Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Обзор литературы 13
2.1 Строение и регенерация костной ткани 15
2.2 Развитие клеточных технологий для регенерации костной ткани 20
2.3 Характеристика и остеогенныи потенциал культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани 27
2.4 Матрицы-носители для тканеинженерных конструкций 35
2.5 Использование обогащенной тромбоцитами плазмы крови в тканевой инженерии 42
Глава 3. Материалы и методы 47
3.1 Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека 47
3.2 Иммунофенотипический анализ мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани 48
3.3 Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека 49
3.4. Получение и дифференцировка культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани крыс 54
3.5 Получение полилактидных матриц-носителей 54
3.6 Заселение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на носителях 56
3.7 Оценка цитотоксичности материала носителей и пролиферативной активности клеток на носителях с помощью МТТ-теста 56
3.8 Визуализация клеток с использованием мембранной метки РКН26 57
3.9 Изучение морфологии клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии 58
3.10 Получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови 59
3.11 Изготовление тканеинженерных конструкций 59
3.12 Оценка жизнеспособности клеток внутри тканеинженерной конструкции in vitro 60
3.13 Трансплантация тканеинженерных конструкций крысам 60
3.14 Подготовка и обработка гистологических срезов 63
3.15 Статистический анализ данных 63
Глава 4. Результаты 65
4.1. Характеристика культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани 65
4.2 Выбор оптимальных условий остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека 78
4.3 Оценка цитосовместимости матриц-носителей 87
4.4 Характеристика тканеинженерной конструкции 95
4.5 Морфологическое исследование области введения тканеинженерной конструкции в толщу мышечной ткани бедра крыс 98
Глава 5. Обсуждение 110
5.1 Выбор культуры остеогенных клеток 110
5.2 Обоснование выбора матриц-носителей 116
5.3 Получение тканеинженерных конструкций 120
5.4 Трансплантация тканеинженерных конструкций в бедренную мышцу крыс 124
Заключение 132
Выводы 136
Список литературы 138
- Развитие клеточных технологий для регенерации костной ткани
- Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека
- Оценка цитосовместимости матриц-носителей
- Трансплантация тканеинженерных конструкций в бедренную мышцу крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы
Лечение травматических повреждений и дегенеративных заболеваний кости, таких как неконсолидирующиеся переломы, обширные костные дефекты, возникающие в результате травмы или резекции ткани в случае онкологических заболеваний, пороки развития, является актуальной медико-биологической проблемой. Потребность в костных графтах (graft (англ.) – трансплантат) в мире составляет более 800 000 в год, наращиванию костной ткани у дентальных хирургов подвергаются 27 млн европейцев в год. Более 44 млн американцев и столько же жителей Европы подвержены остеопорозу [Иванов, 2009]. Традиционно для восполнения дефицита костной ткани при данных заболеваниях используют следующие методы - пересадку собственных тканей пациента (аутопластику), трансплантацию аллогенной костной ткани и введение различных остеопластических материалов на основе ксеногенного костного матрикса, синтетических кальций-фосфатных соединений, полимерных композиций и различных гибридных материалов [Chatterjea, 2010]. Аутотрансплантация на сегодняшний день является «золотым стандартом» в лечении костных дефектов, обеспечивая высокий уровень остеоинтеграции, отсутствие иммунологических реакций, немедленное закрытие дефекта. Однако при аутопластике возникают проблемы, связанные с ограниченной возможностью использования собственной костной ткани для пересадки и резорбцией трансплантатов. Забор материала из донорской зоны – это дополнительное хирургическое вмешательство, сопровождающееся болевыми ощущениями, потерей крови, развитием гематом, риском инфицирования и развития других осложнений [Laurie, 1984; Arrington, 1996; Frohlich, 2008]. Использование аллогенных трансплантатов связано с риском отторжения графта и инфицирования пациента. Для снижения иммуногенности аллогенных графтов проводят их децеллюляризацию, что существенно уменьшает остеоиндуктивность, а, следовательно, и эффективность их применения в сравнении с аутографтами. Остеопластические материалы в большинстве случаев выполняют остеокондуктивную функцию, поддерживая распространение костного регенерата, но не обладают достаточными остеоиндуцирующими свойствами [Finkemeier, 2002; Fellah, 2008; Bueno, 2009].
