 2% агарозном геле, предварительно окрашенном бромистым этидием, в течение 20 мин при 160V. В качестве электрофорезного буфера использовали ІхТАЕ (трис-ацетатный буфер). Результаты анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Фрагменты длиной 304 п.н. соответствовали аллелю -51 IT, 190 и 114 п.н. - -511С, а 304, 190 и 114 п.н. выявлены у гетерозигот -511СТ (рис. 4).
Исследование взаимосвязей генетических полиморфизмов интерлеикинов с качественными и количественными патогенетически значимыми для хронического гломерулонефрита признаками
Хронический гломерулонефрит характеризуется проявлением комплекса признаков, имеющих как качественную, так и количественную природу. Высокие или низкие по сравнению с популяционной «нормой» значения этих показателей, формирующихся на основе сложного взаимодействия генов и среды, обусловливают повышение вероятности заболевания или отдельных его проявлений, т.е. являются его факторами риска [Фрейдин, 1999]. В данном разделе работы мы изучили взаимосвязи рассматриваемых генетических полиморфизмов интерлейкинов как с качественными, так и с количественными признаками, характеризующими хронический гломерулонефрит с клинических позиций (средний возраст начала заболевания, клинические синдромы, зарегистрированные при возникновении заболевания и при его обострении, наличие нарушения функции почек при формировании заболевания, развитие гематурии, протеинурии, повышенного артериального давления, частота обострения заболевания).
Исследованы ассоциации генетических маркеров изучаемых генов интерлейкинов с качественными признаками, характеризующими начало ХГН (рис. 11-17, табл. 6). Изучение клинических синдромов при возникновении ХГН показало, что у 28,5% больных заболевание начиналось остронефритическим синдромом, у 30% - нефротическим синдромом. Наличие мочевого синдрома было установлено у 21,5%) пациентов, гематурический синдром наблюдался у 20%) больных ХГН.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии статистически значимых взаимосвязей трех из семи изученных полиморфных маркеров генов интерлейкинов (-889С/Т IL-1A, VNTR IL-IRa, -592С/А IL-10) с преобладанием определенного клинического синдрома при развитии заболевания (рис. 12, 13, 16). Установлено, что у пациентов с генотипом -889СС гена IL-1A заболевание достоверно чаще проявлялось гематурическим синдромом в начале заболевания по сравнению с группой пациентов - носителей генотипов -889СТ, -889ТТ: 23,2% и 12,1% соответственно (х =3,63, р=0,05) (рис. 12).
Выявлена взаимосвязь генотипов 2R/2R, 2R/4R гена VNTR IL-IRa с развитием гематурического синдрома при возникновении ХГН. У пациентов с генотипами 2R/2R, 2R/4R при начале заболевания гематурический синдром был зарегистрирован в 2,5 раза чаще, чем у носителей генотипа 4R/4R (28,4% против 11,4%; %"=8,15, р=0,005) (рис. 13).
Наряду с этим обнаружена ассоциация генотипа 4R/4R гена VNTR IL-IRa с остронефритическим синдромом при формировании ХГН, который отмечался у 35,7% больных с генотипом 4R/4R против 16,7% у пациентов с генотипами 2R/5R, 4R/5R (%2=8,32, р=0,005) и 22,4% у индивидуумов с генотипами 2R/2R, 2R/4R (%2=4,10, р=0,04) (рис. 13).
Таким образом, в результате исследования были выявлены генотипы изучаемых генов интерлеикинов, которые могут служить маркерами формирования того или иного синдрома при возникновении хронического гломерулонефрита. К генотипам - маркерам развития гематурического синдрома мы отнесли -889СС гена IL-1A и 2R/2R, 2R/4R гена антагониста рецептора интерлейкина 1. Полученные результаты согласуются с литературными данными, согласно которых аллель -889С гена IL-1A увеличивает секрецию соответствующего интерлейкина, обладающего провоспалительным эффектом [Громова, 2005]. В результате этого может наблюдаться развитие более выраженного воспалительного процесса в гломерулах почек, формируются деструктивные процессы в почечной ткани, нарушается венозный отток и развивается венозно-лоханочный рефлюкс, некротизирующие почечные ангииты, поражается клубочковая базальная мембрана, интерстиций и канальцевый эпителий, что может приводить к развитию выраженной гематурии [Нефрология, 2000]. Наряду с этим, аллель IL-lRa 2, по данным Имангуловой (2005), обусловливает увеличение продукции провоспалительного интерлейкина 1В. Согласно Santtila S. (1998) гомозиготы 2R/2R намного чаще подвергаются инфекционным заболеваниям. Нами установлено, что генотип 4R/4R гена VNTR IL-IRa детерминирует более тяжелое начало ХГН, проявляющееся остронефритическим синдромом (повышение уровня креатинина в крови более 140 мкМоль/л, гематурия, протеинурия, артериальная гипертензия) [Нефрология, 2000].
Маркером развития нефротического синдрома при возникновении ХГН, проявляющегося протеинурией более 3,5 г/сут. в сочетании со сниженным уровнем альбумина менее 35 г/л, отечностью [Нефрология, 2000], следует считать аллель -592А гена IL-10. Данный аллель увеличивает продукцию интерлейкина 10, одним из медико-биологических эффектов которого является развитие атопии [Hulkkonen, 2002]. Литературные данные свидетельствуют о значимой роли атопических реакций в развитии нефротического синдрома [Нефрология, 2000]. В основе формирования рассматриваемого синдрома лежит иммунный генез, в частности, отложение иммуноглобулинов в ткани почек (IgG, IgM, а также С1 и СЗ) [Jennette, 2006; Howie, 2001]. При светооптическом исследовании в клубочках находят очаговое утолщение стенок капилляров, очаговую пролиферацию мезангиальных клеток, иногда эпителия, выстилающего полость капсулы клубочка. Электронно-микроскопически в клубочках обнаруживается поражение подоцитов [Howie, 2001].
