Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Канцерогенез 11
1.2 Генетические концепции канцерогенеза
1.2.1 Мутационная концепция канцерогенеза 23
1.2.2 Анеуплоидная концепция канцерогенеза 25
1.2.3 Эпигенетическая концепция канцерогенеза
1.3 Хромосомные аномалии при раке молочной железы 31
1.4 Метилирование ДНК при раке молочной железы 39
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 53
2.1 Материал 53
2.2 Морфологическое исследование 56
2.3 Выделение ДНК 57
2.4 Сравнительная геномная гибридизация
2.4.1 Получение препаратов метафазных хромосом 59
2.4.2 Мечение тестируемой и контрольной ДНК 60
2.4.3 Постановка гибридизации 61
2.4.4 Детекция гибридизационных сигналов 62
2.5 Анализ статуса метилирования ДНК с помощью биологического микрочипа 63
2.6 Метилспецифическая ПЦР с бисульфитной модификацией ДНК 65
2.6.1 Бисульфитная модификация ДНК 65
2.6.2 Метилспецифическая ПЦР і
2.6.3 Обработка ДНК CpG-метилазой 66
2.7 Статистический анализ 68
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 71
3.1 Молекулярно-цитогенетический анализ тканей молочной железы и регионарных лимфатических узлов 71
3.1.1 Спектр и частота хромосомных аномалий тканей молочной железы и регионарных лимфатических узлов 71
3.1.2 Корреляции хромосомных аберраций и клинических параметров у больных раком молочной железы 89
3.2 Изучение статуса метилирования ДНК в тканях молочной железы и
регионарных лимфатических узлов 95
3.2.1 Межгрупповой анализ дифференциального метилирования генов в тканях молочной железы и регионарных лимфатических узлов с метастазами 96
3.2.2 Оценка статуса метилирования генов контроля клеточного цикла RB1, р14АЩ CDKN2B 124
Заключение 135
Выводы 144
Список литературы 147
- Мутационная концепция канцерогенеза
- Сравнительная геномная гибридизация
- Спектр и частота хромосомных аномалий тканей молочной железы и регионарных лимфатических узлов
- Межгрупповой анализ дифференциального метилирования генов в тканях молочной железы и регионарных лимфатических узлов с метастазами
Введение к работе
Актуальность исследования. Высокая частота заболеваемости и смертности от рака молочной железы (РМЖ) женщин во всем мире обуславливает повышенный интерес исследователей к данной патологии (Комарова, 2008; Давыдов, Аксель, 2009). Однако как этиология, так и патогенез данного заболевания до сих пор остаются не до конца изученными, поскольку генетически обусловленные случаи РМЖ ограничиваются только 5-8 % (Карпухин и др., 2002; Любченко и др., 2007; Коваленко и др., 2008; Foulkes, 2008). На данный момент общепринятой является мутационная концепция канцерогенеза, которая подразумевает, что за инициацию и прогрессию опухоли ответственны генные мутации. При этом другие нарушения генетического аппарата клеток, такие как хромосомные аберрации и эпигенетические аномалии, отходят на второй план, рассматрнваясь как следствие возрастающей геномной нестабильности, хотя они, также как и генные мутации, являются неотъемлемым компонентом неопластической трансформации.
На сегодняшний день встречаются различные мнения по поводу роли хромосомных аберраций в процессах малигнизации. В 1999 году Питер Дьюсберг сформулировал анеуплоидную гипотезу канцерогенеза, согласно которой возникновение и рост опухоли в большей степени связаны с ошибками в распределении хромосом, чем с накоплением генных мутаций (Duesberg, 1999). Основные положения данной гипотезы подтверждаются рядом исследований, в которых продемонстрировано, что хромосомные аномалии являются одними из ранних генетических нарушений, приводящих к индукции нестабильности генома клетки и, как следствие, к её злокачественной трансформации (Sneige et al., 2006; Lv et al., 2008; Gao et al., 2009).Существует обширная база данных «Progenetix» (), в которой на настоящий момент (ноябрь 2011 г.) собраны результаты 954 молекулярно-цитогенетических исследований 29069 опухолей различной локализации, в том числе 2127 случаев РМЖ, демонстрирующие существенный вклад хромосомных аберраций в развитие онкологических заболеваний. В то же время, в ряде случаев хромосомные аномалии рассматриваются как следствие различных генетических и эпигенетических нарушений, таких как аномалии сегрегации центросом и дисфункции теломер, точковые мутации в различных онкогенах и онкосупрессорах, гиперметилирование генов, ответственных за репарацию ДНК и регуляцию клеточного цикла (Соколенко и др., 2008;Salisbury, 2001; Donate, Blasco, 2011).
