Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1. Роль сигнальных систем в развитии болезни Альцгеймера 13
1.1. Роль Р-амилоидного пептида в развитии болезни Альцгеймера 14
1.1.1. Характеристика Р-амилоидного пептида 14
1.1.2. Взаимодействие р-амилоидного пептида с мембранными рецепторами 20
1.1.3. Роль сигнальных систем в цитотоксичности Р-амилоидного пептида 23
1.1.3.1. Активные формы кислорода 23
1.1.3.2. Р53 26
1.1.3.3. N0 27
1.1.3.4. NF-kB 28
1.1.3.5. Протеинкиназы 30
1.1.3.6. Продукты действия фосфолипаз как вторичные мессенджеры 32
1.1.4. Роль продуктов сфингомиелинового цикла в развитии болезни Альцгеймера 35
1.1.4.1. Роль церамида в регуляции гибели клеток нервной ткани 37
1.1.4.2. Мишени церамида при реализации апоптоза 38
1.1.4.3. Участие церамида в апоптотической гибели клеток при нейродегенеративных заболеваниях и старении 40
1.1.4.4. Влияние церамида на амилоидогенез 41
1.1.4.5. Действие р-амилоидного пептида на сфингомиелиназу 41
1.1.4.6. Роль сфингозина в развитии болезни Альцгеймера 44
1.2. Воспалительные реакции при БА. Роль цитокинов 45
1.2.1. Роль фактора некроза опухоли в развитии болезни Альцгеймера 45
1.2.2. Характеристика ФНО-а и его участие в патогенезе болезни Альцгеймера 47
1.2.3. Протекторное действие ФНО-а 48
1.2.4. Сигнальные системы, активируемые при токсических эффектах ФНО-а 51
1.3. Взаимодействие сигнальных систем при реализации токсических эффектов (ЗА и ФНО-а) 53
Глава 2. Материалы и методы исследований . 56
1. Экспериментальные модели 56
2. Препаративные методы 60
3. Аналитические методы 60
Глава 3. Результаты исследований 64
3.1. Определение параметров сфингомиелинового цикла и ПОЛ в гиппокампе, коре и мозжечке крыс при при введении р-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации 64
3.1.1. Исследование активности сфингомиелиназы при введении Р-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации в мозг крыс 66
3.1.2. Исследование содержания сфингомиелина и церамидов при введении р-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации в мозг крыс 68
3.1.3. Определение параметров пероксидного окисления липидов при введении р-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации 72
3.2. Определение параметров сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов в гиппокампе, коре и мозжечке мышей после бульбэктомии 76
3.2.1. Исследование активности сфингомиелиназы, содержания сфингомиелина и церамидов 77
3.2.2. Определение параметров пероксидного окисления липидов 80
3.3. Влияние церамида на интенсивность процессов ПОЛ и экспрессию ФНО-а в мозге мышей 83
3.3.1. Влияние церамида на интенсивность процессов ПОЛ в мозге мышей 85
3.3.2. Влияние церамида на экспрессию ФНО-а в мозге мышей 87
3.4. Влияние нейропротекторных препаратов (мексидола и мемантина) на параметры сфиногомиелинового цикла и ПОЛ 90
3.4.1. Влияние мексидола на параметры сфиногомиелинового цикла и ПОЛ 92
3.4.2. Влияние мемантина на параметры сфиногомиелинового цикла и ПОЛ 94
3.4.3. Исследование влияния мексидола, мемантина и их совместного применения на амнезию условной реакции пассивного избегания 96
Глава 4. Обсуждение результатов 97
Выводы 109
Цитированная литература 111
- Участие церамида в апоптотической гибели клеток при нейродегенеративных заболеваниях и старении
- Взаимодействие сигнальных систем при реализации токсических эффектов (ЗА и ФНО-а)
- Определение параметров сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов в гиппокампе, коре и мозжечке мышей после бульбэктомии
- Влияние нейропротекторных препаратов (мексидола и мемантина) на параметры сфиногомиелинового цикла и ПОЛ
Введение к работе
В настоящее время особый интерес клиницистов и учёных, занимающихся проблемами фундаментальной медицины, вызывает болезнь Альцгеймера (БА). Этот недуг, как правило, поражает лиц преклонного возраста, характеризуется прогрессирующим расстройством памяти и приводит к полной деградацией личности. Характерной особенностью БА является длительный период бессимптомного развития, что практически исключает возможность исследования механизмов её возникновения и ранней диагностики. Терапия сводится пока к симптоматическому лечению. Одной из главных причин этого является неясный характер этиологии заболевания, что особенно характерно в отношении спорадической (ненаследственной) его формы, которая встречается в 9 раз чаще, чем семейная, генетически обусловленная форма. В связи с этим исследование патогенетических механизмов БА и поиск направленных способов коррекции имеет важнейшее научно-практические и социальное значение.
