Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы 10
Глава 1. Фотосенсибилизируемые процессы в живых клетках, инициируемые с участием кислорода 10
Глава 2. Синглетный кислород, триплетные молекулы фотосенсибилизаторов и их роль в фотоокислительных процессах в живых клетках 25
Глава 3. Фотосенсибилизированное образование и дезактивация 'Ог компонентами биологических систем 41
Часть 2. Методы и объекты исследования 65
Часть 3. Результаты исследования и их обсуждение 95
Глава 1. Фотосенсибилизированная люминесценция хОі в клетках, тканях и моделях мембран 96
Глава 2. Эффективность фотосенсибилизированного образования ]Ог в моделях биологических мембран 122
Глава 3. Оценка скорости дезактивации 'Ог в биологических системах на основании оценки констант скорости тушения О2 компонентами мембран и цитоплазмы живых клеток. 218
Глава 4. Исследование первичных реакций фотодинамического повреждения хлоропластов при участии триплетных возбужденных молекул фотосенсибилизаторов и 'Ог 273
Заключение 273
Выводы 278
Литература 283
- Синглетный кислород, триплетные молекулы фотосенсибилизаторов и их роль в фотоокислительных процессах в живых клетках
- Фотосенсибилизированное образование и дезактивация 'Ог компонентами биологических систем
- Эффективность фотосенсибилизированного образования ]Ог в моделях биологических мембран
- Исследование первичных реакций фотодинамического повреждения хлоропластов при участии триплетных возбужденных молекул фотосенсибилизаторов и 'Ог
Введение к работе
Интенсивное освещение окрашенных пигментированных клеток и тканей живых существ способно вызывать их фотодеструктивные изменения и гибель, инициировать фотоокислительный стресс, фотоингибирование, вызывать мутации и другие повреждения нативных процессов жизнедеятельности. Наиболее вероятные интермедиаты первичной стадии фотоокисления - активные формы кислорода (АФК): молекулы синглетого ислорода, радикалы «Ог", «НС^, »ОН, перекись водорода, а также возбужденные синглетные и триплетные молекулы пигментов, радикалы и перекиси липидов и др. Эти существенно различные по химической активности молекулы способны разрушать органические молекулы, клетки и ткани, инициируя деструктивные процессы. Для понимания механизмов фотодинамических, фотоинформационных и фотопротекторных процессов и их места в метаболизме и жизнедеятельности организмов необходимо детальное исследование роли отдельных активных молекул в живых системах и их моделях.
Настоящая работа посвящена исследованию роли главным образом синглетного кислорода ('Ог) и возбужденных триплетных состояний молекул пигментов, которые с одной стороны, инициируют фотоокислительный стресс за счет участия в фотоокислительных деструктивных реакциях, а с другой могут определять многообразные фотоинформационные и фоторегуляторные процессы в живых клетках. [Sies et al., 2004-2005]. Предполагается, что именно необходимость предотвращения губительного действия фотоокислительного стресса, обусловленного указанными активными молекулами, привела к выработке эффективных фотопротекторных механизмов в клетках живых существ,
8 которые особенно развиты в пигментированных, например,
фотосинтезирующих, зрительных и других окрашенных клетках.
В классических фотохимических исследованиях [Kautsky, 1939;
Теренин, 1943-1947, Foote, 1964-1979] высказано предположение, что
основным путем образования одной из
наиболее химически активных возбужденных
-1 эВ форм кислорода -'Ог - является перенос
энергии от фотосенсибилизаторов в
возбужденном триплетном состоянии (Р) на
молекулярный кислород. Однако прямых доказательств участия этого
процесса в инициировании фотодинамических реакций in vivo не было.
Существенным успехом в исследовании роли О2 в инициации
фотобиохимических процессов было открытие явления собственной
фосфоресценции 'Ог в органических растворителях [Красновский, 1976] и
воде [Красновский, 1979; Khan, 1979], которое позволило получать
неинвазивным путём (без введения дополнительных химических
акцепторов 'Ог) достоверную информацию о свойствах Ог в системах
любой сложности.