В последнее время в мировой литературе начинают накапливаться данные, указывающие на значительный вклад и эпигенетических аберраций в инициацию и развитие злокачественного процесса (Залетаев и др., 2004; Kuznetsova et al., 2007; Esteller, 2008; Feinberg, 2010; Vlassov et al, 2010). В 2006 году Эндрю Фейнберг с соавторами выдвинули гипотезу, согласно которой фундаментальной основой рака являются эпигенетические нарушения генов-инициаторов опухоли в стволовых клетках или клетках-предшественниках (Feinberg et al., 2006). Не вызывает сомнения и тот факт, что эпигенетические нарушения являются важнейшими атрибутами клетки с уже инициированным злокачествен-
ным процессом. Следовательно, изучение эпигенетического статуса генома при раке является необходимым элементом для более глубокого понимания механизмов злокачественной трансформации и для выявления нового поколения биомаркеров с целью ранней диагностики онкологических заболеваний. В основе эпигенетических изменений генной экспрессии лежат стабильные, наследуемые, но потенциально обратимые ковалентные модификации хроматина, такие как метилирование цитозиновых оснований ДНК и химические изменения гистонов (ацетилирование, метилирование, убиквитинирование, фосфорилиро-вание). Аномалии метилирования ДНК при раке представлены в основном гиперметилированием промоторных регионов онкосупрессорных генов, а так же глобальным гипометилированием всего генома. Согласно результатам некоторых исследований, нарушения статуса метилирования возникают задолго до развития клинически выраженного рака (Euhus et al., 2008; Park et al., 2011).Актуальность изучения эпигенетических аномалий обуславливается также работами, которые свидетельствуют о большом диагностическом потенциале аберрантного метилирования внеклеточной циркулирующей ДНК в периферической крови больных с онкологическими заболеваниями (Рыкова и др., 2008; Тамкович и др., 2008; Vlassov et al., 2010).
Вопросы о первичности и взаимосвязи генных, хромосомных, либо эпигенетических аномалий в индукции геномной нестабильности в процессе развития онкологических заболеваний, в том числи и РМЖ, остаются открытыми и являются предметом дискуссий (Имянитов, 2010; Lotem, Sachs, 2002; Slattery et al., 2011). Также возникают вопросы, касающиеся роли вышеуказанных нарушений генома в развитии определенных признаков злокачественной трансформации клеток, например, метастазирования. Все вышесказанное указывает на актуальность исследований, которые раскрывают вопросы патогенетики РМЖ как с цитогенетических, так и с эпигенетических позиций.
Цель исследования: Оценить вклад хромосомных нарушений и аномалий метилирования ДНК в развитие геномной нестабильности при раке молочной железы.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ спектра несбалансированных хромосомных аберраций в тканях молочной железы с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, а также в регионарных лимфатических узлах с метастазами.
-
Определить связь наиболее частых хромосомных аберраций с клиническими параметрами у больных раком молочных желез.
-
Выявить спектр дифференциально метилированных последовательностей ДНКв тканях молочной железы с доброкачественными и злокачественными новообразованиями и регионарных лимфатических узлах с метастазами.
-
Изучить статус метилирования генов ретинобластомного пути регуляции клеточного цикла в тканях молочной железы в зависимости от уровня хромосомных аберраций.
Научная новизна исследования: В ходе настоящего исследования впервые определены особенности цитогенетических и эпигенетических нарушений, обуславливающих развитие геномной нестабильности при раке молочной железы. Выявлено, что существенное увеличение частоты хромосомных аберраций происходит после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные. Показана протективная роль делеции хромосомного субсегмента 16ql2.1 для больных раком молочной железы. С помощью широкогеномного анализа эпигенетического статуса 807 онкогенов и опухолесупрессорных генов впервые установлено, что ткани молочной железы с доброкачественными про-лиферативными процессами и метастазы в регионарные лимфатические узлы являются сходными по профилю метилирования ДНК, что указывает на обособление клона клеток с метастатическим фенотипом на ранних этапах злокачественной трансформации.
Практическая значимость: Полученные результаты расширяют представления о цитогенетических и эпигенетических механизмах прогрессии рака молочной железы. Комбинированное использование методов широкогеномного анализа профиля метилирования ДНК и молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных аберраций может быть применено при комплексных моле-кулярно-генетических исследованиях злокачественных новообразований других локализаций. На основании результатов анализа связи цитогенетических и эпигенетических аномалий в опухолевой ткани с патогенетически значимыми характеристиками злокачественного процесса могут быть разработаны дополнительные критерии оценки клинического течения рака молочной железы.