К настоящему времени установлено, что центральным событием возникновения деменции альцгеймеровского типа является образование р-амилоидных отложений в коре и гиппокампе (Selkoe, 1994). Отложение (3-амилоида ((ЗА) и созревание сенильных бляшек вызывает множество молекулярных изменений различного рода, которые приводят к прогрессирующей дисфункции и смерти нервных клеток по типу апоптоза или некроза.
Механизмы токсичности РА активно исследуются. Показано участие различных сигнальных событий в реализации действия РА: активация каспаз 2, 3, 6 (Allen et al., 2001), РК С (Nakai et al., 1998, Giri et al., 2000) и iNOS (Akama, 1998), генерация АФК (Retz et al., 1998, Yao et al., 1999), и др. Однако последовательность событий остается не ясной и точный механизм не установлен. В последние годы появляется всё
больше фактов, свидетельствующих в пользу участия сигнальной системы сфингомиелинового цикла в реализации токсического действия рА и в патогенезе болезни Альцгеймера (БА).
Сфингомиелиновый цикл (СФМ-цикл) - повсеместно распространённая и эволюционно консервативная сигнальная система. Сфингомиелиновый путь передачи сигнала опосредует действие некоторых экзогенных факторов, таких как цитокины, ростовые факторы, гормоны, окислительный стресс, которые приводят к важным биохимическим и клеточным эффектам (Kantey et al., 1995, Zhang, Kolesnick, 1995, Dobrowski et al., 1994). Сфингомиелиновый цикл (СФМ-цикл) включает деградацию сфингомиелина (СФМ) сфингомиелиназой (СФМазой) с образованием церамида, который, в свою очередь, при участии церамидазы превращается в сфингозин.
Особый интерес исследователей обращен к СФМ циклу, поскольку СФМ и продукты его гидролиза - церамид и сфингозин - являются не только существенными компонентами мембран клеток ЦНС, но и играют важную роль в развитии, жизнедеятельности и гибели нервных клеток. В клетках мозга много СФМ, активность его метаболизма в мозге в несколько раз превышает активность в других органах, что может отразиться и на реализации действия (ЗА.
Было показано, что при БА содержание СФМ в мозге понижено (Soderberg et al., 1992), а уровень церамида в СМЖ и в ткани мозга, напротив, повышен (Gottfries et al.,1996, Han et al., 2002). Установлено, что (ЗА активирует нейтральную СФМазу и повышает продукцию церамида, что было продемонстрировано на культурах олигодендроцитов (Lee et al., 2004) и нейронов (Jana and Pahan., 2004). Кроме того, церамид может способствовать отложению амилоида и образованию сенильных бляшек (Puglielli, 2003). Все эти факты не оставляют сомнений в том, что сфингомиелиновый цикл играет важную роль в патогенезе БА.
Развитие окислительного стресса является одной из характерных черт БА (ВеЫ, 1994, Schapira, 1996, Holscher, 1998, Retz et al., 1998). Снижение глутатиона при окислительном стрессе, индуцированном амилоидом, рассматривается как важный механизм, лежащий в основе токсичности PA (Medina et al., 2002). Глутатион участвует в регуляции нейтральной СФМазы: показано, что (ЗА индуцирует апоптоз посредством активации нейтральной СФМазы через изменения в окислительно-восстановительном состоянии клетки и/или метаболизме глутатиона (Lee et al., 2004). Известно, что нейтральная СФМаза активируется Н2О2 и ингибируется глутатионом (Liu et al., 1998). Ингибирование продукции церамида антиоксидантами, и индукция оксидантами и прооксидантами определяют функцию активных форм кислорода (АФК) и глутатиона в регуляции первого шага в трансдукции сигнала по сфингомиелиновому пути. Более того, пониженный уровень глутатиона и повышенный церамида коррелируют с фрагментацией ДНК при апоптозе (Singh et al., 1998).
РА и церамид имеют общие характеристики в сигнализации клеточной гибели. И PA (Ditaranto-Desimone et al., 2003) и церамид (Singh et al., 1998) вызывают дисфункцию митохондрий и индуцируют окислительный стресс. Очевидно, взаимосвязь между окислительной системой и СФМ-циклом, существующая в живых клетках, вносит существенный вклад в развитие апоптоза при нейродегенративных заболеваниях, включая БА.
