Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1. Строение ядшшка 10
1.1. Структура нуклеолонемного ядрышка 10
1.2. Структура ядрышка клеток различной степени дифференцировки и с разным функциональным состоянием 13
1.3. Структура ядрышек в условиях искусственно подавленного синтеза рибосомальных генов 15
2. Фибриллярный центр , 17
2.1. К вопросу о терминологии фибриллярного центра 17
2.2. Строение и локализация фибриллярного центра.. 19
2.3. Взаимоотношение фибриллярного центра и ядрышкового организатора 20
2.4. Функция фибриллярного центра 24
3. Ядрышковые вакуоли 26
3.1. Строение ядрышкоЕых вакуолей 26
3.2. Гипотезы, объясняющие происхождение ядрышковых вакуолей 28
Глава II. Материалы и методы исследования
1. Характеристика экспериментального материала 32
2. Электронномикроскопическая фиксация и гистологическая обработка клеток куриных зародышей, новорожденных цыплят и взрослой курицы 33
3. Электронномикроскопическая фиксация клеток взрослой крысы и крысиных зародышей 35
4. Обработка клеток культуры ШЭБ актиноміцином Д 35
5. Электронномикроскопическая обработка клеток инфильтратиЕНЫх форм карциномы молочной железы человека 36
6. Заливка, полимеризация и окраска фиксированного материала 36
7. Количественная оценка кольцевидных ядрышек 38
Глава III. Результаты собственных исследований
1. Кольцевидные ядрышки и фибриллярные центры Е клетках различных тканей куриного зародыша и крысы 40
2. Ультраструктура ядрышковых вакуолей, вакуоли-зированных и кольцевидных ядрышек в гепатоци-тах и нуклеолояемно-кольцеЕидных - в нефроцитах куриных зародышей 44
3. Изменение количества кольцевидных ядрышек в гепатоцитах и нефроцитах куриных зародышей на различных сроках инкубации 52
4. Изменение количества кольцевидных ядрышек в гепатоцитах куриного зародыша при действии низких температур 54
5. Ультраструктура ядрышек гепатоцитов зародышей крысы 56
6. Фибриллярные центры, ядрышковые вакуоли и кольцевидные ядрышки Е клетках культуры СПЭВ
после действия актиномицина Д 57
7. Ультраструктура ядрышек опухолевых клеток 61
Глава ІV. Обсуждение результатов
I. Фибриллярные центры 66
1.1. Морфология фибриллярных центров в разных типах клеток 66
1.2. Взаимоотношение фибриллярных центров с около- и внутрйядрышкоЕым хроматином и с митотическими хромосомами 69
1.3. Механизм возникновения кольцевидных ядрышек... 72
Ядрышковые вакуоли 75
Выводы 82
Иллюстрации 84
Список литературы
- Структура ядрышка клеток различной степени дифференцировки и с разным функциональным состоянием
- Взаимоотношение фибриллярного центра и ядрышкового организатора
- Электронномикроскопическая фиксация клеток взрослой крысы и крысиных зародышей
- Ультраструктура ядрышковых вакуолей, вакуоли-зированных и кольцевидных ядрышек в гепатоци-тах и нуклеолояемно-кольцеЕидных - в нефроцитах куриных зародышей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение ультраструктуры ядра и его отдельных компонентов является одним из интересных и актуальных вопросов современной биологии. Благодаря успехам, достигнутым в молекулярной биологии, биохимии и ультраструктурной морфологии, стало возможным детальное изучение структуры ядрышка и выяснение функции этого компонента интерфазного ядра. Будучи важным компонентом клеточного ядра, ядрышко, являясь продуктом ядрышкового организатора - специализированного участка хромосомы, активно функционирующего в интерфазе, - участвует в синтезе рибосомаль-ной РНК и рибосом. Следовательно, если ядрышко рассматривать как видимое выражение активности соответствующих генов, то функциональные изменения белкового синтеза, зависящие от активности ядрышка, должны морфологически отражаться на его состоянии.