Положения, выносимые на защиту:
-
Установление специфичного профиля метилирования ДНК в клетках, ответственных за возникновение лимфогенных метастазов при раке молочной железы, происходит на начальных этапах процесса малигнизации.
-
Усиление хромосомной нестабильности при развитии рака молочной железы происходит после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные.
-
Деления хромосомного субсегмента 16ql2.1 в неопластических клетках у больных раком молочной железы ассоциирована с опухолями меньших размеров.
Апробация работы: Основные результаты диссертационного исследования были представлены на Российской научно-практической конференции с международным участием «Современные аспекты диагностики и лечения рака молочной железы» (Томск, 2008), IV и VI региональных конференциях молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009 и 2011), Международном симпозиуме в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития и сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии» (Томск, 2009), научно-практической кон-
ференции с международным участием «Актуальные проблемы медицинской генетики на крайнем севере» (Якутск, 2009),VI и VII Российских конференциях по фундаментальной онкологии «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2010 и 2011), Европейской конференции по генетике человека (European Human Genetics Conference) (Амстердам, Нидерланды, 2011), IX научной конференции памяти профессора С.А. Назаренко «Генетика человека и патология: Актуальные проблемы современной цитогенетики» (Томск, 2011), межлабораторном научном семинаре Учреждения РАМН НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2011).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 в журналах перечня ВАК.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Данные проиллюстрированы 21 таблицей, 17 рисунками и 1 приложением. Библиографический указатель включает 173 источника, из них 23 работы отечественных авторов.
Мутационная концепция канцерогенеза
Практически все опухоли являются гетерогенными по своему клеточному составу, и каждая опухоль кроме неопластических клеток содержит также и эндотелиальные клетки, фибробласты и клетки иммунной системы. Поскольку фибробласты и эндотелиальные клетки стимулируют развитие опухоли посредством молекул межклеточной адгезии, можно предположить, что межклеточные ростовые сигналы также играют значительную роль в реализации полноценного каскада передачи ростовых сигналов (Olumi et al., 1999; Hanahan, Weinberg, 2000).
Следующим признаком злокачественных новообразований является снижение чувствительности к ингибиторам факторов роста. В нормальных тканях антипролиферативные сигналы работают для поддержания клеточного покоя и тканевого гомеостаза. К таким сигналам относятся растворимые ингибиторы роста (цитокины), иммобилизованные ингибиторы, встроенные во внеклеточный матрикс (ВКМ) и находящиеся на поверхности соседних клеток. Действие этих факторов, ингибирующих рост, в основном, реализуется через активацию ингибиторов циклин-зависимых киназ, что приводит к остановке клеточного цикла в G1- и G2- сверочных точках (checkpoint). К субъединицам ингибирующим циклин-зависимые киназы относятся два семейства белков - INK4 и CIP/KIP белки. К первой группе относятся белки pl4ARF, CDKN2B, CDKN2A, pl8INK4C и pl9INK4D, которые специфично взаимодействуют с CDK4 и CDK6, препятствуя их связыванию с циклинами (Pei et al., 2009; Taneja et al. 2010). Представителями второго семейства CIP/KIP являются белки P21CIP1, P27KIP1 и P57KIP2, которые взаимодействуют как с комплексами циклин-Cdk, так и с их отдельными компонентами, тем самым реализуя остановку клеточного цикла (Brakensiek et al., 2005; Lan-dis et al., 2006; Trimis et al., 2008). Следует заметить, что экспрессия практически всех вышеперечисленных белков может регулироваться посредством эпигенетических механизмов, таких как метилирование и деметилирование промоторных регионов генов. В случае нарушения экспрессии ингибиторов циклин-зависимых киназ или увеличения экспрессии компонентов комплекса циклин-CDK, клетка получает способность игнорировать как эндогенные, так и экзогенные факторы, ингибирующие рост.
Одним из проявлений снижения чувствительности к ингибиторам факторов роста при злокачественных неоплазиях является отсутствие контактного торможения пролиферации клеток в культурах in vitro. Нормальные клетки размножаются до тех пор, пока не возникнет плотный монослой и не установятся межклеточные контакты. В отличие от этого, раковые клетки при возникновении межклеточных контактов не останавливают свою пролиферацию, а продолжают делиться, при этом наползают друг на друга и образуют очаги многослойного роста (Копнин, 2002).