Важная роль в развитии БА отводится цитокинам. Наряду с прямым цитотоксическим действием РА повышает экспрессию провоспалительных цитокинов, таких, как ФНО-а, ИЛ-ір, ФРТ-р, ИФН-у и др. (Klegeris, 1997, Fiala, 1998, Suo et al, 1998, Akama, 1998 и др.). В пользу этого свидетельствует тот факт, что практически во всех случаях при БА в мозге наблюдаются воспалительные процессы и повышены
провоспалительные медиаторы, включая ФНО-а, ИЛ-10, ИЛ-6, ИФН-у и
др.
(ЗА индуцирует синтез цитокинов в различных клеточных культурах (Meda et al., 1995, Shalit et al., 1997, Sutton et al., 1999, Akama, Van Eldik, 2000) и результатом цитотоксического действия цитокинов, в частности ФНО-а, могут быть такие вызываемые амилоидом эффекты, как активация протеинкиназ, NF-kB, iNOS, РК С, генерация АФК и N0.
Цитокины участвуют в регуляции уровня амилоида в мозге, поскольку они регулируют синтез и процессинг П|ЗА (Goldgaber et al., 1989, Monning et al., 1994, Blasko et al., 1999, 2000, Gianni et al., 2003 Liao et al., 2004 и др.). Таким образом, цитокины, в частности, ФНО-а, могут выступать в качестве первопричины нейродегенеративного процесса.
Механизм совместного токсического действия РА и ФНО-а в клетках мозга не выявлен, однако, показано, что в присутствия ФНО-а наблюдается синергическое усиление нейротоксических эффектов [ЗА, опосредованных свободными радикалами (Rossi et al., 1996). Предполагается, что связующими элементоми могут выступать продукты сфингомиелинового цикла (церамид и сфингозин), которые являются вторичными мессенджерами и участвуют в проведении сигнала апоптоза, индуцируемого как ФНО-а, так и |ЗА.
Одним из основных механизмов токсического
действия ФНО-а является генерация активных форм кислорода. С другой
стороны, было показано, что СФМ-цикл взаимосвязан с регуляцией
процессов перекисного окисления липидов. В связи с этим
перспективным является направление исследований взаимосвязи
окислительных процессов и активации СФМ-цикла, вызванных действием р-амилоида # и ФНО-а. Это позволит лучше понять роль продукции АФК и церамида как медиаторов клеточной гибели и их
функции в патогенезе БА и других заболеваний, сопровождающихся апоптозом.
Если цитотоксичность (ЗА для зрелых нейронов в настоящее время не вызывает сомнений, то роль ФНО-а а остается не вполне ясной. В литературе наиболее распространенным является мнение о цитотоксическом действии ФНО-а, однако известно и о защитном действии ФНО-а на нейроны.
В настоящее время изучению роли РА и ФНО-а в развитии БА уделяется большое внимание, однако основной объем исследований на данный момент выполнен на клеточных культурах, и лишь незначительная часть экспериментов была проведена на животных in vivo, причем в основном были исследованы морфологические, иммунологические или физиологические параметры при введении препаратов. Несмотря на активные исследования в системах in vitro, моделирование БА in vivo встречает значительные трудности. Создание трансгенных моделей с мутациями белка предшественника (ЗА, использование специфических блокаторов рецепторов, вызывающих амнезию, не позволяют пока получить оптимальную модель заболевания. В связи с этим перспективным является создание и использование оперативных моделей. Среди таковых наиболее распространёнными являются инъекционные модели, основанные на введении в мозг животных амилоидных пептидов и других факторов, важных для развития БА. Также используют моделирование нейродегенерации удалением обонятельных луковиц, что приводит к нарушению поведенческих реакций и накоплению белка, по своей структуре частично напоминающего РА человека.
В представленной работе исследование молекулярных механизмов нейродегенерации проводилось на инъекционной модели БА, а именно
при центральном введении 0А и ФНО-а. В качестве контрольной использовалась модель с удалением обонятельных луковиц.
Целью настоящей работы являлось исследование роли сфингомиелиновой сигнальной системы и пероксидного окисления липидов в развитии повреждений в мозге животных in vivo, возникающих при развитии нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать активность СФМ-цикла (изменение активности СФМазы, содержания сфингомиелина и церамида) в разных отделах мозга животных (кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп) при действии рА, ФНО-а и их комбинации через 3 часа и 7 суток после введения препаратов.
2.0пределить интенсивность процессов пероксидного окисления липидов в разных отделах мозга (кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп) при действии 0А, ФНО-а и их комбинации через 3 часа и 7 суток после введения препаратов.