Одним из альтернативных подходов для регенерации костной ткани является
трансплантация в область костного дефекта собственных остеопрогениторных клеток пациента
после предварительного процессинга, позволяющего масштабировать количество первоначально
полученных клеток и индуцировать их остеогенные потенции. Для адресной доставки, стабильной
локализации в реципиентном ложе, обеспечения высокой выживаемости при трансплантации
клетки иммобилизуют на матрицах-носителях из биосовместимых материалов. Важным фактором
успешной регенерации является создание оптимального микроокружения для клеток при
трансплантации, что достигается введением в состав конструкции ростовых и
дифференцировочных факторов, направленных в первую очередь на стимуляцию неоангиогенеза,
а также привлечение и дифференцировку резидентных мезенхимальных предшественников. Таким образом, применение тканеинженерных эквиваленты костной ткани, с одной стороны, обеспечивает органотипическую регенерацию за счет участия остеопрогениторных клеток и действия биологически активных факторов, а с другой стороны, они могут быть получены практически любого требуемого объема из небольшого количества первичного материала, т.е. их использование лишено недостатков аутопластики. Это позволяет считать тканевую инженерию наиболее перспективным направлением при лечении травматических и дегенеративных заболеваний костной ткани в настоящее время [Деев, 2007; Howard, 2008; Murphy, 2013].
Цель исследования
Целью исследования является разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, трехмерных пористых полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта.
Задачи исследования
-
Получить культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в соответствии с требованиями, предъявляемыми к медицинским технологиям;
-
Провести иммунофенотипический анализ и оценку дифференцировочного потенциала культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека;
-
Оптимизировать время и условия дифференцировки культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на основании динамики экспресии остеогенных маркеров и минерализации матрикса;
-
Изучить цитотоксический эффект трехмерных пористых полилактидных матриц-носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, в отношении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека;
-
Оценить адгезионные свойства и пролиферативную активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на поверхности полилактидных носителей;
-
Разработать методику сборки тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани и полилактидных носителей с помощью тромбоцитарного геля;
-
Изучить формирование костной ткани на модели гетеротопического остеогенеза при внутримышечной трансплантации крысам тканеинженерной конструкции на основе
мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля.
Научная новизна исследования
Впервые получена тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, дифференцированных в остеогенном направлении, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта.
Впервые показано, что матрицы-носители на основе полиэфиров молочной кислоты,
полученные методом поверхностно-селективного лазерного спекания, не оказывают
цитотоксического действия на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, обеспечивают прикрепление и пролиферацию клеток данных культур.
Установлено, что на 14 сутки культивирования 1,25-дигидроксивитамин D3 оказывает выраженное остеогенное действие на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека в отличие от дексаметазона, повышая минерализацию внеклеточного матрикса и уровень экспрессии генов белков остеокальцина и остеопонтина.
Впервые с помощью ПЦР в режиме реального времени показано, что при действии 1,25-дигидроксивитамина D3 на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, максимальная экспрессия белков коллагена I типа, остеопонтина и остеокальцина, формирующих органический костный матрикс, выявляется на 7-14 сутки, а на 14-21 сутки наблюдается увеличение уровня экспрессии генов щелочной фосфатазы и костного морфогенетического белка BMP-2.
Разработан протокол сборки тканеинженерной конструкции на основе дифференцированных в остеогенном направлении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека и полилактидных носителей путем полимеризации в тромбоцитарном геле. Установлено, что концентрация клеток 4 млн на 1см3 конструкции обеспечивает высокую выживаемость клеток при in vitro культивировании и формирование костной ткани в условиях in vivo.
Впервые показано, что внутримышечная трансплантация крысам тканеинженерной конструкции, содержащей дифференцированные в остеогенном направлении аутологичные ММСК жировой ткани, трехмерные пористые полилактидные носители и тромбоцитарный гель, приводит к гетеротопическому формированию грубоволокнистой костной ткани на 30 сутки.
Научно-практическая значимость исследования
Способ получения культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека соответствует требованиям, предъявляемым к медицинским технологиям. Получено разрешение на применение новой медицинской технологии «Способ получения и
хранения культуры мультипотентных стромальных клеток жировой ткани человека», авторы Гольдштейн Д.В., Ржанинова А.А., Бухарова Т.Б., Макаров А.В. (Разрешение на применение ФС № 2010/287 от 05.08.2010).