Отсюда понятен интерес к ядрышку представителей многих специальностей, занимающихся изучением дифференцировки и функционированием клеток, эмбриональным развитием, исследованием природы злокачественного роста и других заболевании.
Внедрение в широкую практику новых методов исследования, таких как электронномикроскопическая ауторадиография, гистохимия, гибридизация in situ и др., позволило выявить тонкую ультраструктурную организацию ядрышка.
Выяснилось, что составляющими компонентами ядрышка являются плотные гранулы и тонкие фибриллы, содержащие РШ материал. На фибриллярной части ядрышка происходит синтез предшественников РНК [68,100,109,110,181], а гранулярная часть представляет собой пул частиц предшественников рибосом. В состав ядрышка входит и ДНИ материал. Для активно работающих клеток характерна так называемая нуклеолонемная структура ядрышка. Б зависимости от функционально-го состояния клетки морфология ядрышка меняется - нуклеолонемное ядрышко переходит в кольцевидную форму.
Электронномикроскопически в ядрышке описано два типа светлых зон: фибриллярные центры и ядрышковые вакуоли. Фибриллярные центры - это большей частью округлые зоны ядрышка, характеризующиеся более низкой электронной плотностью по сравнению с фибриллами и гранулами и гомогенной волокнистой структурой. По периферии фибриллярного центра располагается плотный фибриллярный компонент, образуя так называемые "шапочки" [61,62,63,64,65,66,68]. Фибриллярный центр обнаруживает морфологическую связь с околоядрышковьш хроматином, митотическими хромосомами и синаптонемальными комплексами [67,68,108,109,ПО]. Хорошо видимые фибриллярные центры характерны как для ядрышек с низким уровнем синтеза рНЖ [169] , так и для активно пролиферирущих клеток [4,5,59,62,63 65,68]. Это кажущееся противоречие Жессан [64] объясняет тем, что морфология ядрышка зависит не только от интенсивности синтеза рРНК, но и от скорости транспорта предшественников рибосом в цитоплазму.
Ядрышковые вакуоли представляют собой полости, заполненные нуклеоплазмой и окруженные гранулярным компонентом - морфологические признаки, по которым они отличаются от фибриллярных центров. Вакуоли встречаются как в животных, так и в растительных клетках. Размеры и число вакуолей в ядрышке изменчивы. Увеличение размеров вакуолей сопровождается редукцией их числа. Если при этом такая крупная-вакуоль занимает центральное место в ядрышке, ее обозначают как центральную вакуоль, или как "центральную полость" [б8,140] . Одной из причин возникновения кольцевидности ядрышка связывают с появлением центральной вакуоли.
Благодаря стремительному развитию исследований и накоплению новых данных о ядрышках постепенно раскрываются закономерности, лежащие в основе биологических процессов нормального и патологического роста и развития, однако многие вопросы требуют разрешения. На сегодняшний день не ясно, какова биологическая роль коль-цевидности, как связана кольцевидность с функциональным состоянием ядрышка (в случае ядрышек с центральной вакуолью), так как не известно, какое из состояний ядрышка является начальной точкой цикла, - идет ли процесс от нуклеолонемной к кольцевидной форме или, наоборот, - от кольца к яуклеолонеме.
Цель и задачи исследования. Настоящее исследование имело целью установить на разных моделях ультраструктуру кольцевидных ядрышек, фибриллярных центров и ядрышковых вакуолей.
В соответствии с этой целью нужно было решить следующие задачи:
1. Исследовать кольцевидные ядрышки, фибриллярные центры и яд-рышковые вакуоли в зародышевых тканях (ткани куриных и крысиных зародышей).
2. Исследовать изменение количества кольцевидных ядрышек в гепатоцйтах и нефроцитах куриных зародышей в норме, на различных сроках инкубации, и при действии низких температур.
3. Изучить состояние кольцевидных ядрышек, фибриллярных центров и ядрышковых вакуолей в клетках культуры СПЭВ после действия актиномищша Д.
4. Исследовать ультраструктуру ядрышка опухолевых клеток молочной железы человека.