3.Исследовать активность СФМ-цикла (изменение активности СФМазы, содержания сфингомиелина и церамида) в разных отделах мозга животных при развитии нейродегенерации, вызванной удалением обонятельных луковиц (бульбэктомией).
4.0пределить интенсивность пероксидного окисления липидов в разных отделах мозга животных при развитии нейродегенерации, вызванной удалением обонятельных луковиц (бульбэктомией).
5.Изучить влияние церамида на интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и экспрессию ФНО-а в мозге животных.
6. Исследовать влияние нейропротекторных препаратов мексидола и мемантина на параметры СФМ-цикла, интенсивность ПОЛ и когнитивные функции животных.
В данной работе впервые исследовано влияние (3-амилоидного пептида на активность СФМ-цикла в мозге животных in vivo. Впервые показано, что разные отделы мозга (кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп) обладают специфичностью по отношению к активации СФМ-цикла (активность СФМазы, содержание сфингомиелина и церамида) при действии (ЗА, наиболее чувствительным является в гиппокамп. Введение животным (ЗА и ФНО-а индуцирует в мозге процессы ПОЛ, интенсивность которых различается в исследованных отделах мозга. Показано, что продукт СФМ-цикла церамид способен самостоятельно индуцировать пероксидное окисление липидов и накопление ФНО-а.
Препараты мексидол и мемантин, которые используются для лечения нейродегенеративных заболеваний (БА, болезни Паркинсона, ишемического инсульта и др.), препятствуют накоплению проапоптотического агента церамида, приводящего к гибели нейронов, что позволяет предполагать возможный механизм их действия, заключающийся в инактивации СФМ-цикла и предотвращении накопления церамида.
Результаты проведенных исследований имеют важное значение для понимания роли СФМ-цикла в механизме передачи сигнала (ЗА в клетках мозга. Данные об участии СФМ-цикла развитии нейродегенративных заболеваний ставят вопрос о новых стратегиях лечения таких заболеваний как БА, болезнь Паркинсона и др.
На защиту выносятся следующие положения:
(ЗА активирует сфингомиелиназу в мозге животных in vivo. Наиболее выраженная активация СФМ-цикла при действии (ЗА наблюдается в гиппокампе.
Как (ЗА, так и ФНО-а инициируют накопление в мозге продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и диенкетонов), наиболее интенсивно
происходящее в гиппокампе. Увеличение содержание продуктов ПОЛ соответствует активации СФМазы в соответствующих отделах мозга.
Совместно (ЗА и ФНО-а оказывают меньший эффект на параметры СФМ-цикла и ПОЛ по сравнению с эффектом каждого из них отдельно.
Церамид - продукт деградации сфингомиелина сфингомиелиназой -индуцирует пероксидное окисление липидов и накопление ФНО-а в мозге животных.
Участие церамида в апоптотической гибели клеток при нейродегенеративных заболеваниях и старении
В последнее время появляется всё больше данных об участии церамида в апоптотической гибели клеток при нейродегенеративных заболеваниях и старении (Han et al., 2002, Cutler et al., 2004). Показано, что уровень церамида в СМЖ и в ткани мозга пациентов с БА значительно выше, чем у пациентов без деменции или с другими неврологическими заболеваниями, например, с боковым амиотрофным склерозом (Gottfries et al.,1996, Han et al., 2002).
Внутриклеточный уровень церамида повышается с возрастом, что показано как на клеточных культурах, так и на целых органах (Venable et al.,1995, Lightle et al., 2000, Mouton and Venable, 2000, Miller and Stein, 2001), в том числе и в мозге при старении и при развитии БА (Han et al., 2002, Cutler et al., 2004). В культуре человеческих фибробластов церамид воспроизводил большинство признаков клеточного старения, включая задержку клеточного цикла в GO-Gl-фазе, активацию Rb, ингибирование митогенных ответов, инактивацию развития сигнальных каскадов, связанных с ФЛ Д и ПК С. Показано, что во время входа клеток в фазу старения уровень церамида повышается в 3-4 раза, указывая на роль церамида в регуляции этого процесса (Obeid et al., 1993). Дозы церамида, имитирующие эффект старения (порядка 10 мкМ), способны индуцировать стареющий фенотип молодых клеток в культуре (Venable et al.,1995, Mouton and Venable, 2000, Miller and Stein, 2001). Было показано, что церамид в таких условиях может увеличивать прорастание и выживание нейронов в культуре (Brann et al., 1999, Irie and Hirabayashi, 1998). Хроническое повышение внутриклеточного церамида может ингибировать удлинение аксонов и интернализацию комплекса фактора роста нервов с рецептором и таким образом вызывать гибель клеток (Brann et al., 1999).