Апробация работы
Основные результаты работы изложены на Международной конференции «Новые
информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», (Ялта-Гурзуф,
2009); World Conference on Regenerative Medicine (Leipzig, 2009), Всероссийской научной школе-
конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические
исследования» (Москва, 2009), Всероссийских школах-конференциях «Стволовые клетки и
регенеративная медицина (Москва, 2010, 2011), Всероссийской научной конференции
«Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011), Национальном конгрессе по
регенеративной медицине (Москва, 2013), Межлабораторном научном семинаре ФГБУ «МГНЦ»
РАМН (2013).
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, из них 4 статьи опубликованы в рецензируемых научных изданиях, входящих в Перечень ВАК МОН РФ.
Внедрение результатов работы
Результаты исследования внедрены в лекционные курсы для студентов и ординаторов в ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России и ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН.
Объем и структура работы
Развитие клеточных технологий для регенерации костной ткани
Первыми шагами в развитии клеточных технологий для костной хирургии стали работы, проводимые в 20-30 годы XX века, в которых было предложено в качестве источника остеогенных клеток использовать надкостницу и эмбриональные закладки костей [Studitsky 1933, Fell 1928, 1931]. Исследователями были получены пролиферирующие клеточные популяции, способные к дифференцировке преимущественно по хондрогенному пути. Следующим подходом стало получение остеогенных клеток, самостоятельно выселяющихся из костного эксплантата. Но возможность получения большого количества детерминированных клеточных элементов появилась только с разработкой метода ферментативной диссоциации костной ткани (Sudo, 1983). Этот подход оказался практически неприменим к человеку, поскольку получение костных фрагментов, как правило, является клинически неоправданным хирургическим вмешательством.
В конце 60-х, начале 70-х годов XX века в работах А. Я. Фриденштейна и его коллег впервые было показано, что в костном мозге помимо гемопоэтических имеются стромальные клетки, способные к длительному самоподдержанию в культуре, которые при культивировании образуют дискретные колонии фибробластоподобных клеток, названные «костномозговыми колониеобразующими единицами фибробластов» (КОЕ-Ф). Анализ дифференцировочных потенций штаммов стромальных клеток костного мозга показал, что при обратной трансплантации в организм потомки одной клетки-предшественницы способны формировать костную, хрящевую, фиброзную или жировую ткани [Фриденштейн А.Я. 1968; Friedenstein A.J 1970 и 1980]. Было показано, что во взрослом организме стромальные клетки-предшественницы находятся вне пролиферативного пула и вступают в S-период через 24-72 часа после эксплантации. Высокие адгезионные свойства стромальных клеток - их способность прикрепляться к поверхности культурального пластика позволила выделять сравнительно чистые популяции этих клеток [Friedenstein A.J., 1974; 1978]. На основании полученных данных о пролиферативном и дифференцировочном потенциале стромальных клеток-предшественниц Фриденштейном было сформулировано понятие о стволовых стромальных клетках (ССК) кроветворной и лимфоидной тканей, что явилось развитием представлении о существовании таких клеток, изложенных в работах А.А. Максимова в начале XX века [Friedenstein A.J., 1989].
Позднее для обозначения выделенных Фриденштейном клеток были введены такие термины, как «мезенхимальные стволовые клетки» [Caplan, 1990], «мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки» [Horwitz, 2005] и др. В данной работе используется термин «мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки» (ММСК), который представляется наиболее корректным, т.к. отражает локализацию клеток и их функциональную активность.
Морфологически ММСК представляют собой клеточную популяцию, преимущественно фибробластоподобных клеток, имеющих веретеновидную форму. ММСК, обладающие высоким пролиферативным потенциалом, являются резервом, мобилизуемым для физиологической и репаративной регенерации ткани. Свойства и функциональная активность ММСК определяется характеристиками и составом микроокружения.
Наиболее хорошо изучены ММСК из красного костного мозга. Число ММСК составляет 0.001-0.01% всех ядросодержащих клеток взрослого костного мозга человека, изолированных путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла [Dazzi, 2006]. Количество ММСК снижается с возрастом. Наибольшая концентрация отмечается в раннем постнатальном периоде, а к 80 годам она падает вдвое [Fibbe, 2003]. Принцип выделения ММСК основан на их способности к селективной адгезии к поверхности культурального пластика. Как уже говорилось, при культивировании ММСК способны давать колонии фибробластоподобных клеток (КОЕ-Ф). Число колоний зависит от вида животного - донора костного мозга, а также от условий культивирования. ММСК из костного мозга человека формируют колонии непосредственно на пластике, тогда как клетки крыс для эффективной адгезии нуждаются в клетках-кормильцах [Prockop, 2003]. По составу культура ММСК костного мозга гетерогенна. Формируемые колонии представлены, по меньшей мере, двумя клеточными типами: мелкими веретеновидными клетками, способными к активной пролиферации и крупными распластанными клетками, делящимися сравнительно медленно.