Научная новизна. В настоящей работе впервые установлено, что фибриллярный центр - участок ддрыткового организатора - является обязательным структурным компонентом интерфазного ядра, размер, локализация и число которых варьирует в разных типах клеток.
Активные нуклеолонемные ядрышки низкодифференцированных клеток и опухолевые клетки молочной железы человека I степени злокачественности характеризуются наличием светлого фибриллярного компонента (СФК), идентичного фибриллярным центрам, а высокодифферен-цированные и опухолевые клетки П и Ш степени злокачественности содергісат крупные центрально расположенные фибриллярные центры и вакуоли. Толщина волокон фибриллярных центров равна 7-Ю нм.
Установлены две группы кольцевидных ядрышек - с центрально расположенными фибриллярными центрами и яцрышковыми вакуолями.
Установлено, что наиболее часто вакуолизированные кольцевидные ядрышки с центральной вакуолью встречаются в эмбриональных тканях, причем для рада тканей характерно наличие промежуточных форм ваку-олазированных ядрышек. Типичные кольцевидные ядрышки с фибриллярным центром и центральной вакуолью являются обязательным компонентом опухолевых клеток молочной железы человека П и Ш степени злокачественности.
Научно-практическая ценность. Результаты настоящего исследования имеют теоретическое и практическое значение, так как новые сведения об ультраструктуре ядрышка важны для понимания закономерностей, лежащих в основе биологических процессов нормального и патологического роста и развития, а также для понимания механизмов функционирования многоклеточного организма.
Практическое значение вытекает из обнаруженного нами факта отсутствия крупных центрально лежащих фибриллярных центров и кольцевидных вакуолизированных ядрышек в опухолевых клетках I степени злокачественности и их присутствия при П и! степенях злокачественности. То есть таким образом мы имеем дополнительный диагностический критерий оценки степени злокачественности опухолевых клеток молочной железы человека.
Внедрение в практику. Результаты диссертации с 1983 года используются при чтении специального курса "Диф$еренцировка клеток" на биологическом факультете Тбилисского государственного университета. Результаты диссертационной работы учитываются при диагностике раковых опухолей молочной железы человека.
Апробация диссертации. Результаты исследования были доложены и обсуждены на межуниверситетской конференции молодых ученых "Современные проблемы биологии" (Тбилиси, 1978 г.); на УІ Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1978 г.), на научном коллоквиуме отдела биологии развития Института экспериментальной морфологии АН ГССР; на заседании кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии Тбилисского государственного университета (январь 1983 года).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, обсуждения, выводов, иллюстраций и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 83 страницах машинописного текста, иллюстрированы 9 схематическими рисунками, 52 фотографиями. Библиография содержит 192 источника, из которых 17 отечественных и 175 зарубежных.
Структура ядрышка клеток различной степени дифференцировки и с разным функциональным состоянием
Общая морфология ядрышка в зависимости от синтеза рРНК меняется [l6,27,I69]. Вполне естественно, что для понимания функциональных и структурных особенностей ядрышка необходимо его изучение при различных режимах работы: при высокой и низкой активности, как в естественных, так и экспериментальных условиях. При различной физиологической нагрузке и при патологических состояниях организация ядрышка очень разнообразна и является морфологическим выражением степени его активности.
Как уже было отмечено, описанная довольно однообразная нуклео-лонемная структурная организация и химическая композиция ядрышка характерна для клеток с высоким уровнем синтеза белков, следовательно, с высоким уровнем образования аппаратов белкового синтеза - рибосом.
Хорошей моделью для изучения структурно-физиологического изменения ядрышек являются клетки кишечника эпителия мыши. В эпителии тонкой кишки различают две зоны, зону крипт камбиального характера, где происходит интенсивное размножение клеток, и зону ворсинок, где клетки эпителия не делятся и не синтезируют ДНК. Обновление всего эпителия тонкой кишки, в том числе и ворсинок, происходит за счет размножения клеток крипт, непрерывно перемещающихся к верхушке ворсинок [l39] .