Роль сфинголипидов и, в частности, церамида, в настоящее время активно обсуждается в связи с амилоидогенезом (Urmoneit et al., 1998, Puglielli et al., 2003). При исследовании влияния повышенного уровня церамида на образование [ЗА оказалось, проникающий в клетки аналог церамида, С6-церамид, способствует амилоидогенезу за счёт действия на процессинг ПрА. Церамид посттрансляционно стабилизирует (3-секретазу (повышает время её полураспада) и, таким образом, способствует амилоидогенезу. Этот процесс происходит при физиологических условиях, которые не влияют на выживаемость клеток и не активируют апоптоз. Подобно Сб-церамиду, эндогенный церамид, образующийся в результате деятельности нейтральной СФМазы, также повышает образование амилоида. Важно заметить, что ингибитор церамидсинтазы фумозин В1 не предотвращал накопление церамида в этих опытах, что говорит об основном вкладе гидролиза СФМ в процесс накопления церамида. Таким образом, экзогенный церамид повышает уровень эндогенного церамида и стимулирует генерацию амилоида клетками. (Puglielli et al., 2003).
Целый ряд доказательств свидетельствует в пользу того, что рА индуцирует апоптоз клеток нервной ткани, в частности, нейронов (Jana and Pahan., 2004) и олигодендроцитов (Lee et al, 2004), через активацию нейтральной СФМазы. Во-первых, РА активирует именно нейтральную, но не кислую СФМазу и повышает уровень церамида к клеточных культурах (Lee et al., 2004, Jana and Pahan., 2004). Фумозин B2 (ингибитор церамидсинтазы) не предотвращал апоптоз (Lee et al., 2004), что говорит о том, что основной вклад в накопление церамида при действии РА вносит именно гидролиз СФМ. Во-вторых, использование антисмысловых нуклеотидов к гену нейтральной СФМазы предотвращает гибель первичных нейронов, индуцированную {ЗА (Jana and Pahan., 2004).
Вопрос о том, каким образом рА активирует СФМазу и запускает СФМ-цикл, остаётся открытым. С тех пор как был описан сфингомиелиновый цикл, был идентифицирован целый ряд его индукторов. Для некоторых из них известны механизмы действия. Например, механизм активации сфингомиелинового цикла для ФНО-а состоит в следующем. ФНО-а связывается с р55 рецептором, что приводит к активации ФЛ А2, генерируемая в результате арахидоновая кислота активирует нейтральную СФМазу (Jayadev et al., 1994). Было показано также, что активация нейтральной СФМазы в клетках, стимулированных ФНО-а, чувствительна к окислительно-восстановительному состоянию клеток (Liu et al., 1998). Вероятно, (ЗА активирует нейтральную СФМазу также через оксидативный механизм, так как токсические эффекты пептида практически полностью снимались глутатионом (Lee et al., 2004) и N-ацетилцистеином (Jana and Pahan., 2004). рА снижает содержание глутатиона в культуре кортикальных нейронов (Medina et al., 2002) и снижение глутатиона при окислительном стрессе, индуцированном амилоидом, рассматривается как основной механизм лежащий в основе токсичности PA (Medina et al., 2002).
Известно, что нейтральная СФМаза активируется Н202 и ингибируется глутатионом (Liu et al., 1998). Внутриклеточный глутатион играет решающую роль в расщеплении СФМ с образованием церамида. Низкий уровень глутатиона требуется для генерации церамида, а высокий ингибирует её. Ингибирование вызванного цитокинами гидролиза СФМ с образованием церамида антиоксидантами, такими как N-ацетилцистеин и пирролидинтиокарбамат, и индукция продукции церамида оксидантами и прооксидантами, такими как Н2О2, аминотриазол и диамид, определяют новую функцию АФК и глутатиона в регуляции первого шага в трансдукции сигнала по сфингомиелиновому пути. Более того, пониженный уровень глутатиона и повышение уровня церамида коррелируют с фрагментацией ДНК в первичных олигодендроцитах крысы (Singh et al., 1998). Точный механизм, лежащий в основе индуцированной (ЗА активации нейтральной СФМазы, ещё предстоит выяснить, но уже сейчас участие изменений в окислительно-восстановительном состоянии клетки и/или метаболизме глутатиона можно считать доказанным. Очевидно, в живых клетках существует взаимосвязь между окислительной системой и СФМ-циклом, которая играет важную роль в развитии апоптоза при нейродегенративных заболеваниях, включая БА.
