Введение к работе
Актуальность проблемы^.
Традиционно выделяют три структурных уровня организаций хроматина: ^клеосомный уровень, уровень хроматиновой фибриллы и петельний уровень, тдельные уровни этой иерархически организованной структуры взаимно согласованы пя выполнения различных программ, направленных на поддержание жизнедеятельности іетки и развитие организма. Поэтому особый интерес представляет сопоставление груктурных и динамических характеристик хроматина на каждом из уровней его груктурной организации со спецификой клеток, из которых он был получен. <Эго тносится как к хроматину в целом, так и к его отдельным участкам.
Наиболее изучен нуклеосомный уровень организации хроматина. Он описывается акими параметрами, как величина нуклеосомного повтора, конформационная збильность комплекса ДНК с гистонами, состав гистонов и их модификации, асположение нуклеосом относительно последовательности ДНК. По-видимому, именно ти базовые характеристики определяют также характер структуры хроматина на оследующих, более высоких уровнях.
До сих пор не существует единой точки зрения на структуру хроматиновой )ибриллы. Большинство гипотез, касающихся наднуклеосомной организации хроматина, южііо разделить на два класса: к первому относятся дискрртные модели, предлагающие іргснизацию фибриллы в так называемые супербиды или нуклеомеры. а ко второму -юдели, представляющие 30 нм фибриллу непрерывным рядом нуклеосом, уложенных в иде соленоида или суперспирали. Существуют и промежуточные между этими классами юдели (см. Бавыкин, 1988). Следует отметить, что наибольшее экспериментальное юдгвержденив получили модели непрерывной 30 нм фибриллы. Причем различные юдели непрерывной хроматиновой фибриллы отличаются друг от друга, главным (бразом, по способу укладки межнуклеосомной или линкерной ДНК. По этому принципу їх можно разделить на три класса; - линкерная ДНК свернута в виде суперспирали, іродолжая путь ДНК коровой частицы; - линкерная ДНК свернута в петлю внутри юленоида; - соединяющая две соседние нуклеосомы линкерная ДНК растянута. Для уточнения способа организации линкерной ДНК необходима информация о таких
I-
характрристиках нуклеосомной организации хроматина, как длина нуклеосомной ДНК. ассоцииронанной с октамером гистонов, и взаимное расположение точек входа и выхода ДНК с нуклеосомы.
Третий уровень организации ДНК в хроматине состоит в укладка 30 им хроматиновой фибриллы о петли, прикрепляющиеся к ядерному матриксу. Показано, что концы петель могут присоединяться к ядерному матриксу через топоиэомераэу II (Earnsha.v et al., 1985; Berrios et al., 1985) - фермент способный релаксировать как положительно, так и отрицательно суперспиралиэованную ДНК. В настоящее время можно считать доказанным, что в транехрипционно активном хроматине существуют торсионные напряжения (см. van Holde, 1989)..которые, возможно, они являются одним из существенных факторов в регуляции транскрипции хроматина. (Weintraub, .1986). В клетках прокариот существует специальный класс ферментов гиразы. которые способны лерооодить ДНК в суперскрученное состояние и аналоги которых не обнаружены у эукариот. Поэтому предполагается, что создание торсионных напряжений е потло хроматина может происходить благодаря частичному раскручиванию ДНК нуклеосом. В связи с этим представляется интересным прооести сравнительное исследование динамики конформационных изменений нуклеосомной ДНК готальногс хроматина из клоток, различающихся транскрипционной активностью, а также находящегося в особом, гетерохроматиновом состоянии. Это можно осуществить применяя наряду с биохимическими подходами, метод кругового дихроизма (КД) который позволяет оценить конформационное состояние ДНК в хроматине.
Цели_м_ааао.ч и_л с с дедоппшии
Цель настоящей работы соаояпа в том. чтобы исследовать взаимосвязь межд; структурными, (размер нуклеосомного повтора и длина нуклеосомной ДНК ассоциированной с октамером гистонов) и динамическими параметрами, нуклеосомноі организации хроматина, выделенного из клеток, различающихся по характер' дифференцировки и тотальному уровню транскрипционной активности ядер. В качеств* динамического параметра проводим оценку величины, характеризующей лабильності нуклеосомной ДНК, т. е. изменение длины ДНК, ассоциированной с октамером гистонов при изменении ионной силы раствора.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
.3-
1. Методом кругового дихроизма провести сравнительное исследование динамики
компактизаиии олигонуклеосомных фрагментов хроматина, индуцируемой увеличениям
ионной силы раствора. С помощью этого приема, традиционно используемого при
исследованиях in vitro в качестве аналога процесса конденсации хроматина в ядре,
изучить компактиэацию фрагментов хроматина, выделенного из следующих типов клеток
и тканей: тимус крыс, асцитной гепатомы 22А мыши, нормальной и регенерирующей
печени мыши линии СЗНА, спермиев морского ежа и нейронов больших полушарий мозга
голубя.