С помощью ауторадиографии было установлено, что синтез ДНК происходит Е области крипт, а в клетках ворсинок включение Н3-ури-дина практически не обнаруживается [2]. По данным электронной микроскопии, в криптах нуклеолонемная часть выражена хорошо, богатые гранулами фибриллярные зоны невелики и не выделены в обособленные участки. В ворсинках, напротив, ядрышки не обладают нуклеолонемной организацией. Они представляют плотные образования, состоящие из тесно расположенных тонких (4-8 нм) фибрилл, Число одиночных гранул, расположенных по периферии незначительно, вплоть до их полного отсутствия [з,1Э] .
Переход ядрышек от нормального типа к сжатому фибриллярному, с потерей гранулярного компонента, характерен и для созревающих ООЦЙТОБ мышей [33,34] , и для дифференцирующихся клеток корешков растений и для ряда других объектов[іб,169,I70J.
Обратная картина наблюдается при становлении функции ядрышка. У эмбрионов xenopus laevis до начала гаструляции, в отсутствие синтеза рРНК, в ядрах видны лишь мелкие РНК, содержащие "про-ядрышки", состоящие из тонких фибрилл [74,80,901. С началом гас трулягши, т.е. с момента синтеза рРНК появляются истинные ядрышки 25,2б]. В фибриллярных проядрышках появляются гранулы, и ядрышки приобретают типичное строение [73,74,80].
В клетках гомозиготных мутантов х laevis , у которых отсутствует синтез рРНК, не встречается настоящих ядрышек; в ядрах видны РНК содержащие тельца, структурно состоящие только из фибрилл [84] . У мутантов фибриллярные проядрышки не превращаются в истинные ядрышки.
Сходную с х laevis фибриллярную структуру имеют первичные ядрышки у развивающихся эмбрионов тритона, морского ежа, циклопов, ядрышки микроспор кукурузы [і,88,89,90,107,I80]. Подобная динамика структурных изменений ядрышка характерна не только для развивающихся клеток, но и для клеток взрослого организма с низкой синтетической активностью. Так, в клетках эпителия радужины тритона ядрышки представляют собой агрегаты тонкофибриллярных компонентов с небольшим числом гранул. В период регенерации эпителия ядрышки приобретают гранулярное строение [88] .
Использование различных факторов, таких как кратковременное повышение температуры, воздействие химических веществ, в том числе ингибиторов, облучение ультрафиолетовыми лучами, подавляющими синтетическую активность, вызывают функциональное изменение структуры ядрышка.
Обработка клеток культуры ткана кратковременным повышением температуры до +40С вызывает резкие, но обратимые структурные изменения. Ядрышки теряют гранулы и превращаются в плотные фибриллярные образования. При этом не нарушается молекулярная структура
РНК ядрышек (45 s и 28 s ядрышковая РНК). Исчезновение гранул при повышении температуры связывают с изменением конфигурации гранулярной формы РНП и переходом ее в фибриллярную форму [l5?J .
Различные повреждения вызывают в ядрышке сегрегацию его компонентов, морфологически выражающихся в резком сжатии ядрышек и обособлении фибриллярной и гранулярной зоны с последующей редукцией гранул РНП. Различают макро- и микросегрегацию [l77] . Микросегрегация характеризуется присутствием плотных компактных зон, состоящих из фибрилл или гранул РШ. Фибриллярные зоны располагаются по периферии ядрышек, образуя участки, называемые "шапочками". При микросегрегации мелкие обособленные и сжатые фибриллярные зоны разбросаны внутри гранулярной части ядрышка. При всех видах сегрегации ядрышки уплотняются, уменьшается объем гранулярного компонента. Подобную монотонную структурную перестройку ядрышка вызывают самые различные факторы: физические, химические, органические, такие как: высокие и низкие температуры, лучевое повреждение, воздействие ультрафиолетом [28,116,118,148,157,158, 183,191]. Химические - различные антибиотики и антиметаболиты, такие как актиномицин Д, пуромицин, кордицепин (см, обзор: Ченцов, Поляков [іб]). Органические: а) канцерогены (лазиокарпин, 3-метил, 4-диметиламиноазобензол, дйметилнитрозамин, таниновая кислота и др.). [і4б] ; б) вирусные, бактериальные и грибковые инфекции [81, 171].