Взаимодействие сигнальных систем при реализации токсических эффектов (ЗА и ФНО-а)
На астроцитах продемонстрировано, что ингибитор нейтральной СФМазы 3-О-метилсфингомиелин снижает индуцированную цитокинами экспрессию iNOS/продукцию N0, что позволяет предположить участие сфингомиелинового сигнального пути в этом процессе (Pahan et al., 1998, Ayasolla et al., 2004). Есть данные, что индуцированная цитокинами iNOS/продукция NO активирует СФМазу. В результате активации СФМазы генерируется церамид, который, в свою очередь, опосредует индукцию Мп-СОД (Pahan et al., 1998). Таким образом, церамид активирует экспрессию iNOS (Pahan et al., 1998). В опосредованной церамидом активации iNOS участвует NF-kB, его ингибирование антиоксидантами, такими как N-ацетилцистеин и витамин Е, предполагает роль клеточного редокс-потенциала в регуляции СФМ-церамидного каскада, iNOS и Мп-СОД (Ayasolla et al., 2004, Akama et al., 1998, Pahan et al., 1999). Цитокины заметно усиливают эффект (ЗА на экспрессию iNOS/продукцию NO в астроцитах (Chiarini et al., 2005). И, наоборот, (ЗА повышает индуцироваую ФНО-а экспрессия iNOS/продукция NO в культуре олигодендроцитов (Zeng et al., 2005).
Эффект рА на индуцироваую ФНО-а экспрессию iNOS/продукцию N0 опосредуется многочисленными внутриклеточными сигнальными путями, так СФМ путь задействован в этом процессе, (Zeng et al., 2005), а также могут быть задействованы р38 МАРК и NF-kB (Pahan et al., 1998, Ayasolla et al., 2004).
Механизм совместного токсического действия РА и ФНО-а в клетках мозга не выявлен, однако, показано, что в присутствия ФНО-а наблюдается синергическое усиление нейротоксических эффектов рА, опосредованных свободными радикалами (Rossi et al., 1996). Таким образом, в ходе развития нейродегенеративного процесса при БА может происходить перекрестное усиление сигналов ФНО-а и РА в клетках мозга с участием сигнальной системы NO, транскрипционных факторов, и протеинкиназных каскадов. Предполагается, что связующими элементами могут выступать и продукты СФМ-цикла (церамид и сфингозин), которые являются вторичными мессенджерами и участвуют в проведении сигнала апоптоза, индуцируемого как ФНО-а, так и рА.
За последнее десятилетие накоплено большое количество экспериментальных данных о значительной роли ФНО-а и РА в развитии нейродегенеративного процесса. Несмотря на активные исследования в системах in vitro, моделирование БА in vivo встречает значительные трудности. Создание трансгенных мышей с мутациями белка предшественника амилоида или пресенилина не позволяет получить оптимальную модель заболевания. В связи с этим представляется перспективным развитие оперативных, например, инъекционных моделей БА, основанных на введении в мозг грызунов факторов, важных для развития заболевания.
Целью этой работы является исследование молекулярных механизмов нейродегенерации альцгеймеровского типа in vivo. В литературе изучено влияние на индукцию СФМ-цикла в мозге только ФНО-а, и на момент постановки задач не было сведений о влиянии (ЗА на этот ключевой цикл передачи сигналов гибели клеток по апоптическому типу, характерному при развитии БА. В свете новых данных о роли сфингомиелиновой сигнальной системы в реализации токсического действия (ЗА, полученных на клеточных культурах, изучение этих процессов in vivo представляет особый интерес. Остаётся неясной и роль ФНО-а, повышенная экспрессия которого наблюдается при заболевании.
Знание молекулярных механизмов, лежащих в основе нейродегенерации и нарушений памяти: развитие апоптоза, окислительного стресса и нарушения системы проведения сигналов на уровне вторичных мессенджеров СФМ-цикла, позволит применять новые стратегии лечения БА.
Определение параметров сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов в гиппокампе, коре и мозжечке мышей после бульбэктомии
Вторая использованная нами модель представляла собой модель нейродегенерации, для которой характерны некоторые составляющие симптомокомплекса БА. В основу этой модели положена гипотеза о роли нарушений в обонятельной системе в генезе БА. В результате хирургического удаления обонятельных луковиц (бульбэктомии) у животных нарушается не только обоняние, но и индуцируется депрессивно-подобное состояние. Изначально бульбэктомия и рассматривалась именно как одна из моделей депрессии (Redmond et al., 1997). Однако было показано, что помимо депрессивного состояния ведущим признаком у бульбэктомированных животных является снижение способности к обучению и воспроизведению навыка в различных поведенческих тестах (Otmakhova et al.,1992), включая нарушение пространственной памяти, тестируемой в водном лабиринте Морриса (Бобкова и др., 2001). Морфофункциональное исследование мозга БЭ мышей выявило у них также нарастание числа дегенерирующих нейронов с такими видами патологий как цитолиз, кариолизис, пикнолиз и др., а также снижение плотности ацетилхолинсинтезиующих нейронов в базальных структурах переднего мозга (Бобкова и др., 2003). Перечисленные последствия БЭ по характеру проявления и по локализации нейродегенерации напоминают БА у человека. Однако, амилоид, откладывающийся в мозге мышей после удаления обонятельных луковиц, отличается по структуре от амилоида человека. В связи с этим представляло интерес сравнить действие токсичного пептида, который мы вводили в мозг и эндогенно экспрессируемого. Подобно первой серии экспериментов в данном разделе работы были исследованы параметры СФМ-цикла и ПОЛ в гиппокампе, коре и сумме остальных структур (мозжечок и ствол мозга) мышей после удалением обонятельных луковиц.