2. На основании полученных данных, используя модельные расчеты, оценить
размеры компактного (ассоциированного с октамером гистонов) и развернутого
участков нуклеосомной ДНК в составе олигонуклеосом для каждого из указанных выше типов клеток.
3. Определить величину тотального нуклеосомного повтора в клетках асцитной
гепатомы 22А мыши, а также в плаценте и эмбриональной печени человека. Для
последних двух типов клеток сравнить тотальную величину нуклеосомного повтора с
нуклеосомным повтором хроматина, включающего сателлитную ДНК 3 человека, которая
находится, согласно литературным данным, преимущественно в составе
гетерохроматина.
Научная новизна и научно-практическая ценность.
Проведено сравнительное исследование ряда хроматинов, выделенных из клеток, различающихся по характеру дифференцировки и тотальному уровню транскрипционной активности ядер.
В настоящей работе выявлены интересные характерные особенности изученных образцов и предпринята попытка обобщить полученные данные.
Методом кругового дихроизма показано, что первый этап компмктизации всех изученных типов хроматина, за исключением хроматина асцитной гепатомы 22А, происходит за счет увеличения доли нуклеосомной ДНК, ассоциированной с октамером гистонов.
Показана неспособность к образованию хроматосомной структуры при повышении ионной силы в хроматинах, выделенных из клеток, характеризующихся высокой транскрипционной активностью: кортикальных нейронов больших полушарий мозга голубя и асцитной гепатомы 22А.
Впервые обнаружена устойчивость нуклеосомной ДНК хроматина асцитной щпатомы 22А к компактиэующему действию хлорида натрия в растворе. Это свойство отнимает хроматин гепатомы от других известных типов хроматина.
Данные, полученные в нашей работе, дают основания полагать, что характер компактиэации хроматина спермисв морского ежа при концентрации NaCI выше 30 мМ отличается от тахового для хроматинов, не имеющих сверхконденсировзнного состояния. Компактиэация хроматина в этих условиях сопровождается уменьшением спиральное гистомоо, которое может быть объяснено конформационным переходом в С-концепом фрагменте спермий-специфического гистона HI из а-спиральной конформации в конформацию вытянутой левой спирали.
Получены приоритетные данные о различной величине нуклеосомного повтора в хроматине, содержащем сателлитную ДНК 3 человека для двух разных тканей одного организма, характеризующихся одинаковым тотальным нуклеосомным повтором; Эти результаты тем более интересны, что особенности структурной организации гетерохроматина мало изучены.
На основании полученных данных делается заключение о важной роли в оценке организации хроматина таких критериев, как возможность дополнительной ассоциации части лимкерной ДНК с октамером гистонов и способности к образованию хроматосомной структуры.
" Полученные в работе результаты углубляют понимание механизмов Функционирования хроматина и уточняют наши представления о структурно-"функциональных взаимоотношениях в хроматине. Они способствуют более полному пониманию изменений, происходящих в хроматине в процессе дифференциррвки, v выяснению структурной организации и особенностей функционировать пэтерохромэтина
йддабаиия работы.
Материалы диссертации докладывались на Республиканском симпозиум* "Ядерные белки и экспрессия генома" (Канев, 1983). на VIII (Путино. 1984) и О (Черноголовка. 1987) Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" на V (Харьков, 1984) и VI (Харьков 1988) Всесоюзных конференциях по спектроскопиі биополимеров на VI симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров і
J-
растворах (Тбилиси., 1985), на II русско-германском симпозиуме по белково-нуклеиноіи.ім взаимодействиям (Берлин 1995) и на сек'икарзх Института цитологии РАН.
По томе диссертации опубликовано S статей.
Объем работы.
Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждений собственных исследований, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 1 таблицей.