К моменту начала данного исследования (1982 г.) была накоплена
обширная информация о свойствах 'Ог, полученная методом химических
ловушек (акцепторов х0г). Однако достоверность этой информации во
многих случаях вызывала сомнение в виду недостаточной специфичности
химических ловушек и их способности вступать в реакции не только с 'Ог,
но и с другими активными формами кислорода, свободными радикалами и
электронно-возбужденными состояниями молекул. Измерения,
основанные на регистрации фосфоресценции 'Ог, были выполнены
главным образом с использованием ограниченного круга органических
растворителей, в которых время жизни *02 наиболее велико (10 и более
мс). Эти исследования убедительно показали важность фосфоресцентного
9 метода для фотобиологических исследований (Красновский, 1976-1982). В
частности, было установлено, что основные биологические пигменты:
хлорофиллы, бактериохлорофиллы, порфирины и ретинали способны
эффективно генерировать и тушить синглетный кислород в этих средах.
Получены точные значения констант скорости тушения 'Ог жирными
кислотами и липидами и многими органическими молекулами. Однако
были сделаны лишь первые шаги в анализе фосфоресценции 'Ог в
органических средах с малым временем жизни Ог, воде, моделях мембран,
а измерения in vivo полностью отсутствовали.
Таким образом, имевшаяся экспериментальная информация и новый
исследовательский подход, основанный на измерении собственной
фосфоресценции ]Ог, определили выбор стратегии исследования и сделали
возможным выполнение настоящей работы. Имевшаяся информация
показывала, что наиболее актуален анализ участия хОг в таких процессах
как фотодинамическая терапия опухолей с участием водорастворимых
порфиринов, агрегатов и комплексов с моноклональными антителами,
фотодеструкция фотосинтетического аппарата растений и бактерий,
фотоиндуцированный катарактогенез, фотоинформационные и
фоторегуляторные процессы, инициируемых флавинами и птеринами,
фотопротекторные и фоторегуляторные реакции с участием широкого
круга физиологически активных веществ и антиоксидантов и ряд других. С
другой стороны, требовалось развитие экспериментальных подходов с
целью проведения измерений в модельных системах, наиболее
приближенных к живым клеткам и тканям, а также собственно in vivo, что
требовало существенного развития методик проведения экспериментов и
усовершенствования измерительной техники. Подробно цели и задачи
этого исследования изложены в заключение обзора литературы.
Синглетный кислород, триплетные молекулы фотосенсибилизаторов и их роль в фотоокислительных процессах в живых клетках
Согласно современным представлениям реакции фотоокисления в химических и биологических системах являются следствием образования у них триплетных молекул органических соединений и активных форм кислорода: возбужденных молекул кислорода в синглетном Ag-состоянии ( Ог), супероксидных анион радикалов («О 2 ), гидроксильного радикала (ОН), перекиси водорода, а также органических перекисных радикалов и перекисей, которые являются сильными окислителями и разрушают основные компоненты клеток: липиды, белки, аминокислоты, нуклеотиды и др. [Фридович, 1979; Фут, 1979; Gorman, Rodgers, 1981; Krinsky, 1979]. Ниже приводятся основные имевшиеся сведения об образовании и роли этих активных состояний в живых клетках и их моделях. Фотосенсибилизация фотоокислительных процессов. По классификации, предложенной Футом (на основании предшествующих работ Шенка) участие возбужденных молекул сенсибилизаторов в фотодинамических процессах обусловлено реакциями двух типов [Foote, 1991]. К типу I относятся реакции, при которых с субстратом (RH или R) непосредственно взаимодействуют возбужденные молекулы сенсибилизатора ( Р) и которые сопровождаются переносом электрона (окислением субстрата R): Взаимодействие активных продуктов реакции (1-1) с кислородом приводит к возникновению продуктов реакционно-способных молекул О 2, пергидроксильного радикала (гидратированный »0 2) других радикалов, способных инициировать деструктивные процессы и приводить к возникновению перекисей (в частности, перекиси водорода вследствие дисмутации »0 г). В результате последующих реакций возникают чрезвычайно реакционноспособные радикалы «ОН (см. ниже).