К характерным признакам злокачественных новообразований относится также и неограниченный пролиферативный потенциал. В нормальных клетках существует механизм, ограничивающий число делений, в основе которого лежит прогрессивное укорочение теломер по мере деления клеток. Их укорочение происходит из-за неполного синтеза ДНК, который возникает за счет невозможности образования крайнего РНК-праймера при репликации 3 -конца ДНК (Zheng et al., 2011; Donate, Blasco, 2011). Согласно «теломерной гипотезе», прогрессивное укорочение теломер приводит к тому, что сенсорные системы начинают распознавать их как аномальные структуры ДНК и индуцировать остановку клеточного цикла, подобно тому, как это происходит при ДНК-повреждающих воздействиях. При нарушениях в сигнальных системах, детерминирующих остановку клеточного цикла (снижение чувствительности к ингибиторам факторов роста), клетки с укороченными теломера ми будут продолжать делиться, пока теломеры практически не исчезнут и пе рестанут выполнять свои функции, которые заключаются в предотвращении рекомбинации и слипания хромосом (Копнин, 2002).
При злокачественных неоплазиях укорочения теломер не происходит за счет активации специфического фермента теломеразы, которая может достраивать теломерные повторы (рис. 2). Теломераза является рибонуклеиновым ферментом, т.е. состоит из нескольких субъединиц, включающих РНК-компонент и белок теломеразной обратной транскриптазы (TERT — Telomer-ase Reverse Transcriptase). РНК-компонент фермента содержит матрицу, комплементарную одному или нескольким повторам G-богатой цепи теломерной ДНК (Greider, Blackburn, 1985; Blasco et al., 1995).
Механизм действия теломеразы заключается в повторном копировании матрицы, включающей этапы элонгации, когда дезоксирибонуклеотиды последовательно добавляются к З -концу G-богатой цепи теломеры, и транслокации фермента на конец новообразованной цепи. В результате образуется длинный 3 -конец, по которому затем достраивается комплементарная цепь (Kouniavsky, Zeiger, 2010). Что касается опухолей без активации теломеразы, то в них, скорее всего, задействован ALT механизм (Alternative Lengthening of Telomeres) поддержания длины теломер, который основан на гомологичной рекомбинации ДНК теломер (Копнин, 2002).
Для интенсивного роста опухоли, клеткам, помимо увеличения пролиферации, необходимо уменьшить их гибель, которая в основном осуществляется за счет апоптоза. Апоптоз является программируемым механизмом, приводящим к гибели клетки, и характеризующийся такими цитологическими признаками, как распад ядра, уплотнение хроматина, фрагментация ДНК и уплотнение мембраны без выхода содержимого клетки в окружающую среду.
Сравнительная геномная гибридизация
Предполагается, что гипометилирование специфических хромосомных доменов может индуцировать хромосомную нестабильность через ряд автокаталитических событий, обусловленных изменениями дозы генов в каждом цикле репликации анеуплоидных клеток. Так, в нормальных соматических клетках перицентромерные гетерохроматиновые районы хромосом 1 и 16 существенно метилированы. При аденокарциномах груди, опухолях эпителия яичников и спорадических опухолях Вильмса эти регионы гипометилирова-ны и нестабильны (Narayan et al., 1998, Qu et al., 1999). Хромосомные аномалии, ассоциированные с гипометилированием сателлитной ДНК указанных хромосомных регионов, представлены изохромосомами, несбалансированными прицентромерными транслокациями и делециями целых хромосомных плеч. Аналогичные аберрации регистрируются и в нормальных митоген-стимулированных клетках, обработанных 5-азацитидином или 5-аза-2-деоксицитидином - ингибиторами DNMT1 - фермента, ответственного за поддержание статуса метилирования ДНК при репликации (Karpf, Jones, 2002).
Глобальное гипометилирование ДНК приводит также к деметилирова-нию и, следовательно, к транскрипционной активации мобильных элементов, таких как LINE, SINE, IAP, Sat2 и Alu (Pogribny, Beland, 2009). Например, транскрипционная активация мобильного элемента LINE приводит к его интеграции в различные участки генома, в том числе и в важнейшие регулятор-ные гены. Подобные интеграции LINE в гены АРС и c-MYC отмечены при спорадических опухолях молочной железы (Morse et al., 1988) и толстой кишки (Miki et al., 1992). Инсерции другого мобильного генетического элемента - Alu характерны для клеток половой линии. Интегрированные Alu-элементы обнаруживаются в генах BRCA1 и BRCA2 в семьях с наследственными формами рака молочной железы (Miki et al., 1996) и яичников (Monta-gna et al., 1999), а также в гене MLH1 в семьях с наследственной предрасположенностью к колоректальному раку (Nystromlahty et al., 1995). Cho с соавторами выявили корреляцию гипометилирования 8а12-элементов с раком молочной железы по сравнению с прилегающим нормальным эпителием (р=0,0001). Также было установлено, что уровень метилирования Sat2 в периферической крови больных РМЖ значимо ниже по сравнению с уровнем метилирования в контрольной группе (р=0,01). Данный факт позволяет рассматривать уровень метилирования 8а12-элементов в качестве возможного прогностического маркера для малоинвазивной диагностики рака молочной железы (Cho et al., 2010).
