Содержание к диссертации
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1 Изменения генетического материала соматических 12
клеток при воздействии ионизирующего
излучения
Индукция соматического мутагенеза (механизмы 12 формирования структурных и генных мутаций)
Индукция нестабильности генома 15
Ключевая роль мутаций в канцерогенезе 18
Радиационно-индуцированный канцерогенез 20
Методы оценки мутагенеза в соматических клетках по отдельным генным локусам и возможность их применения в популяционных исследованиях 22
1.5. Высокий уровень соматического мутагенеза, как 30
показатель повышенного риска развития онкопатологии..
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
2.1. Характеристика обследованных групп 35
Характеристика группы лиц, обследованных с помощью GPA-теста 35
Характеристика группы лиц, обследованных с помощью TCR-теста 36
Подготовка проточного цитометра к работе 37
Определение частоты GPA-мутантных клеток 37
Фенотипирование крови доноров 37
Фиксация и окрашивание клеток 37
Биотинилирование антител к М-форме гликофорина А... 41
2.4. Определение частоты TCR-мутантных клеток 43
2.5. Статистический анализ полученных результатов 46
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 47
3.1. Частота мутантных клеток в группах контрольных
необлученных лиц 47
3.1.1. Частота мутантных по TCR-локусу клеток у
контрольных доноров 47
3.1.2. Частота GPA-мутантных клеток у контрольных лиц 48
3.2. Частота клеток с генными мутациями у жителей
радиационно-загрязненных территорий Орловской
области 49
Частота GPA-мутантных клеток 50
Частота TCR-мутантных клеток 58
3.3. Частота клеток с генными мутациями у жителей
радиационно-загрязненных территорий Орловской
области в зависимости от возраста на момент начала
радиационного воздействия 63
Частота GPA-мутантных эритроцитов 66
Частота TCR-мутантных клеток 68
3.4. Частота мутантных клеток у лиц со злокачественными
новообразованиями ЩЖ 69
Частота TCR -мутантных клеток 69
Частота GPA-мутантных клеток 72
ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 75
Частота мутантных клеток у контрольных доноров 75
Влияние хронического облучения в малых дозах на уровень мутантных клеток по TCR- и GPА-локусам 76
4.2.1. Влияние хронического облучения в малых дозах на
уровень мутантных клеток по локусу гликофорина А 77
4.2.2. Влияние малых доз хронического облучения на уровень
мутантных клеток по TCR-локусу 79
4.3. Повышенная частота мутантных клеток как критерий для
формирования группы риска развития онкологических
заболеваний 82
ВЫВОДЫ 88
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90
Список использованных сокращений
Введение к работе
На протяжении последних десятилетий радиобиологи активно стараются оценить риск для здоровья человека от воздействия ионизирующего излучения (ИИ) (особенно интересен диапазон малых доз). В отличие от воздействия ИИ в больших дозах, которое может вызывать существенные нарушения здоровья, в том числе лучевую болезнь и гибель организма, ИИ в малых дозах не всегда вызывает видимые морфофункциональные изменения у живых организмов. Тем не менее, многочисленные литературные данные показывают, что ИИ в малых дозах индуцирует комплекс цитогенетических, биохимических и биофизических изменений в клетках организма животных и человека (Бурлакова и др., 1996, 1999; Пелевина и др., 2003; Mothersill and Seymour, 2003). Хотя механизмы действия малых доз ИИ все еще остаются недостаточно изученными, можно предположить, что с обнаружением феномена радиационно-индуцированной нестабильности генома у потомков облученных клеток, большую значимость приобретают исследования изменений генетического материала, особенно интересно изучение проявлений этого явления на генном уровне при облучении человека в диапазоне малых доз. В связи с этим представляет интерес исследование генных мутаций в соматических клетках людей, подвергающихся низкоинтенсивному радиационному воздействию в малых дозах вследствие проживания на загрязненной радионуклидами территории.