В последнее время к реакциям типа I обобщенно относят реакции окисления с участием фотовозбужденного сенсибилизатора: даже без участия кислорода, что не вполне соответствует классификации Фута, разработанной для фотодинамических процессов, происходящих с участием кислорода [Красновский, мл., 2004]. Наиболее вероятно, что в таких реакциях возбужденный фотодинамический сенсибилизатор участвует в триплетном состоянии, поскольку квантовый выход его образования у таких фотосенсибилизаторов обычно сопоставим по величине с выходом синглетного состояния, а время жизни триплетного возбуждения существенно (на 4-6 порядков величины) больше, чем синглетного. В связи с этим и вероятность взаимодействия триплетного возбужденного фотосенсибилизатора с субстратом на 4-5 порядков величины выше, чем у синглетного [Теренин, 1968; Красновский, 1990]. При реакциях типа II субстрат окисляют молекулы синглетного кислорода (!Ог), образующиеся путем переноса энергии от триплетных молекул сенсибилизатора на Ог [Фут, 1964; 1979; Foote, 1991]: Реакция (1-2) разрешена по спину и поэтому реакция имеет высокую вероятность [Разумовский, 1979]. Исследования, выполненные в модельных системах, позволили заключить, что триплетные состояния хлорофилла, порфиринов, флавинов и фурокумаринов способны участвовать в фотоокислительных реакциях типа I и П. Причем, эффективность указанных реакций в растворах хлорофилла, порфиринов и флавинов весьма высока и достигает 100% [Гуринович и др., 1968; Красновский, мл., 1980-1983; DeMol, et ah, 1981; Рорре, Grosswiner, 1975; Song, Moore, 1968]. Триплетные молекулы основных каротиноидов, по-видимому, не вызывают фотохимических реакций.
Основной причиной этого, возможно, является то, что энергия триплетного уровня каротиноидов меньше энергии !Ag - уровня кислорода [Mathis, Kleo, 1973]. Однако, для каротиноидов с малым числом сопряженных связей вероятность образования 02 в указанном процессе может быть весьма значительной [Truscott, et al., 1973]. Основным сенсибилизатором фотодеструкции пигментного аппарата хлоропластов, очевидно, является хлорофилл и, в отдельных случаях, другие порфирины. Приведенная в настоящем разделе информация свидетельствует о том, что при освещении хлоропластов в них образуется 3Хл, при этом эффективность образования долгоживущих 3Хл в нормальных растениях значительно ниже эффективности образования короткоживущих - затушенных каротиноидами 3Хл. Роль этих различающихся по времени жизни триплетных молекул, видимо, не одинакова. Показано, что в мутантах с нарушениями в биосинтезе каротиноидов выход фосфоресценции и, следовательно, выход долгоживущих триплетных молекул значительно возрастает [Красновский мл. и др., 1980]. Известно, что у таких мутантов резко падает фотоустойчивость фотосинтетического аппарата [Фридович, 1979; Goodwin, 1980; Krinsky, 1968; Mathews-Roth, et al., 1974]. Усиление фосфоресценции было также отмечено и при действии на растения других факторов, увеличивающих их фоточувствительность [Красновский, мл., 1977а; 1983; Красновский мл., Лебедев, Литвин, 1974,1975]. Это позволяет предположить, что именно долгоживущие триплетные молекулы хлорофилла, обнаруживаемые по фосфоресценции, способны играть роль инициаторов фотодеструктивных реакций. Малое время жизни короткоживущих 3Хл (около 10 мкс), видимо, существенно ограничивает их участие в фотодеструкции.
Фотосенсибилизированное образование и дезактивация 'Ог компонентами биологических систем
Среди большого многообразия окрашенных соединений в растительных клетках наибольший интерес для нас представляет анализ фотосинтетических пигментов, поскольку исторически исследование фотообразования х02 в живых клетках шло параллельно исследованию биофизики фотосинтетического аппарата и фотохимии порфириновых пигментов [Красновский, мл., 2004].
Представление о возможности образования синглетного кислорода пигментами фотосинтезирующих организмов было выдвинуто в работах Каутского, который показал, порфирины и хлорофилл в адсорбированном состоянии на зернах силикагеля способны генерировать активную форму кислорода. Автор предположил также, что 102 может участвовать в первичных реакциях фотосинтеза [Теренин, 1968]. Позже было показано, что хлорофилл в растворах является сенсибилизатором окисления разнообразных акцепторов 102 и эти реакции ингибируются тушителями синглетного кислорода [Рабинович, 1951; Фут, 1979; Koch, et al., 1982]. На основании этих факторов Фут предположил, что 102 образуется в фотосинтетическом аппарате в результате переноса энергии от триплетных молекул хлорофилла на Ог, но индуцирует не фотосинтез, как предполагал Каутский, а деструкцию клеток [Foote, Wexler, 1964]. Способность хлорофилла генерировать х02 была окончательно доказана в 1977 г., когда удалось зарегистрировать люминесценцию 102 сенсибилизированную пигментом в ССІ4 [Красновский, мл., 1977]. Аналогичная фотосенсибилизированная люминесценция х02 обнаружена в растворах предшественников хлорофилла и синтетических порфиринов. в растворах рибофлавина и фурокумаринов [Красновский, мл., 1979; Красновский, мл., 1982; Красновский, мл., 1983; Красновский, мл. и др.,1983].