Активация онкогенов является одним из наиболее значимых последствий гипометилирования генома при возникновении злокачественных новообразований. Так, например, гипометилирование промоторов c-MYC и c-JUN, ассоциированное с экспрессией данных онкогенов на уровне мРНК и белковых продуктов, показано при опухолях печени и раке толстого кишечника; экспрессия плейотропного фактора клеточной пролиферации pS2, обусловленная гипометилированием генного промотора, продемонстрирована при аденокарциноме груди; гипометилирование промотора гена НОХ11 отмечается при Т-лифобластоидной лейкемии (Ehrlich et al., 2002).
Влияние гипометилирования генома на уровень экспрессионной активности при развитии рака молочной железы также не вызывает сомнений. Так, Sharma с соавторами показали, что уровень экспрессионной активности гена MDR1 коррелирует со статусом метилирования его промоторного региона (OR=38,l; 95% СІ: 10,0-145,0; р=0,0001). Среди гипометилированных образцов увеличение экспрессии наблюдалось в 93% случаев, в то время как в группе гиперметилированных образцов наблюдалось снижение экспрессионной активности в 75 % случаев (Sharma et al., 2010). Аналогичные результаты были получены и при анализе зависимости экспрессионной активности гена IL-10 с уровнем метилирования его промоторного региона (р=0,012) (Son et al., 2010).
Глобальное гипометилирование генома является характерным признаком злокачественных новообразований молочной железы, к тому же показана связь гипометилирования с клиническими параметрами больных. Так, в работе, направленной на выявление гипометилирования в тканях молочной железы, было показано значимое снижение уровня метилирования в образцах из области злокачественных опухолей (п=117), по сравнению с доброкачественными новообразованиями (п=18, р=0,0002), с нормальным эпителием молочной железы (п=5, р=0,0001) и с гистологически верифицированной нормальной паренхимой, окружающей новообразования (п=135, р=0,0001). Также была выявлена сильная ассоциация уровня гипометилирования со степенью (р=0,0009), размерами (р=0,0026) и гистологической картиной рака (р=0,0097), что свидетельствует о функциональной значимости глобального гипометилирования генома в процессах злокачественной трансформации клеток (Soares et al., 1999).
Еще одним интересным фактом является влияние гипометилирования на резистентность опухолевых клеток к химиотерапии. Sharma с соавт. провели исследования статуса метилирования гена MDR1 у 100 пациентов с РМЖ. Этот ген экспрессирует белок P-gp, который является кальций-зависимым трансмембранным насосом, обеспечивающим эвакуацию из цитоплазмы мно гих химиотерапевтических препаратов, тем самым уменьшая их внутриклеточную концентрацию. Было показано, что гипометилирование гена MDR1 наблюдается не только в самой опухоли (47%), но и во внеклеточной ДНК в периферической крови (44%). При анализе выживаемости по методу Капла-на-Мейера было выявлено, что выживаемость больных с гипометилированием промоторного региона гена MDR1 значительно ниже (медиана общей выживаемости - 18 мес.) по сравнению с таковыми, у которых данный ген находился в метилированном состоянии (медиану общей выживаемости невозможно определить в силу низкой летальности) (OR=8,4; 95% СІ: 1,0-65,5; р=0,04). Аналогичные результаты были получены и при анализе общей выживаемости больных с гипометилированием и нормальным эпигенетическим статусом гена MDR1 в периферической крови (OR=9,3; 95% СІ: 1,2-72,3; р=0,03) (Sharma et al., 2009).
Наряду с глобальным деметилированием генома для злокачественных клеток характерно и противоположное изменение статуса метилирования ДНК, а именно - гиперметилирование промоторных областей генов. Прогрессивно растущий список генов, аберрантное метилирование которых отмечено при различных типах злокачественных новообразований, включает в себя гены, ответственные за реализацию фундаментальных процессов клеточной физиологии, таких как клеточный цикл, апоптоз, дифференцировка, репарация ДНК, передача внутри- и межклеточных сигналов, регуляция факторов транскрипции.
Спектр и частота хромосомных аномалий тканей молочной железы и регионарных лимфатических узлов
Во всех 20 образцах опухолевой ткани были обнаружены множественные хромосомные аберрации: число аномалий варьировало от 1 до 27, в среднем на один случай приходилось 14,1 различных хромосомных нарушений. Число амплификации в некоторых образцах достигало 26, а число делеций -14. Среднее число амплификации составило 8,9, а делеций - 5,2 на образец. Среднее число хромосомных сегментов, затронутых хромосомными перестройками, составило 48,7 на образец ткани (табл. 3).