Активность СФМазы, содержание СФМ изучали в коре, гиппокампе и в сумме остальных структур мозга мышей через 1, 2 и 6 недель после бульбэктомии. Было установлено, что в разных отделах мозга интактных и ложнооперированных мышей активность СФМазы была различна. И у интактных, и у ложнооперированных животных наибольшая активность фермента фиксировалась в гиппокампе (значение интактного контроля 64,6 имп/мин/мг белка, ложнооперированного - 54,0 имп/мин/мг белка), меньше в коре (51,5 имп/мин/мг белка и 43,1 имп/мин/мг белка) и сумме остальных структур (45,0 имп/мин/мг белка и 42,7 имп/мин/мг белка), однако, у мышей эти различия менее выражены по сравнению с крысами. После ложной операции независимо от срока (через 1, 2 и 6 недель), различия в активности в разных отделах мозга сохранялась. Следует отметить различия в активности СФМазы у ложнооперированных и интактных животных. Так, через неделю было отмечено понижение активности фермента, вызванное ложной операцией, как в гиппокампе (от 64,6 до 48,1 имп/мин/мг белка), так и в коре (от 51,5 до 36,4 имп/мин/мг белка), и в сумме остальных структур (от 45,0 до 37,4 имп/мин/мг белка).
Через неделю после БЭ наблюдалась тенденция к снижению активности фермента в гиппокампе (от 54,0 до 48,1 имп/мин/мг белка), коре ( от 43,1 до 36,4 имп/мин/мг белка), и сумме остальных структур (на рисунках - «остатки») (от 42,7 до 37,4 имп/мин/мг белка) ( и табл. 2). Достоверных изменений в активности СФМазы в гиппокампе и коре у бульбэктомированных мышей через 2 и 6 недель после операции по сравнению с ложнооперированными животными зафиксировано не было. Повышение акивности фермента наблюдалось через 6 недель лишь в остальных структурах (в мозжечке и стволе мозга) (с 36,5 до 50,1 имп/мин/мг белка).
Содержание СФМ в гиппокампе, коре и сумме остальных структур оставалось стабильным после бульбэктомии, независимо от срока (через 1, 2 или 6 недель) (табл. 3). Отсутствие изменений уровня СФМ соответствует незначительным изменениям активности СФМазы.
Развитие окислительного стресса, так же, как и на инъекционной модели, мы оценивали по содержанию продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и диенкетонов - в гиппокампе, коре и сумме остальных структур мозга мышей через 1, 2 и 6 недель после бульбэктомии.
Достоверных изменений интенсивности процессов ПОЛ у бульбэктомированных мышей по сравнению с ложнооперированными не наблюдалось (рис. 13, 14). Отмечались только тенденции к повышению содержания диеновых конъюгатов в коре через 1 неделю и 6 недель, диенкетонов - через 1 и 2 недели, через 6 недель в коре, а в сумме остальных структур - тенденции к понижению содержания продуктов ПОЛ. В гиппокампе, структуре мозга, наиболее подверженной повреждению при БА, содержание продуктов ПОЛ было стабильным, и лишь через 6 недель увеличивалось содержание диеновых конъюгатов, но и здесь достоверных изменений не зафиксировано.
Продукт гидролиза СФМ СФМазой церамид способен индуцировать гибель клеток по апоптотическому типу, вызывая межнуклеосомную деградацию ДНК и характерные морфологические изменения в структуре клетки. Изучение свойств церамида показало, что он способен активировать отдельные ферменты или быть участником каскадных ферментативных реакций, характерных для апоптоза. В последнее время появляется всё больше данных об участии церамида в апоптотической гибели клеток при нейродегенеративных заболеваниях и старении (Han et al., 2002). Показано, что уровень церамида в СМЖ пациентов с БА значительно выше, чем у пациентов без деменции или с другими неврологическими заболеваниями, например боковым амиотрофным склерозом. Известно о повышении церамида и в мозге при Б A (Gottfries et al.,1996, Han et al., 2002).