Эффективность образования триплетного состояния и генерации хОі хлорофиллом и порфиринами оказались примерно одинаковыми [Венедиктов, Красновский, мл., 1982; Красновский, мл., 1977; 1982; 1983; 2004]. Этот факт показывает, что в аэробных растворах энергия триплетного состояния хлорофиллов и порфиринов, видимо, полностью расходуется на образование хОг и этот путь - один из основных путей расходования света, поглощенного молекулой пигмента. В ряде работ исследовалось образование синглетного кислорода в системах, моделирующих нативные фотосинтетические структуры, и в нативных хлоропластах. Установлено, что хлорофиллсодержащие мицеллы детергента способны сенсибилизировать окисление акцептора Ог - диметилизобензофурана [Chauvet, et al., 1981]. В хлоропластах образование Ог исследовалось с помощью акцепторов и ингибиторов Ог [Takahama et al., 1978; 1979; 1982; 1983а; 1983b; Takahama, Nishimura, 1975]. Замена H20 на D20 приводила к ускорению фотовыцветания каротиноидов и усилению перекисного окисления липидов [Takahama, 1979; 1983]. Эффективные тушители Ог (3-каротин и азид натрия ингибировали фотовыцветание пигментов и ПОЛ [Nultsch, et al., 1983; Takahama, 1978; Yamauchi, Matsushita, 1979]. При изучении мутантов бактерий, обладающих каротиноидами с различным числом сопряженных связей в молекуле, было обнаружено, что увеличение числа сопряженных связей приводит к увеличению фотостабильности клеток. Это наблюдение коррелирует с тем фактом, что увеличение числа сопряженных связей в молекулах каротиноидов усиливает их способность тушить синглетный кислород и триплетные молекулы хлорофилла [Красновский, мл., 1983; Foote, et al, 1970; 1974; Mathews-Roth, et al., 1974]. Показано также, что взаимодействие Ог, генерируемого с помощью высокочастотного разряда, с хлоропластами приводит к окислительным процессам, сходным с реакциями, возникающими в хлоропластах при их фотодеструкции [Кормановский, и др.. 1984; Мерзляк и др., 1980]. Указанные факты свидетельствуют о возможности образования !Ог в фотосинтетических мембранах и его участия в фотодеструкции пигментного аппарата. Следует однако отметить, что вывод этого анализа в значительной степени условен, так как тушители и активаторы Ог способны взаимодействовать не только с Ог, но и с другими активными молекулами, радикалами кислорода и органических соединений [Packer, et al., 1981]. Существенно также отметить, что при исследовании реакционных центров, изолированных из клеток мутантных бескаротиноидных фотосинтезирующих бактерий, удалось зарегистрировать люминесценцию в области 1270 нм. По мнению авторов, обнаруженное свечение со значительной долей вероятности является люминесценцией СЬ [Shuvalov, Parson, 1981]. Этот эффект в дальнейшем (как будет показано в экспериментальной части) был проанализирован в лаборатории Дж.Барбера (Великобритания) и работах Dedic с соавторами [Machpherson, et al., 1993; Telfer, et al., 1994; Oldham, et al., 1999; Dedic, et al., 2003].
Темновые и ферментативные процессы. Свечения, возникающие в процессе ферментативных и темновых химических реакций многообразны по своей природе и спектру участвующих активных форм кислорода [Васильев, Цаплев, 2006].
Установлено, что хОг эффективно образуется не только в фотосенсибилизированных процессах, но также и в ряде темновых химических и ферментативных реакций. Например, в реакции между Н2О2 и D2O, при термическом разложении эндоперекисей и дтоксентов, при распаде озонидов, взаимодействии озона с биомолекулами [Разумовский, 1979; Kanofsky, Sima, 1991], в миелопероксидазной антимикробной реакции в лейкоцитарной системе [Rosen, Klebanof, 1977], при окислении ксантина в присутствии ксантиноксидазы, при НАД Н зависимом перекисном окислении липидов микросом, при реакциях, катализируемых перексидазами [Krinsky, 1979]. Наиболее убедительным доказательством участия !Ог в ферментативных реакциях является обнаруженная в работах [Kanofsky, 1984; Khan, 1983; Khan, et al., 1983; Kanofsky, Sima, 1991] люминесценция Ог с максимумом около 1300 нм при реакциях окисления, катализируемых лактопероксидазой и хлорпероксидазой.