Взаимоотношение фибриллярного центра и ядрышкового организатора
Как уже отмечалось, ряд антибиотиков, используемых с целью искусственного подавления синтеза, вызывают своеобразную перестройку яцрышка, известную под названием сегрегации ядрышковых компонентов. Уне в ранних работах было отмечено, что наряду с разобщением фибрилл и гранул, актиномицан индуцирует появление фибриллярных центров [44,58,153,158,182,192]. Подобным эффектом обладают и другие антибиотики, такие как: хромомицин A3 [ІЗЗ], афлатоксин Bj [Г7б] , тойокамицин [іЗГі], амфотерицин [lI4,I2l], кордицелин [58,137,144], пуромицин [143,144], ногаламицин [63], триптофан [99] и многие другие.
Хороню видимые ФЦ характерны как для ядрышек с низким уровнем синтеза рРНК [169] , так и для активно пролиферирующих клеток [59,62,63,65,66,67]. Это кажущееся противоречие Жессан [64] объясняет тем, что морфология ядрышка зависит не только от интенсивности синтеза рРНК, но и от скорости транспорта предшественников рибосом в цитоплазму.
Хотя вопрос о функции ФЦ в общем смысле решен, многие частные стороны этой проблемы остаются невыясненными. Не ясно, связано ли увеличение и лучшее выявление ФЦ в клетках с подавленным синтезом со снижением интенсивности синтеза РНК, как это предполагают ряд авторов [і20,І7ГІ] , или же, напротив, ФЦ играют важную роль в организации ядрышка и в активном синтезе рРНК [б5,6б]. Не понятно, с чем связано появление в интерфазных ядрышках хорошо видимых ФЦ. Не известно, происходит ли рост, миграция, слияние и изменение конденсации ФЦ.
Тот факт, что фибриллярные центры лучше выявляются в патологических условиях, объясняют следующим образом. При падении син теза ШК объем ядрышка уменьшается, происходит упрощение его структуры - потеря яуклеолон ємного строения - и на фоне сегрегированных фибрилл и гранул лучше выявляются ФЦ. Если же рассматривать падение синтеза РНК не как конечный результат, а во времени, то причиной выявления ФЦ считают следующее. По мере отделения новосинтезированной рРНК от матрицы и переходе ее в фибриллярный, а затем в гранулярный компонент, происходит как бы "обнажение" ядрышкового организатора [I05J . Авторы полагают, что следствием снижения функциональной активности ядрышка является увеличение числа и размеров ФЦ, замаскированных плотным фибриллярным компонентом в активно работающих клетках. При нарушении сянтеза рРНК, находящиеся в фибриллярном компоненте, претерпевают процессинг, в результате чего и обнаруживаются ФЦ.
Изучая ФЦ митотических хромосом клеток асцитной опухоли Эрли-ха, было показано, что на протяжении всех фаз деления, ФЦ сохраняют характерную степень упаковки фибрилл, образующих эту структуру [б7] . Сохранность тех участков митотических хромосом, на которых в интерфазе образуются ФЦ, в то время как остальные конденсируются, свидетельствует об определенной автономности этих районов.
В целом, на основании имеющихся данных следует, что ФЦ входят в состав всех клеток независимо от степени их функциональной активности. Как уже было отмечено выше, в ядрышке, кроме фибриллярных центров, обнаруживается и другой тип светлых зон (полостей),, именуемых вакуолями [65,66,68].