Наиболее частыми являлись амплификации в сегментах 1р31 (33 %), lq23 (38 %), Iq24-q25 (47 %), lq31 (66 %), lq32 (71 %), lq41 (57 %), lq42 (47 %), Iq43-q44 (38 %), 3q24 (33 %), 8q22 (33 %), 8q23 (38 %), 10q22 (33 %) и делеций в сегментах 9ql3 (33 %), 9q21 (38 %), 16ql2.1 (47 %), 16ql2.2-ql3 (57 %), 16q21 (38 %) (рис. 13).
В целом спектр хромосомных аберраций в образцах опухолей молочной железы, выявленный в настоящем исследовании, соответствует уже описанным в литературе и является характерным для опухолей данной локализации (Larramendy et al., 2000; Baudis, 2007; Heim, Mitelman, 2009). Так, наиболее частые амплификации, выявленные в нашей работе (Iq31-q41), являются и наиболее частыми в Базе данных «Progenetix», в которой обобщены результаты CGH-анализа различных опухолей. В том числе на данный момент Г 1 к
Идиограмма HR-CGH образца с РМЖ (пациент №6). В данном случае имеются амплификации сегментов lq22 qter, 7p21-pter, 8ql2-qter, 14q22-q23, делеции сегментов 1р12-р22, 1р36.2-р36.3, 2pll.2-pl6, 4pl5.1-pl5.3, 8pll.2-p23, 9pl2-pl3, 9ql3-q21, llpll.2-pl2, llq23-qter, 12pll.2-pl2,12ql2-ql3,16q, 18pll.2-p 11.3 и трисомия хромосомы 13. (по состоянию на ноябрь 2011 г.) там представлены результаты исследований 2127 образцов с РМЖ. В проведенном нами исследовании делеции чаще всего выявлялись на длинном плече хромосомы 16, что также соответствует данным литературы (Roylance et al. 2006; Xu et al., 2008; Green et al., 2009; Natrajan et al. 2009; Heim, Mitelman, 2009). Некоторые авторы указывают на делецию 16q, как на одну из основных аберраций, которые ответственны за малигнизацию доброкачественных новообразований и в совокупности с другими аномалиями кариотипа, такими как амплификации различных регионов длинного плеча хромосомы 1, приводят к развитию различных типов РМЖ (Roylance et al., 2006; Xu et al., 2008). Однако необходимо учитывать, что амплификация lq и делеция 16q часто являются результатом одной хромосомной аномалии - несбалансированной транслокации целых плеч между хромосомами 1 и 16, которую нельзя идентифицировать с помощью сравнительной геномной гибридизации.
Образцы с РМЖ не отличались от образцов с нормальным эпителием по числу амплификации (р=0,50), делеций (р=0,88) и хромосомных перестроек (р=0,63), также значимые отличия между данными группами не были найдены и при сравнении числа сегментов с амплификациями (р=0,29), делециями (р=0,32) и хромосомными перестройками (р=0,15). Статистически значимые отличия не были выявлены и при анализе соотношения амплификации и делеций между исследованными группами (р=0,37). Между группами образцов со злокачественными новообразованиями и доброкачественными пролифера-тивными процессами по числу амплификации (р=0,29) и делеций (р=0,19) и хромосомных аномалий (р=0,63), статистически значимых отличий также не наблюдалось. Аналогичная картина наблюдалась и при сравнении данных групп по числу сегментов, затронутых амплификациями (р=0,21), делециями (р=0,20) и хромосомными перестройками в целом (р=0,57). При сравнении соотношения амплификации и делеций между образцами с доброкачественными и злокачественными новообразованиями было выявлено статистически значимое отличие (р=0,0001), которое было обусловлено тем, что в группе образцов с доброкачественными пролиферативными процессами наблюдалось значительное превалирование делеций, а в группе образцов с РМЖ -превалирование амплификации.
Ожидаемым результатом при проведенных сравнительных анализах являлось увеличение числа хромосомных перестроек, соответственно и числа сегментов с хромосомными аномалиями от гистологически нормального эпителия к злокачественным новообразованиями, однако полученные данные не соответствуют этому. Данный факт может быть обусловлен контаминацией образцов из групп с нормальным эпителием и доброкачественными пролиферативными процессами клетками со злокачественным фенотипом.