При оптимальных условиях культивирования ММСК могут поддерживаться в культуре в течение как минимум 20-30 удвоений популяции, сохраняя свои дифференцировочные возможности. А в некоторых работах показано, что способность к росту и делению сохраняется у ММСК в течение более чем 50 периодов удвоения [Ramalho-Santos, 2002]. Эти данные характеризуют высокий пролиферативный потенциал ММСК. Анализ профиля клеточного цикла ММСК показал, что преобладающая часть клеток находятся в GO/Gl-фазе цикла и только около 10% - в фазах S, G2 и М [Cognet, 1999]. На основании анализа генома было установлено, что ММСК костного мозга сохраняют нормальный кариотип и теломеразную активность при культивировании до 12 пассажа [Pittenger, 1999], а позднее проявляют признаки старения и апоптоза [Cognet, 1999].
Популяции ММСК с такими же биологическими характеристиками, как у ММСК костного мозга, были изолированы из других органов, включая периферическую кровь [Kuznetsov, 2001], пуповинную кровь [Rosada, 2003], синовиальную мембрану [De Bari, 2001], жировую ткань [Zuk, 2001; 2002; Gronthos, 2001], легкое [in t Anker, 2003], фетальную печень [Campagnoli, 2001] и пульпу молочных зубов [Miura, 2003; Otaki, 2007]. До настоящего времени не разработано единого протокола выделения ММСК. Поскольку культуры ММСК гетерогенны, в зависимости от выбора источника и способа обработки первичного материала, а также условий селекции, могут быть получены культуры с преобладанием тех или иных популяций клеток. Потому каждый разрабатываемый протокол выделения нуждается в подтверждении принадлежности полученных культур к ММСК.
Для однозначного определения характеристик клеточных культур ММСК из разных источников, в 2006 году Международным обществом по клеточной терапии (The International Society for Cellular Therapy, ISCT) были сформулированы основные критерии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [Dominici, 2006]. Во-первых, ММСК должны прикрепляться к пластику при культивировании в стандартных условиях. Во-вторых, не менее 95% популяции ММСК должны экспрессировать поверхностные маркеры CD 105, CD73 и CD90, что определяется методом проточной цитофлуориметрии. Кроме того, эти клетки должны быть негативны (не более 5%) по маркерам, CD34, CD45, CD14 или CD1 lb, CD79a или CD 19 и HLA класса П. В-третьих, эти клетки должны обладать способностью к дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях в условиях in vitro.
Индукция хондрогенной дифференцировки осуществляется путем культивирования осажденных центрифугированием клеточных скоплений в присутствии TGF-p\ Другими факторами, играющими важную роль в хондрогенезе, являются белки семейства BMP и CDMP (cartilage-derived morphogenetic proteins). Ключевая роль в регуляции этих процессов отведена белкам группы Wnt. TGF-Р и другие цитокины запускают сигнальный путь путем активации МАР-киназ (митоген-активированных белков), таких как ERK-1, р38, РКС и Jun [Sekiya, 2002]. Активация приводит к индукции экспрессии специфических транскрипционных факторов: Sox9, Msx2 [Semba, 2000], которые запускают экспрессию хондроген-специфических генов, таких как аггрекан и коллаген II типа. Признаками дифференцировки являются морфологические изменения и положительное гистохимическое окрашивание на протеогликаны и коллаген II типа [Pittenger, 1999].
Адипогенез может быть индуцирован обработкой ММСК средой, содержащей дексаметазон, изобутилметилксантин и индометацин [Dennis, 2002]. Дифференцировка выявляется с помощью окрашивания липидных включений красителем масляным красным и оценки экспрессии специфических белков, таких как PPARy2 (пероксисомный активирующий пролиферацию рецептор), LPL (липопротеиновая липаза) и аР2 (белок, связывающий жирные кислоты) [Muguruma, 2006]. Ингибирование адипогенеза осуществляется индукцией WntlOb, GATA-2 and GATA-3 [Ross, 2000; Tong, 2000].
Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека
Остеогенная дифференцировка
Для дифференцировки использовали культуры ММСК на 3-4 пассаже в состоянии 80% конфлуентного монослоя. Клетки инкубировали в остеогенной среде: DMEM, содержащей 2 тМ L-глутамина («ПанЭко») с 10% ЭТС, 100 мкг/мл амикацина, 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты («Sigma»), 10 мМ Р-глицерофосфата натрия («Sigma») и 10 нМ 1а,25-дигидроксивитамина D3 (кальцитриола, «Roshe») или 100 нМ дексаметазона («KRKA»). Замену среды на свежую производили каждые 3 суток. Эффективность дифференцировки оценивали по наличию минеральных отложений во внеклеточном матриксе путем окрашивания монослоя клеток ализариновым красным и уровню экспрессии генов маркеров остеогенной дифференцировки с помощью ПЦР в режиме реального времени.
Окрашивание ализариновым красным
Клетки промывали ФСБ (рН 7,2-7,4; «ПанЭко»), фиксировали 15 мин. 70% этанолом («Ферейн») и обрабатывали 40 мМ водным раствором ализаринового красного S (рН 4,1, «ПанЭко») в течение 5 мин. Избыток красителя отмывали дистиллированной водой.
Количественная оценка связавшегося ализаринового красного
Кристаллы ализаринового красного, образовавшиеся при связывании с минеральными отложениями, растворяли уксусной кислотой и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 405 нм с помощью микропланшетного фотометра "Anthos Reader 2020" («Anthos Labtec»). Вычитали фоновое значение, измеренное при 620 нм. Для построения калибровочной кривой использовали растворы с известной концентрацией ализаринового красного.
Анализ изменения транскрипции генов
Выделение РНК
Выделение РНК проводили с помощью набора "RNeasy Mini kit" ("Qiagen", США) в соответствии с рекомендациями производителя. Перед выделением клетки, достигшие 80% монослоя, снимали с культуральной посуды путем инкубации в растворе Версена с добавлением 0,25% трипсина. Затем клеточную суспензию переносили в пробирки по 1x106 клеток и центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин, супернатант удаляли. К осадку добавляли по 600 мкл лизирующего буфера (buffer RLT-Plus "Qiagen"), лизис проводили пипетированием в течение 5 мин. Затем лизат клеток очищали от геномной ДНК на колонках gDNA Eliminator spin ("Qiagen") центрифугированием при 10 тыс. об/мин 15 секунд. Элюат наносили на колонку для сорбции РНК RNeasy spin ("Qiagen"). Очистку РНК проводили согласно рекомендациям производителя. Конечную элюцию препарата РНК с колонки проводили в 30 мкл воды, свободной от ДНК-аз и РНК-аз ("Qiagen").
Синтез кДНК по матрице РНК
Синтез цепей кДНК проводили согласно протоколу фирмы «Fermentas» с использованием олиго-сГГ-праймеров. Праймеры отжигали на матрице мРНК кратким инкубированием препарата при 65С (5 мин), затем охлаждали при 4 С 1 мин. В препарат вносили компоненты реакционного буфера для обратной транскрипции и фермент - обратную транскриптазу М-MuLV Reverse Transcriptase ("Fermentas") в количестве 40 ед акт на 20 мкл пробы. Реакцию проводили при 37 С в течение часа и затем останавливали прогреванием до 65С (5 мин). Готовый препарат разводили водой, свободной от ДНК-аз и РНК-аз ("Qiagen"), и хранили при температуре -20 С.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени
Для количественной оценки изменения экспрессии генов полученный препарат суммарной кДНК анализировали с помощью ПЦР в режиме реального времени с геноспецифичными праймерами (Таблица 2). Для постановки реакции использовали стандартный реакционный буфер для ПНР с интеркалирующим красителем Eva Green ("Синтол"). В пробу вносили по 1 мкл праймеров (10 пикомоль/мкл) и реакционный буфер, содержащий фермент. Затем добавляли анализируемый препарат кДНК так, чтобы количество внесенной матрицы по объему не превысило 1/10 объема реакционной смеси. Объем реакционной смеси доводили водой до 25 мкл. Для контроля чистоты реакции ставили реакцию ПЦР, в которую не вносили матрицу для амплификации. Для контроля чистоты препарата кДНК от геномной ДНК дополнительно ставили реакцию, в которую в качестве матрицы для амплификации вносили препарат РНК, не подвергавшийся реакции обратной транскрипции. Реакционную смесь собирали согласно стандартному протоколу фирмы "Синтол". Схема реакции: первичная денатурация при 95С 5 мин; денатурация при 95С 20 сек; отжиг праймеров при 56-62 С 20 сек; элонгация при 70 С, 20 сек. (40 циклов); плавление продуктов амплификации и анализ кривых плавления: 40 сек при 70-95 С.
Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации двух генов неизменного уровня экспрессии (house keeping genes, гены домашнего хозяйства) GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа) и Act-b (Р-актин). Относительное количество мРНК в образце рассчитывали с помощью АС(Т) метода с использованием формулы для построения графиков 2А -(С(і)гена - C(t) генов домашнего хозяйства), где С(Т) - величина пороговых циклов генов в образце.
Хондрогенная дифференцировка
Для дифференцировки клетки снимали с поверхности культурального пластика, центрифугировали в полипропиленовых пробирках по 200 тыс. клеток на пробирку. К осадку добавляли хондрогенную среду: DMEM с 10% ЭТС, 100 мкг/мл амикацина, 10 нг/мл TGF-b («Prospec»), 100 пМ дексаметазона, 25 мМ глюкозы, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и инкубировали 21 сутки в пластиковой посуде со сниженной адгезией. В контроле клетки инкубировали в ростовой среде.
Эффективность хондрогенной дифференцировки оценивали по наличию в клеточных скоплениях кислых гликозаминогликанов внеклеточного матрикса, выявляемых по окрашиванию альциановым синим. Клетки фиксировали 4% раствором параформальдегида на ФСБ (рН 6,9), промывали ФСБ и инкубировали в 1% растворе альцианового синего на 0,1 N соляной кислоте (рН=1,0) в течение 1 часа. Для удаления избытка красителя промывали 0,1 N соляной кислотой. Эффективность дифференцировки оценивали по наличию окрашенных в голубой цвет скоплений клеток.
Адипогенная дифференцировка
Для индукции адипогенной дифференцировки культуры, достигшие 50-70% конфлюентности монослоя, инкубировали в среде DMEM/F12 с 10% ЭТС, 0,5 мкМ гидрокортизона («Фармак»), 100 нМ дексаметазона и 100 мкг/мл амикацина 21 сутки.
Окрашивание липидных включений проводили с помощью Oil Red О ("BioOptica"). Для этого клетки фиксировали 4% нейтральным формалином, промывали ФСБ и инкубировали с красителем в течение 10 мин. После отмывания несвязавшегося красителя клетки докрашивали гематоксилином ("BioOptica").
Оценка цитосовместимости матриц-носителей
Для исследования были сформированы матрицы в виде дисков диаметром 12 мм и высотой 5 мм, с трехмерной ячеистой структурой. (Рис. 16). Размер ячеек составлял 0,6 х 0,6 мм [Бухарова 2013].
Анализ результатов МТТ-теста, в ходе которого клетки инкубировали в присутствии образцов в течение 1 и 7 суток, показал, что образцы не обладали токсическим действием в отношении ММСК (рис. 17). Об этом свидетельствует отсутствие статистически значимых различий между опытными группами и контролем (в отсутствие образца) [Бухарова 2013].
Клетки, прикрепленные к поверхностям матриц-носителей, не могут быть различимы при микроскопии в проходящем свете (носители непрозрачные). Потому для наблюдения за клетками использовали флуоресцентную микроскопию - перед заселением на носители клетки метили флюоресцентным мембранным красителем РКН26, что позволяло выявлять адгезированные на носителях клетки. Мы наблюдали, что уже на первые сутки клетки прикрепляются к поверхности носителя и распластываются по ней (рис. 18 А). Адгезия клеток к поверхности носителя наблюдается как минимум в течение 3 недель (рис. 18 Б-Г). Клетки по поверхности гранул распределены достаточно равномерно. Хорошо различимо, что клетки крепятся к гранулам на поверхности матриц, а также внутри макропор. Кроме того, по микрофотографиям можно судить об увеличении плотности расположения клеток на поверхности носителя с увеличением срока культивирования [Бухарова 2013].
Более детально изучить клеточную адгезию и морфологию прикрепленных клеток позволяет электронная микроскопия. На микрофотографиях СЭМ, сделанных на третьи сутки культивирования, клетки выглядят распластанными по поверхности матрицы, плотно прилегающими к ней (рис. 19).