Вакуоли встречаются как в животных [46,179] , так и в растительных клетках [Зі] . Размеры вакуолей очень изменчивы. В нуклео-лонемных ядрышках, как правило, присутствует множество мелких вакуолей. В некоторых случаях вакуоли достигают больших размеров (гигантские вакуоли). Увеличение размеров вакуолей сопровождается редукцией их числа. Если при атом такая крупная вакуоль занимает центральное место в ядрышке, ее обозначают как центральную вакуоль, или как "центральную полость" ( central covity ) [б8,І40] . Содержимое вакуоли (центральной вакуоли, "центральной полости") идентично нуклеошшзме, т.е. полость заполнена интерстациальным матриксом и не содержит волокнистости, характерной для фибриллярных центров. От основного вещества ядра вакуоль ограничена более или менее плотным гранулярным компонентом, образуя как бы ее "стенки". Именно эти два признака (полость, заполненная нуклеоплазмой, и гранулярное окружение вакуоли) дают возможность отличить вакуоль от фибриллярного центра.
Относительно химического состава содержимого вакуолей многое неясно. Имеющиеся сведения носят, скорее предположительный характер, нежели основанный на точных данных. Цитохимическими тестами в вакуолях не удалось обнаружить ионов металлов, энзимов, белков и жиров [18,82,106] . Позже, однако, в ядрышках яиц Arbacia было показано, что гранулы, входящие в состав вакуолей, окрашиваются азуром В и Суданом черным В, что свидетельствует о наличии в гранулах жира [49] . Предполагалось, что центральная полость содержит РШ материал [2D,29,І5ІІ. Действительно, было показано, что яд-рышковые вакуоля клеток конуса роста vicia faba содержат РШІ 30,82 . Высказывалось также предположение, что в состав содержимого светлых полостей входит РНК [I04J , а для клеток мезофяла цитрусовых может быть характерно наличие жидких кристаллов [93,94] Таким образом, даже сравнительно новые электронномякроскопические работы дали, по существу, скудную информацию по поводу химической природы содержимого светлых зон, что, по всей вероятности, связано с техническими трудностями и отсутствием адекватных методических приемов.
Электронномикроскопическая фиксация клеток взрослой крысы и крысиных зародышей
Хрусталики фиксировали целиком в течение 4-5 часов. 2,5% раствор глгатарового альдегида готовили на 0,1 Ы фосфатном или же на 0,05 Ы На -какодилатном буфере при рН 7,2-7,4, В обоих случаях была получены сходная ультраструктурная картина. После промывки чистым буфером Е течение суток ткань еще раз фиксировали в 1% растворе OgCL, , также разведенном на ОД М фосфатном или 0,05М На -какодилатном буфере в течение 1-2 часов (в случае хрусталика постфиксация длилась 3 часа). Затем.ткани обезвоживали в серии спиртов, начиная с 70 этанола. Все процедуры, связанные с фиксацией, промывкой и обезвоживанием до стадии 90 этанола проводили при +4С. Обезвоженный материал заливали Б ЗПОН (подробную пропись см.ниже).
Для более детального изучения морфологии материала, входящего в состав центральной полости кольцевидных ядрышек куриных зародышей,и сравнения его с элементами хроматина в нуклеоплазме, мы прибегали к разрыхлению внутриядерного содержимого с помощью растворов с низкой ионной силой. Для этого образцы ткани помещали в фиксирующие растворы, приготовленные на гипотоническом буфере (0,1 М фосфатный буфер, разбавленный в 4 раза).
Для выявления ДНП и РНЇЇ компонентов внутри ядрышковой полости применяли метод регрессивного окрашивания по Бернару [23] . Следует отметить, что реакция Бернара в наших объектах протекает несколько иначе и характеризуется очень быстрым "выцЕетанием" как ДНИ, так и РНП-содержащих структур. Поэтому дифференцировка в 0,2 М растворе ЭДТА (Serva,tKT) проводили от 15 до 60 минут с интервалом Е 2-3 минуты. Были проверены также и различные сроки окраски в растворах уранилацетата и цитрата свинца. При этом картина, наиболее близкая к описанной Бернаром, наблюдалась при следующих условиях: срезы тканей, зафиксированные в 2,5% глютаровом альдегиде, помещали на 60-120 секунд в 5 -ный водный раствор уранилацетата, после чего промытые срезы дифференцировали в течение 20-30 минут в 0,2 М растворе ЭДТА. Срезы, дифференцированные более 30 минут, обнаруживают значительное понижение контраста, как ДНИ-, так и РНП-содержащих структур. После этого срезы вновь промывали и дополни тельно контрастировали Е течение 60-120 секунд Е цитрате свинца.