В группе образцов с метастазами в РЛУ также обнаружены множественные хромосомные аберрации: число аберраций варьировало от 6 до 20, в среднем на один случай приходилось 12,2 различных хромосомных нарушений. Число амплификации в некоторых образцах достигало 13, а число делеций - 7. Среднее число амплификации составило 10, а делеций - 2,2 на образец. Среднее число хромосомных сегментов, затронутых хромосомными перестройками, составило 33,8 на образец (табл. 3). Хромосомные аномалии наблюдались во всех исследованных образцах. Наиболее частыми являлись амплификации в сегментах 2р22, Зр14-р21, 3q22-q26.1, 4q28, 5q21, 6q22, 8q21-q24.1, 13q21-q22, 20ql3.1-ql3.3, и делеций в сегментах Ilql2-ql3 (рис. 14).
При сравнительном анализе группы образцов с метастазами в РЛУ с группой образцов с гистологически нормальным эпителием молочной железы по числу амплификации (р=0,06), делеций (р=0,25) и хромосомных перестроек (р=0,53), статистически значимых отличий не было выявлено. Также значимые отличия между данными группами не были найдены при сравнении числа сегментов с амплификациями (р=0,32), делециями (р=0,53) и хромосомными перестройками (р=0,32). В результате аналогичного сравнительного анализа группы образцов с метастазами в РЛУ с группой образцов с 1 Ь
Идиограмма HR-CGH образца с метастазом в РЛУ (пациент № 18). В данном случае имеются амплификации сегментов 2р16, 2р22, 2q21-q23, 2q34-q37, 4q22-q24, 4q28-q32, 5q21-q33, 7q32-q33, 8q22-q24, 10q22-q24, 13q21-q22, 18ql2-q21, делеции сегментов 22qll.2-ql2. доброкачественными пролиферативными процессами по числу амплификации было выявлено статистически значимое увеличение числа амплификации в группе образцов с метастазами в РЛУ (р=0,04). По числу делеций (р=0,06) и всех хромосомных перестроек (р=0,32) не наблюдалось значимых отличий. По числу сегментов с амплификациями (р=0,06) и делециями (р=0,08), как и по числу всех сегментов, которые были затронуты хромосомными перестройками (р=0,46), значимые отличия не были найдены. При сравнении группы образцов с метастазами в РЛУ и группы образцов с РМЖ по числу амплификации, делеций, всех хромосомных перестроек, а также по числу сегментов, затронутых амплификациями, делециями и хромосомными перестройками статистически значимых отличий также не было выявлено.
В результате анализа соотношений числа амплификации и делеций между группой образцов с метастазами в РЛУ и группой образцов с нормальным эпителием наблюдалось статистически значимое отличие (р=0,01), обуслов 1, ленное значительным превалированием амплификации в группе образцов с метастазами в РЛУ. При аналогичном сравнении группы образцов с метастазами в РЛУ и группы образцов с доброкачественными пролиферативными процессами было выявлено статистически значимое отличие (р 0,0001), поскольку в образцах с метастазами в РЛУ наблюдалось значительное превалирование амплификации, а в образцах с доброкачественными пролиферативными процессами - значительное превалирование делеций. Как в группе с метастазами, так и в группе с РМЖ наблюдалось превалирование амплификации над делециями, однако в образцах с метастазами смещение в сторону амплификации было значительнее, чем при РМЖ, что обусловило статистически значимое отличие в результате проведенного сравнительного анализа (р=0,002). В результате проведенного сравнительного анализа исследованных групп по числу хромосомных перестроек и по числу сегментов, затронутых хромосомными аномалиями, статистически значимое отличие наблюдалось только при сравнении числа амплификации между группами образцов с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами в РЛУ.
Межгрупповой анализ дифференциального метилирования генов в тканях молочной железы и регионарных лимфатических узлов с метастазами
В то же время, полученные данные находятся в хорошем соответствии с гипотезой параллельного метастазирования (Schmidt-Kittler et al., 2003), объясняющей возможность обособления клонов клеток с метастатическим потенциалом на начальных этапах злокачественной трансформации. Эта гипотеза уже нашла подтверждение на цитогенетическом (Klein, Holzel, 2006) и экспрессионном (Ramaswamy et al., 2003) уровне. В проведенном нами исследовании впервые получено эпигенетическое свидетельство в пользу гипотезы параллельного метастазирования. Интересно, что отличие выделенного кластера тканей от всей остальной группы обследованных образцов было обусловлено дифференциальным метилированием всего одной группы генов, продукты которых являются рецепторами, связанными с G-белками, и существенными для миграционной активности клеток.