Эффективность фотосенсибилизированного образования ]Ог в моделях биологических мембран
Порфирины составляют широко распространенную полифункциональную группу соединений, связывающую самые различные таксономические группы, начиная от примитивных растительных клеток и кончая высшими формами позвоночных [Гуринович и др., 1968]. Способность хлорофиллов приводить к окислению кислородом различных веществ, вызывать фотодеструкцию, в частности, фотодеструкцию фотосинтетического аппарата и фотообесцвечивание хлорофилла известна с первой половины XX в. [Теренин, 1968].
Ранее путем регистрации фотосенсибилизированной люминесценции х02 (1270 нм) в нашей лаборатории было показано, что хлорофиллы эффективно сенсибилизируют образование триплетного состояния и Ог в органических растворителях, главным образом в СС14 [Красновский, мл., и др. 1977-1985; Borland et al., 1987]. В то же время невозбужденные молекулы пигментов активно тушат синглетный кислород, что приводит к физической дезактивации х02 и разрушению фотосенсибилизаторов, уменьшая эффективность их фото динамического действия [Krasnovsky, Jr., 1979; Красновский, мл. и др., 1982].
В этом разделе нашей работы исследовалась способность хлорофилла а и бактериальных пигментов сенсибилизировать образование х02 в моделях фотосинтетических мембран, при различной сольватации молекулы хлорофилла, в полимерных пленках и в агрегатах пигмента.
Представляло интерес изучить процессы фотогенерации и тушения х02 в органических средах и водных растворах, моделирующих основные типы межмолекулярных взаимодействий пигментных молекул в живых клетках. В качестве примера таких взаимодействий были использованы включение пигментов в водные мицеллярные растворы детергента, различные типы сольватации по центральному атому магния и ассоциация пигментных молекул.
Люминесценцию Ог измеряли с помощью импульсного лазерного фосфориметра, описанного в выше (см. Часть И. Материалы и методы). Абсолютные значения квантовых выходов генерации х02 (ФА) определяли путем сравнения интенсивности люминесценции в растворе исследуемого пигмента и стандарта (ТФП или ТСФП) в соответствии с методикой, описанной в том же разделе. Результаты измерения представлены в Табл. 3-4 и 3-5. Измерения проводили в диэтиловом эфире, пиридине и ССІ4, дополнительно очищенных перегонкой, мицеллярном растворе детергента тритона Х-100 (2%), в дейтерированной воде (D20), а также в смеси этилового спирта с D2O (5:95). Получение пигментов описано в Части 2. Пигменты очищали хроматографией на сахарозе. Учитывая фотолабильность бактериальных пигментов, все операции по приготовлению растворов осуществляли в темноте. Концентрации пигментов определяли на основании известных значений молярных коэффициентов экстинкции в длинноволновых максимумах (Qy) поглощения (9,5 104, 7,3 104 и 7,3 104 NT CM"1 для бактериохлорофиллов а, Ь и бактериофеофитина а в диэтиловом эфире соответственно, и 4,3 104 М см"1 для бактериофеофитина Ь в этаноле [Van der Rest, Gingras, 1974, Дроздова и др., 1980]). Значения коэффициентов экстинкции в других растворителях определяли экспериментально, исходя из указанных выше коэффициентов в эфире и этаноле.