Одно из самых неблагоприятных последствий воздействия радиации -индукция злокачественных новообразований. Радиационное воздействие играет роль пускового механизма в канцерогенезе, а дальнейшее развитие событий зависит от состояния репарационной, иммунной, эндокринной и других систем организма, ответственных за реакцию организма на повреждающее воздействие. При обследовании людей, облученных в малых дозах вследствие проживания на загрязненных территориях, показано, что только у части лиц развиваются вредные последствия. С 1992 г. имеет месте
7 драматический рост числа заболевших РЩЖ, особенно среди тех лиц, кто находился в детском возрасте на момент аварии, поскольку радиочувствительность ЩЖ особенно высока у детей младшего возраста. В настоящее время в Брянской и Орловской областях показатель заболеваемости РЩЖ для лиц, облученных в детском возрасте, в 3-5 раз превышает аналогичный по стране в целом. В связи с этим проблема выявления групп повышенного канцерогенного риска является одной из самых актуальных.
Поскольку известно, что мутации играют ключевую роль в канцерогенезе, то подход для выявления групп повышенного канцерогенного риска, основанный на оценке уровня соматического мутагенеза в организме, можно рассматривать как один из наиболее перспективных. Правомерность такого подхода следует из представления, что возникновение мутаций, как правило, является стохастическим процессом, поэтому можно предположить, что количество клеток с мутациями в любом гене (в том числе и не имеющем прямого отношения к канцерогенезу) отражает общий уровень соматического мутагенеза в организме. В таком случае, лица с высокой частотой мутаций в генах, даже непосредственно не связанных со злокачественной трансформацией, будут составлять группу риска в отношении развития опухолей. Известные к настоящему времени факты (Hagmar et al., 1994; Akiyama et al., 1995, b; Grant et al., 1999; Замулаева и др., 2001; Орлова, 2002), подтверждают эту гипотезу.
Таким образом, не вызывает сомнений актуальность исследования соматического мутагенеза в отдельных генных локусах после радиационного воздействия. Среди существующих методов определения генных мутаций наиболее перспективными следует считать проточноцитометрические методы выявления клеток, мутантных по локусу Т-клеточного рецептора (TCR -тест) и по локусу гликофорина A (GPA -тест). До недавнего времени эти тесты использовались наряду с традиционными методами определения структурных мутаций для ретроспективной дозиметрии (Langlois R.G. et al,
8 1987; Akiyama M et al, 1991; Саенко и др., 1998, 2000). В отношении использования этих методов для выявления лиц с высоким уровнем соматического мутагенеза в литературе имеется всего несколько публикаций (Akiyama et al., 1995; Замулаева и др., 2001), однако они свидетельствуют о перспективности применения этих методов для формирования групп повышенного риска развития онкологических заболеваний ряда локализаций. В отношении патологии щитовидной железы (ЩЖ) подобных исследований не проводилось. Поэтому исследование потенциальной возможности использования оценки уровня соматических генных мутаций у больных РЩЖ, проживающих в загрязненных радионуклидами районах, представляет особый интерес в связи с повышенной частотой заболеваний ЩЖ и с тем, что РЩЖ у части таких больных обусловлен радиационным воздействием. В настоящее время доказано, что облучение ЩЖ ионизирующим излучением приводит к увеличению частоты как злокачественных, так и доброкачественных заболеваний ЩЖ. Поскольку доброкачественные узловые новообразования в ЩЖ часто ведут к злокачественной трансформации, то исследование уровня генных мутаций в соматических клетках у лиц с выявленной узловой патологией ЩЖ и проживающих неї загрязненных радионуклидами территориях, позволит судить о возможности использования методов определения генных мутаций для формирования групп повышенного риска развития РЩЖ.