Для световой микроскопии печень куриных зародышей фиксировали в жидкости Карнуа и заливали в парафин. Срезы толщинок 5 мкм, приготовленные на ротационном микротоме, депарафинизировали и окрашивали гематоксилан-зозином.
В работе использовали крыс линии Wistar весом 100-120 г и их зародышей на 14-18 день эмбрионального развития. Исследовали печеночные клетки как зародышей, так и взрослой крысы. Помимо этого были исследованы лимфоциты периферической крови взрослой крысы. Кусочки печеночной и почечной тканей фиксировали точно так же, как и в случае гепатопитов крупных зародышей с той лишь разницей, что Е этом случае был использован только 0,1 М фосфатный буфер. Периферическую кровь брали из хвостовой вены в пробирка с гепарином. После отстаивания эритроцитов (+4С) надэритроцитарную жидкость осторожно сцеживали в коническую пробирку и центрифугировали на лабораторной центрифуге при 1500 об/мин в течение 15 мин. Над-осадочную жидкость сливали и заменяли 2,5$ раствором глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере. Остальные процедуры фиксации проводили так же, как и в случае куриных зародышей.
В работе использовали культуру клеток СПЭВ (культура ткани почки эмбриона свиньи), полученную с кафедры гистологии и цитологии МГУК. Клетки выращивали на покровных стеклах, на среде 199, содер х Автор выражает благодарность завкафедрой цитологии и гистологии МГУ, проф. Ю.С.Ченцову, оказавшему содействие в проведении этой яащей 10% бычьей сыворотки и по ІПО ед. пенициллина и стрептомицина на I мл культуральной среды. Плотность роста составляла 50000 клеток на стекло. Часть клеток подвергали действию актиномицина Д ( Serva ,ФЕГ), раствор которого готовили на 96 этаноле в концентрациях 10 мкг/мл и 100 мкг/мл. Растворы антибиотика в количестве 0,01 мл добавляли к 2 мл культуральной среды. Конечная концентрация составляла: 0,05 мкг/мл и 0,5 мкг/мл.
Материал брали через 30 и 60 минут после добавления актиноми-цина Д. Фиксацию проводили в 2,5% растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,4 и в 1% osO , приготовленном на том же буфере.
Ультраструктура ядрышковых вакуолей, вакуоли-зированных и кольцевидных ядрышек в гепатоци-тах и нуклеолояемно-кольцеЕидных - в нефроцитах куриных зародышей
Данная форма характеризуется еще большей редукцией плотного фибриллярного материала (рис.176). Наряду с ячейками видна крупная центральная вакуоль с содержимым, сходным по структуре с нуклеоплазмой. Нуклеолонемная организация отсутствует. Идентифицировать фибриллярные центры, как правило, крайне трудно. Контуры округлого ядрышка сравнительно гладкие, а вблизи него часто располагается перинуклеолярныи конденсированный хроматин (рис.176). Б центральной полости часто обнаруживаются плотные агрегаты (рис.176, стрелки). Тело таких ядрышек представлено главным образом гранулярным компонентом, а фибриллярная часть образует небольшие зоны, разбросанные по всему ядрышку. Следует отметить, что в этом типе, в отличие от мелкоячеистых, фибриллярный компонент не образует отчетливых сферических структур.
КРУПНОЯЧЕИСТЫЕ ЯДРЫШКИ. Это ядрышки с гладким контуром, главным образом округлые или слегка вытянутой формы (рис.18). Характерный вид им придают крупные "вакуоли", приблизительно одинакового размера, отделенные друг от друга узкими трабекулами. РНП-структуры, почти полностью представлены гранулярным компонентом, занимают меньший объем по сравнению с "вакуолями". Сами "вакуоли" имеют такую же структуру, как и в предыдущих типах. Фибриллярные центры обнаружить не удается. Плотный фибриллярный компонент идентифицировать трудно, хотя в некоторых ядрышках он встречается Е виде единичных изолированных участков.