Количественную оценку пролиферации ММСК ЖТ на полилактидных носителях проводили с помощью МТТ-теста, который позволяет оценить количество живых клеток в пробе. Метод был выбран в связи с трудностями при снятии клеток с матриц-носителей со сложной пространственной организацией, которые не позволяют провести прямой подсчет количества клеток, адгезированных на носителе. Эксперимент продемонстрировал статистически значимое увеличение количества клеток, адгезированных на поверхности носителя, при культивировании в течение 1, 4 и 7 суток (рис. 20), что свидетельствует о пролиферативной активности ММСК ЖТ на исследуемых носителях. Наглядное подтверждение результатов МТТ-теста получено с помощью сканирующей электронной микроскопии на тех же сроках (рис. 21) [Бухарова 2013].
СЭМ позволяет наблюдать динамику изменения количества клеток на носителях при разных сроках культивирования. В первые сутки после заселения на поверхности полилактидных гранул наблюдались, главным образом, одиночные клетки вытянутой формы (рис. 21 А). На третьи сутки культивирования обнаруживались скопления близко расположенных друг к другу клеток, преимущественно веретеновидной формы, многие из которых крепились своими отростками к соседним гранулам (рис. 21 Б). Отдельные клетки имели округлую форму, что могло свидетельствовать о вхождении клеток в митоз или начальных стадиях распластывания после деления. Уже к 7 суткам клетки на поверхности носителей образовывали плотные многослойные структуры (рис. 21 В).
В результате проведенных исследований было показано, что матрицы-носители из полилактида, полученных методом ПСЛС, характеризуются высокой цитосовместимостью - они не оказывают токсического действия на клетки культуры ММСК ЖТ, обеспечивают адгезию исследуемых клеток на своей поверхности в течение 3 недель, а также поддерживают пролиферативную активность культур.
Трансплантация тканеинженерных конструкций в бедренную мышцу крыс
Экспериментальные исследования по изучению эффективности, безопасности клеточных трансплантатов и механизмов неоостеогенеза невозможны без адекватного выбора экспериментальной модели. На сегодняшний день большинство исследователей склоняются к моделированию процессов образования костной ткани de novo в моделях гетеротопического остеогенеза в подкожно-жировой клетчатке или мышцах бедра лабораторных животных. Опыт такого рода моделирования показал наглядность и общность изучаемых процессов у мелких и крупных грызунов, что позволяет использовать крыс CD (Sprague-Dawley) в качестве требуемой модели [Тгошп, 2001; Lee, 2003; Lin, 2006; Ye, 2012]. Мы выбрали местом трансплантации именно мышечную ткань, поскольку при подкожном введении процессам гистогенеза мешает распространение соединительной и жировой ткани. Во многих научных работах тестирование действия стволовых клеток человека проводилось на иммунодефицитных животных [Zanetti, 2013]. Но в таких моделях, лишенных непосредственных участников иммунного ответа -Ти В-лимфоцитов, не может быть оценен локальный иммунный ответ на введение клеточного трансплантата, и в связи с этим результаты таких экспериментов могут быть неадекватны. Так, в исследовании Liu было показано, что трансплантация аутологичных ММСК из костного мозга на НА/TCP носителе мышам дикого типа не приводит к образованию костной ткани, а у иммунодефицитных животных она формируется [Liu, 2011]. Данные многих исследований указывают, что перекрестные действия имплантированных донорских ММСК и иммунных клеток реципиента играют ключевую роль в определении успешности ММСК-опосредованной костной регенерации. Потому в настоящей работе исследование неоостеогенеза и оценку эффективности ТИК проводили на модели гетеротопического остеогенеза при трансплантации конструкции в область бедра крысам линии CD. ТИК получали в соответствии с разработанным в ходе исследования протоколом на основе аутологичных ММСК ЖТ и PRP.
При морфологическом исследовании на 10 сутки после трансплантации принципиальных различий между опытной группой (введение ТИК) и контрольной группой (введение носителя с тромбоцитарным гелем) не наблюдалось (рис. 23, 24). В основе регенерата сеть из волокон фибрина и коллагена, инфильтрированная небольшим количеством лейкоцитов, макрофагов и фибробластов. Область имплантации/трансплантации в обеих группах пронизана капиллярами по всему объему, включая центральные зоны, что свидетельствует об эффективной васкуляризации конструкции, обусловленной использованием PRP.
На 30 сутки в контрольной группе область имплантации представлена преимущественно рыхлой волокнистой соединительной тканью, характеризующейся высокой плотностью расположения клеток (рис. 25).
Вокруг гранул полил актида расположено большое количество гигантских клеток инородных тел, активно участвующих в резорбции материала.