Обработка клеток PA приводит к повышению уровня церамида, с другой стороны, повышение уровня церамида при обработке клеток экзогенной СФМазой также приводит к гибели олигодендроцитов, сопровождающейся генерацией АФК. В ряде работ продемонстрировано, что церамид способен активировать образование активных форм кислорода и церамид-генерирующий фермент (СФМаза) регулируется окислительно-восстановительным состоянием клетки (Koppaka et al., 2000, Mattson et al., 1997).
Влияние нейропротекторных препаратов (мексидола и мемантина) на параметры сфиногомиелинового цикла и ПОЛ
В настоящее время активно изучаются препараты нового поколения для лечения БА. Поскольку мы и другие авторы показали активацию СФМазы и накопление церамида при действии Р-амилоида, то вполне возможно, что новые препараты и препараты, которые успешно зарекомендовали себя в качестве нейропротекторов, могли бы быть эффективны в отношении изучаемых нами параметров СФМ-цикла и ПОЛ. Нами были выбраны мексидол и мемантин.
Мексидол - водорастворимый антиоксидант, представляющий собой производное 3-оксипиридина, обладает мембраностабилизирующим действием. Синтез мексидола был осуществлен проф. Смирновым Л.Д. в ИБХФ РАН. В настоящее время этот препарат широко используется в неврологии для лечения нарушений мозгового кровообращения и в геронтологии для улучшения памяти пациентов, страдающих ее ослаблением или нарушениями. Особенностью мексидола является широкий спектр фармакологического действия, включающий наряду ноотропными свойствами анксиолитический и стимулирующий (антиастенический) эффекты, выраженное антигипоксическое действие. Мемантин - модулятор глутаматэргической системы. Глутамат как нейротрансмиттер играет существенную роль во многих физиологических функциях ЦНС (Parsons et al., 1998). Однако при определенных условиях происходит гиперактивация глутаматных NMDA-рецепторов, приводящая к дисфункции и последующей гибели нейронов через деполяризацию и нарушение гомеостаза кальция. Представления о роли глутаматэргической системы в развитии БА основываются на следующих фактах. Обнаружено, что при БА содержание глутаматных рецепторов в области гиппокампа значительно снижено, причем уровень снижения коррелирует с тяжестью деменции. Установлена роль NMDA-подтипа глутаматных рецепторов в процессах обучения и памяти. Доказаны нейротоксические свойства глутамата — явление эксайтотоксичности (Danysz et al., 1995). Мемантин сочетает свойства низкоаффинного неконкурентного антагониста NMDA-рецепторов и агониста АМРА глутаматных рецепторов. В эксперименте было показано, что мемантин защищает нейроны от нейротоксических воздействий, а также демонстрирует позитивный эффект на животных моделях обучения и памяти (Danysz et al., 2000).
Поскольку СФМ и другие сфинголипиды, в метаболизме которых участвуют церамид и СФМ, активно влияют на лиганд-рецепторные взаимодействия, мы предположили, что мексидол, обладающий антиоксидантным и мембранопротекторным действием, и мемантин, контролирующий глутаматэргическую систему, могут оказывать влияние на метаболизм СФМ.
В наших экспериментах препараты вводились крысам внутрибрюшинно однократно в течение 3 и 5 дней в виде одноразовой дозы. Мексидол вводили в дозах 100 мг/кг веса животных, а мемантин-2,5 мг/кг веса животных. Мексидол вводился крысам внутрибрюшинно ежедневно один раз в день в течение 3 и 5 дней в виде одноразовой дозы 100 мг/кг веса животных. В коре мексидол не оказывает эффекта на СФМазу, достоверных изменений активности фермента не наблюдалось ни через 3, ни через 5 дней, содержание церамида также продолжало оставаться на контрольном уровне.
В гиппокампе содержание церамида оставалось также в пределах контрольных значений, однако СФМаза проявляла тенденцию к снижению: от 93,74 до 84,68 имп/ мин/мг белка после трех дней введения препарата, и от 93,74 до 79,75 имп/ мин/мг белка после пяти дней введения препарата. Содержание продуктов ПОЛ оставалось в пределах контрольных значений, в отдельных случаях проявляя тенденцию к снижению. В таблицах 7 и 8 представлены абсолютные значения показателей изменения содержания церамида, диеновых конъюгатов и диенкетонов, активности СФМазы в коре и гиппокампе крыс соответственно.