При освещении растворов пигментов импульсами азотного лазера (337 нм) зарегистрирована люминесценция с максимумом -1270 нм, соответствующая дезактивации возбужденного А -состояния молекулярного кислорода (рис. 3-7). Время жизни люминесценции при малых концентрациях сенсибилизаторов составляло 34 мкс в диэтиловом эфире, 11 мкс в пиридине, 35 мкс в водных детергентных растворах и 60 мкс в D20, содержащей 5% этанола. Установлено, что эффективность образования xOi бактериальными пигментами и хлорофиллом а в диэтиловом эфире и пиридине различается несущественно и варьирует в пределах 40-55% (табл. 3-4, 3-5). Несколько выше значения Фл в ССЦ (55-75%) (табл. 3-5). В мицеллярном растворе детергента тритона Х-100 Фл заметно меньше (10-35%). Наиболее резкое уменьшение Фл наблюдали в растворах пигментов в воде, содержащей 5% этилового спирта (Фл 0,03%). Спектры поглощения растворов показывают, что в органических растворителях и в водных растворах детергента пигменты находятся в мономерном неассоциированном состоянии (рис. 3-8, 3-9). В диэтиловом эфире, по-видимому, центральный атом магния бактериохлорофиллов и хлорофилла сольватирован одной молекулой растворителя, а в пиридине двумя [Callahan, 1987]. В D20 без детергента пигменты, судя по смещению ИК-максимумов поглощения в длинноволновую область, представлены главным образом молекулярными ассоциатами (рис. 3-8, 3-9). Таким образом, изменение характера сольватации мономерных молекул пигментов не приводит к существенному изменению эффективности образования Ог. Причем полученные в этом случае значения Фл близки по величине к значениям квантового выхода образования триплетного состояния Ф, [Красновский, мл., 1985, Borland, et al., 1987, Лосев и др., 1987]. Ассоциация молекул пигментов в воде вызывает наиболее резкое снижение эффективности образования Ог. В присутствии детергента наблюдается увеличение значения Фл, которое, однако, не достигало величины, характерной для органических растворителей, по-видимому, вследствие неполной солюбилизации пигментных молекул детергентом. Таким образом, мономерные молекулы бактериальных фотосинтетических пигментов являются эффективными ИК-сенсибилизаторами образования xOi как в органических растворителях, так и в гетерогенных мицеллярных растворах, которые можно рассматривать как молекулярную модель клеточных мембран.
Исследование первичных реакций фотодинамического повреждения хлоропластов при участии триплетных возбужденных молекул фотосенсибилизаторов и 'Ог
В соответствии с результатами, полученными в предыдущей главе и в согласии с данными других авторов, мы предположили, что фотопротекторные механизмы, обеспечивающие жизнедеятельность клеток и тканей, содержащих природные или экзогенные фотосенсибилизаторы, должен включать как механизмы, обеспечивающие тушение - дезактивацию - СЬ, но также и (с учетом существенного пробега 02 в цитоплазме и мембранах), механизмы, существенно снижающие выход образования (. Эту гипотезу мы попытались проверить, исследуя нативные модельные системы. Как указывалось в гл. 1, ограниченность систематических измерений с использованием фосфоресценции СЬ в сложных биологических живых объектах потребовало привлечения специально разработанного подхода, основанного на сопоставлении данных по скорости фотодеструкции компонентов клеток и оценки эффективности образования триплетных молекул фотосенсибилизатора, приводящих к образованию Ог- В качестве исследуемой системы был выбран фотосинтетический аппарат высших растений, для фотосенсибилизаторов которых были проведены детальные систематические измерения эффективности образования и дезактивации Известно, что интенсивный солнечный свет вызывает не только ингибирование фотосинтеза [Jones,Kok, 1966; Heber, et al., 1967-2002; Shuvalov, Heber, 2003; Critchley, 1981; Powles, Bjorkman, 1988; Tandori, et al., 2001; Hideg, 2001; Barber, Andrersson, 2002], но и способен вызывать повреждение хлоропластов, обусловленное окислением компонентов фотосинтетических мембран кислородом [Рабинович, 1953; Anderson, Robertson, 1960; Chow, 1994; Blokhina, et al., 2003] Устойчивость растений к фотоповреждению существенно зависит от генетических особенностей, местообитания, условий выращивания и, по-видимому, является одним из важных факторов естественного отбора и продуктивности растений. Предполагается, что роль первичных инициаторов окислительного фотоповреждения фотосинтетических мембран могут играть возбужденные молекулы хлорофилла в триплетном состоянии или супероксидные радикалы, возникающие при взаимодействии кислорода с восстановленными переносчиками электрона в электронтранспортиой цепи хлоропластов [Фут, 1979; Krinsky, 1968; Takahama, et al., 1978-2003; Мерзляк, и др., 1975-2005; Van Ginkel, Raison, 1980]. Ответ на вопрос о том, какой из указанных механизмов играет доминирующую роль, пока не получен. Однако вращает на себя внимание тот факт, что при механизме 1 скорость фотодеструкции должна определяться стационарной концентрацией триплетных состояний ([ Хл]) в освещенных хлоропластах и увеличиваться пропорционально интенсивности действующего света, не обнаруживая характерного для скорости фотосинтеза насыщения при умеренных освещенностях. При механизме 2. наоборот, связь между [ Хл] и фотодеструкцией должна отсутствовать, так как первичное разделение зарядов в реакционных центрах фотосинтеза идет через синглетное, а не триплетное состояние хлорофилла [Klimov, Krasnovsky, 1981; Шувалов, Красновский, 1981; Шувалов, 2000; Klimov, 2003; Shuvalov, Yakovlev, 2003; Shuvalov, et al., 1979; 1986a; 1986b; Shuvalov, Klimov, 1976;].