Обобщая результаты цитогенетического и эпигенетического разделов проведенного исследования, логично предположить, что на начальных стадиях канцерогенеза клетки-предшественники опухоли обладают фенотипом доброкачественного новообразования, однако уже имеют некоторое селективное преимущество перед окружающими нормальными тканями, что приводит к постепенному накоплению данного клона в органе. Это подтверждается экспериментальными данными. Так, например, показано существование вокруг первичной опухоли так называемых «полей канцеризации», являющихся гистологически нормальными тканями молочной железы, клетки которых имеют генетические нарушения, ассоциированные с раком (Braakhuis et al., 2003). В определенный момент времени (tj) возникает субклон, у которого за счет какого-либо генетического и/или эпигенетического нарушения происходит инициация геномной нестабильности, что приводит к ускорению процессов малигнизации (рис. 16).
Скорее всего, обособление клона клеток, ответственных за развитие метастазов в регионарные лимфатические узлы (t2), происходит спустя относи-140 тельно небольшой промежуток времени после возникновения клона злокачественных клеток. В пользу непродолжительности данного отрезка времени (tj -12) свидетельствует тот факт, что рисунок метилирования ДНК тканей из группы с лимфогенными метастазами схож с рисунком метилирования в группе образцов с доброкачественными изменениями, т.е. обособление клона клеток с метастатическим потенциалом происходит до кардинального изменения рисунка метилирования в первичном опухолевом узле вследствие различных аберрантных эпигенетических модификаций.
Поскольку в результате анализа статуса метилирования ДНК с помощью микрочипа было выявлено, что в образцах с доброкачественными пролифера-тивными процессами наблюдается дифференциальное метилирование генов, регулирующих клеточный цикл, а в результате цитогенетического анализа показано, что хромосомные аберрации начинают накапливаться после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные, нами был проведен более глубокий анализ ряда генов регулирующих клеточный цикл {RB1, pl4ARF и CDKN2B). Аберрантное метилирование онкосупрессорных генов pl4ARFu CDKN2B было зарегистрировано с частотой 70% и 13,5%, соответственно, тогда как метилирования RB1 отмечено не было. В большинстве случаев в исследованных образцах выявлялись и метилированные и немети-лированные последовательности локусов. Наличие только метилированных аллелей было зарегистрировано в renepl4ARFB 13,5% случаев. По клинической характеристике группы с аномалиями метилирования не отличались от групп без эпимутаций.
Отсутствие метилирования гена RB1 и достаточно высокая частота аномального метилирования TGKOB pl4ARFn CDKN2B соответствует результатам аналогичных исследований статуса метилирования этих генов при эпи-дермальном раке и лимфоме (Linda et al., 2006; Murao et al., 2006). He исключено, что такая комбинация эпигенотипов исследованных генов, с одной стороны, может объясняться более высокой частотой метилирования генов ингибиторов циклин-зависимых киназ, по сравнению с геном RB1. С другой сто 141 роны, выявленная особенность может указывать на существование особых эпигенетических механизмов дисрегуляции клеточного цикла и поддержания стабильности генома при канцерогенезе, которые запускаются уже на уровне ингибиторов циклин-зависимых киназ.
В ходе проведенного исследования нами была изучена связь частоты хромосомных аберраций со статусом метилирования генов ретинобластомно-го пути регуляции клеточного цикла. Однако в результате проведенного исследования статистически значимых результатов не было выявлено. Отсутствие статистически значимых различий по частоте хромосомных перестроек между образцами тканей с аберрантным метилированием генов pl4ARF и CDKN2B и образцами тканей без аномалий метилирования данных генов, может быть обусловлено тем, что гиперметилирование исследованных генов не оказывает существенного влияния на число хромосомных аберраций.
В результате проведенных цитогенетических исследований было показано, что в образцах с РМЖ и метастазами в РЛУ число общих хромосомных перестроек значимо выше, чем в образцах с доброкачественными и злокачественными новообразованиями. Это может указывать на то, что вероятность возникновения хромосомных аномалий увеличивается после перехода доброкачественных новообразований в злокачественные. Напротив, в результате анализа статуса метилирования было выявлено, что группы образцов с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами в регионарные лимфатические узлы являются относительно близкими с точки зрения рисунка метилирования ДНК. Это свидетельствует о том, что выявленные в данных группах аномалии метилирования образуются до разделения клеточных клонов с доброкачественными пролиферативными процессами и метастазами.
![Полиморфизмы [B]#32#1-адренорецептора и их роль в нарушении функции легких при атопической бронхиальной астме](/i/i/4354/407107.png "Полиморфизмы [B]#32#1-адренорецептора и их роль в нарушении функции легких при атопической бронхиальной астме Васьковский Николай Валерьевич")