Таким образом, целью данной работы являлось выяснение нескольких вопросов. Первый из них - действительно ли у лиц, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях, и больных РЩЖ наблюдаются повышенные частоты клеток с генными мутациями. Второй - является ли применение GPA- и TCR-тестов перспективным для формирования групп риска в отношении возникновения РЩЖ. Интерес представляла также оценка информативности указанных тестов для биодозиметрии при разных дозах облучения щитовидной железы.
9 Для достижения данной цели предполагалось решить следующие задачи:
провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по TCR-и GPA-локусам у жителей загрязненных в результате аварии на ЧАЭС районов и необлученных контрольных лиц;
установить, существует ли зависимость между дозой, поглощенной ЩЖ, и частотой мутантных клеток по GPA- и TCR-локусам у жителей загрязненных в результате аварии на ЧАЭС районов (на примере жителей Орловской области);
провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по 2 указанным локусам у жителей Орловской области с выявленной доброкачественной узловой патологией ЩЖ и без таковой;
провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по 2 указанным локусам у больных РЩЖ до лечения и у здоровых лиц;
оценить возможность использования данных тестов для формирования групп риска в отношении возникновения РЩЖ;
Научная новизна работы
В результате проведенных исследований показано, что у жителей загрязненных территорий, подвергающихся хроническому облучению в малых дозах, средняя частота клеток с генными мутациями по TCR- и по GPA-локусам статистически значимо превышает контрольный уровень. Однако для всех обследованных лиц не установлено прямой зависимости выхода этих мутантных клеток от степени загрязнения радионуклидами различных районов. Показано, что у постоянных жителей загрязненных территорий Орловской области с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы средняя частота клеток с генными мутациями по TCR-локусу статистически значимо превышает не только контрольный уровень, но и этот показатель у жителей Орловской области без такой патологии. В результате исследования впервые были получены данные о частоте
10 мутантных клеток по TCR- и по GPA-локусам у больных раком щитовидной железы до начала специфического лечения.
Практическая значимость работы
Результаты обследования жителей радиоактивно загрязненных территорий с доброкачественной узловой патологией ЩЖ, а также пациентов со злокачественными новообразованиями ЩЖ свидетельствуют о возможности выявления лиц, в том числе среди подвергшихся действию ионизирующих излучений в малых дозах, с повышенным риском развития РЩЖ, основываясь на показателях соматического генного мутагенеза в разных локусах (прежде всего, по TCR-локусу).
Основные положения, выносимые на защиту
У жителей Орловской области, подвергающихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию в малых дозах (плотность загрязненности по Cs 6,6-213 кБк/м ) наблюдается высокая частота клеток с генными мутациями по разным локусам.
В отдаленные сроки после облучения в малых дозах выход клеток с генными мутациями прямо не зависит от величины дозовой нагрузки на щитовидную железу в диапазоне доз 0,41-641 мГр.
Лица с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы и больные раком щитовидной железы имеют более высокие частоты клеток с мутациями по локусу Т-клеточного рецептора. Вероятно, повышенный уровень частоты клеток с генными мутациями может являться критерием для формирования группы лиц с высоким риском развития РЩЖ.
Апробация работы По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях: Международный конгресс «Энергетика 3000 (энергетика и человек)», 2001г., Обнинск; Международная школа - конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", 2003 г., Пущино; III съезд по радиационным
исследованиям (радиобиология и радиоэкология), 2003 г., Киев; V съезд
по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология,
радиационная безопасность), 2006 г., Москва; International summer school
"Molecular mechanisms in homeostasis and disease", 2003r., Greece; Cancel
immunology and immunotherapy summer school, 2003 г., Greece; 35th Annual
Meeting of the European Environmental Mutagen Society, 2005 г., Kos,
Greece.
Диссертация апробирована на научной конференции
экспериментального радиологического сектора ГУ-МРНЦ РАМН «20»
апреля 2006 г.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах печатного текста, иллюстрирована 30 таблицами, 13 рисунками. Работа состоит из введения, четырех глав «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», выводов, списка литературы, включающего 113 источника.