Кроме того, в этом случае можно ожидать, что световая кривая фотодеструкции окажется близкой к световой кривой фотосинтеза. В связи с этим в этой работе, в соответствии с целями и задачами настоящего исследования мы предприняли попытку изучения фотодеструкции (фотовыцветания) фотосинтетического аппарата различающихся по своей устойчивости объектов параллельно с изучением низкотемпературной фосфоресценции хлорофилла в них, которая отражает выход триплетов. Таким образом, предприняли попытку сопоставить скорости фотодеструкции фотосинтетических мембран и стационарную концентрацию триплетных молекул хлорофилла в листьях и хлоропластах, существенно различающийся по фотоустойчивости, а также изучить зависимость скорости фотодеструкции от интенсивности освещения. При этом в качестве показателя эффективности фотодеструкции хлоропластов использовали величину квантового выхода фотоокисления хлорофилла (Фох), а о стационарной концентрации триплетных молекул пигмента судили по квантовому выходу его фосфоресценции (Фрь) [Krasnovsky, A.A., Jr, 1982; 1994]. Предварительные данные, свидетельствующие о качественном соответствии между Фох и Фрь в нормальных и мутантных листьях кукурузы, были описаны ранее в работе сотрудников нашей группы [Красновский и др., 1980]. Здесь мы попытались получить количественную информацию с использованием более широкого круга объектов. Квантовые выходы фотоокисления хлорофилла определяли на основании измерения скорости фотовыцветания длинноволновой полосы поглощения пигмента под действием красного света интенсивностью около 0,1 Вт/см, пропускаемого светофильтром КС-11 (А, 600 нм) и тепловым фильтром (вода, 5 см) при комнатной температуре. Значения Фох рассчитывали по начальному участку кинетики выцветания пигмента, соответствующему падению оптической плотности в максимуме поглощения хлорофилла на 15—30% от исходной. При этом, основываясь на выводах работ [Allen, 1964; Goodheer, 1961], предполагали, что в хлоропластах и растворах молярные коэффициенты поглощения хлорофилла примерно одинаковы. Квантовые выходы фосфоресценции хлорофилла измеряли на ранее созданной в нашей лаборатории установке с фосфороскопом в жидком азоте (при —196) [Красновский, Лебедев, Литвин, 1975; Krasnovsky, 1979], рис. 2-3, 2-4. В замороженном состоянии оптическая плотность зеленеющих листьев фасоли составляла 0.2, листьев ячменя - 1.0, гороха -1.0, суспензий хлоропластов и растворов хлорофилла, приготовленных для измерения флуоресценции - 0.15.
Объектами исследования служили растворы хлорофилла а в органических растворителях (в ацетоне и дейтерированном пиридине); зеленеющие листья фасоли (сорт Овошная-кустовая 1024) на начальной стадии зеленения, когда полностью завершено превращение предшественников в хлорофилл, но хлорофилл и каротиноиды остаются пространственно разобщенными [Butler, 1961]; хлоропласты, выделенные из мутантных растений кукурузы, синтез каротиноидов у которых блокирован на стадии -каро-тина (Р-каротин и ксантофилы отсутствуют) [Horvath, Faludi-Daniel, 1971; Faludi-Daniel, et al., 1968-1972]; хлоропласты, выделенные из листьев мутантных растений ячменя (исходный сорт Донариа), лишенных компонентов пигмент-белкового светособираюшего комплекса и хлорофилла Ъ [Sagromsky, 1978; Hawaux, Tardy, 1997], а также хлоропласты, выделенные из нормальных растений гороха сорта Грибовский ранний и исходных немутантных линий кукурузы и ячменя. Хлоропласты выделяли в фосфатном буфере (0.06 М, рН 6,9), содержащем 0,35 М NaCl, по методикам, описанным в [Horvath, Faludi-Daniel, 1973; Sagromsky, 1978; Arnon, 1954].