На том же сроке в опытной группе при трансплантации тканеинженернои конструкции между гранулами материала наблюдается формирование грубоволокнистой костной ткани, в которой выявляются остеоны. Остеоциты с гиперхромным ядром, погруженные в лакуны, замурованы в плотном структурированном межклеточном матриксе, расположенном вокруг капилляров. Местами выявляются остеобласты с крупным рыхлым ядром и ядрышками (рис. 26). Разнонаправленное расположение волокон обусловлено отсутствием факторов осевой нагрузки. Формирование костной ткани наблюдается главным образом в центральной части трансплантата, а по переферии выявляется фиброзная ткань. Новообразованная костная ткань равномерно занимает все пространстви между гранулами материала. Отсутствуют признаки формирования хрящевой ткани. По визуальной оценке в опытной группе число и размер гигантских клеток инородных тел значительно ниже, чем в контрольной.
Таким образом, результаты экспериментального исследования свидетельствуют о том, что при внутримышечном введении ТИК на 30 сутки в области трансплантации наблюдаются очаги формирования ретикулофиброзной костной ткани, в которой выявляются остеоны т.е. наблюдается гетеротопический неоостеогенез - образование костной ткани de novo. Поскольку в выбранной экспериментальной модели трансплантат является единственным источником остеогенеза, можно заключить, что новообразованная костная ткань сформировалась за счет трансплантированных клеток. Также на это указывает локализация костного матрикса в центральной части регенерата. На срезах не обнаружено хондробластов, потому можно утверждать, что остеогенез идет по пути интрамембранного окостенения. Отсутствие промежуточного формирования хрящевой ткани является следствием высокой васкуляризации трансплантата, обусловленной использованием тромбоцитарного геля.
Следует заметить, что помимо остеогенного эффекта, трансплантированные клетки оказали также иммуномодулирующее действие, значительно снизив проявления воспалительной реакции по сравнению с контрольной группой.
Возможность формирования остеоида при гетеротопической трансплантации ТИК на основе ММСК ЖТ человека была впервые продемонстрирована в исследовании Hicok [Hicok, 2004]. Через 6 недель после подкожного введения клеток, адгезированных на поверхности гранул ГА-ТКФ, иммунодефицитным мышам внутри трансплантата обнаруживались очаги новообразованной костной ткани, граничащие с материалом носителя и фрагменты фиброзной ткани. Направление формирования остеоида свидетельствует о том, что регенерация начинается за счет клеток, находящихся на поверхности гранул материала, и развивается, стремясь занять свободный объем пор, где, в свою очередь, уже сформировалась рыхлая соединительная ткань. Примененный в нашем исследовании подход, основанный на свободном распределении клеток внутри фибринового сгустка, позволяет трансплантированным клеткам задействовать весь свободный объем внутри трансплантата для формирования новой костной ткани. В результате, в нашем исследовании мы наблюдали, что костное вещество в большинстве случаев равномерно заполняет все пространство между гранулами материала уже на 30 сутки. Следует заключить, что выбранный нами подход, предполагающий равномерное распределение клеток в объеме трансплантата, с большей эффективностью приводит к формированию костной ткани, чем заселение клетками поверхностей материала.
Недостаточно убедительные результаты часто можно увидеть при исследованиях ТИК на моделях костных дефектов. В работе Conejero при трансплантации аутологичных крысиных ММСК ЖТ на полилактидном носителе крысам Lewis в область дефекта небной кости на рисунках гистологических срезов хорошо видно, что фронт регенерации распространялся со стороны материнской кости в сторону центра регенерата [Conejero, 2006]. При этом в срединной области трансплантата даже через 12 недель остеогенных островков не наблюдается. Такая картина означает, что регенерация осуществляется не за счет трансплантированных клеток, а главным образом при участии остеопрогениторных клеток, мигрирующих из надкостницы самой поврежденной кости. При этом действие трансплантата выражается в индуцирующем и, возможно, хемоаттрактантном действии на клетки надкостницы за счет выделяемых остеогенных факторов. Кроме того, неэффективное формирование костной ткани может быть связано с недостаточно оптимально подобранным носителем, размер пор которого составляет 100 мкм - что недостаточно для формирования остенов, диаметр которых в норме составляет 150-350 мкм. В нашем исследовании формирование костной ткани наблюдалось главным образом в центральной части трансплантата, что указывает на участие самих трансплантированных клеток в формировании костной ткани. Выбранная нами модель гетереотопического остеогенеза позволяет исключить участие в регенерации пула остеогенных клеток надкостницы и оценить роль ММСК, содержащихся в трансплантате.