ЯДРЫШКИ ТША "РУЛЕВЫХ КОЛЕС". Этот термин применяют Раве с соавторами 140 в работе, посвященной превращениям ядрышка на ранних стадиях развития куриного эмбриона. Этот тип (рис.19а) в основном характеризуется наличием двух симметрично расположенных или трех приблизительно одинаковых по величине "вакуолей", разделенных узкой перегородкой. Нередко отдельные вакуоли сообщаются мекду собой посредством узкого перешейка 12 . Такие ядрышки, как правило, имеют тонкие "стенки", отделяющие вакуоли от нуклеоплаз-мы и состоящие из гранул. Фибриллярные центры отсутствуют, а плотный фибриллярный компонент, так же как и в предыдущем типе, образует мелкие единичные островки. Объем ядрышка, приходящийся на вакуоли, обычно значителен. Следует отметить, что показанное на ряс.186 ядрышко можно рассматривать и как крупноячеистое, и как данный тип.
КОЛЬЦЕВИДНЫЕ ЯДЕШШ. Эта форма (рис.196,20,21) обращает на себя внимание прежде всего сильным развитием центральной светлой зоны. Как правило, РШ-компонент представлен в виде узкого ободка, окружающего центрально расположенную электронно-светлую вакуоль, достигающую иногда больших размеров 1-3 мод. Б теле ядрышка присутствуют преимущественно гранулы. Фибрилл, как и в предыдущем типе, мало, а фибриллярные центры не обнаруживаются. Содержимое вакуоли и нуклеоплазма при больших увеличениях обнаруживает четкое сходство структуры и почти одинаковую степень упаковки составных элементов (рис.21). Однако нами отмечались случаи, когда материал светлой зоны был более рыхлым, чем околоядрышковая нуклеплазма, и, напротив, когда последняя казалась менее плотной по сравнению с центральной вакуолью. Как правило, околоядрышковый конденсированный хроматин, часто видимый вблизи кольцевидных ядрышек, заметно превосходит по электронной плотности материал, видимый в вакуоли. Обычно в центральной светлой зоне удается различить похожие на хроматин фибриллы, и небольшие электронноплот-ные агрегаты или же гранулы непостоянного диаметра. Центральная вакуоль в некоторых случаях имеет выход в нуклеоплазму, и тогда в таких случаях тело ядрышка имеет на срезах форму незамкнутого кольца (рис.206). При больших увеличениях участки, где обнаруживается "разрыв" кольца, содержат более рыхло упакованные фибриллы и гранулы (стрелки), отходящие от краев яцрышкового тела (рис. 21). При этом создается впечатление о "расплетании" тех плотных структур, из которых построено ядрышко, вследствие чего мы наблюдаем "разрушение" стенки кольцевидного ядрышка. На этих ке рисун ках отчетливо видна тесная связь фибрилл светлой полости и нук-леоплазмы со стенками кольцевидного ядрышка.
При проведении реакции Бернара (рис.22), выявляющей РНП-со-держащие структуры, интенсивно окрашенным остается тело ядрышка, а хроматин обесцвечивается. При этом резко меняется структура центральной светлой зоны, кольцевидных ядрышек и вакуолей ячеистых ядрышек, которые при регрессивном окрашивании с помощью ЭДТА теряют четко выраженную фибриллярную структуру (рис.22а). Действительно, как следует из рисунка, достаточно высокий контраст, сопоставимый с таковым субъединиц, из которых построено тело ядрышка, в вакуолн сохраняют небольшие РШ-содержащие гранулы, равномерно рассеянные по всей светлой зоне и часто связанные с телом ядрышка. Б целом вакуоль обнаруживает более выраженную гранулярность, однако при детальном изучении можно выявить и тончайшие РНП фибриллы, отходящие от гранул. Области околоядрышкового хроматина (рис.22а) также обнаруживают обилие РНП-содержащих структур (стрелки), гранул различного диаметра и фибрилл, локализованных преимущественно по периферии зоны околоядрышкового конденсированного хроматина.
