Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы
I.1. Закономерности - клеточной пролиферации в тканях млекопитающих
1.1. Жизненный цикл клеток обновляющихся тканей млекопитающих 10
1.2. Суточная периодичность клеточной пролиферации в тканях млекопитающих 15
1.3. Клеточная пролиферация в эпителии пищевода млекопитающих 21
II.2. Глюкокортикоидные гормоны в регуляции клеточного размножения
2.1. Стресс. Биологическое действие глюкокор-тикоидных гормонов 30
2.2. Клеточная пролиферация в тканях животных при изменении содержания глюкокор-тикодиных гормонов в организме
2.2.1. Клеточная пролиферация- в тканях животных после адреналэктомии 32
2.2.2. Клеточная пролиферация в тканях животных после введения глюкокортикоидов. 36
III.3. Кейлонная регуляция клеточной пролиферации 43
III. Материалы и методы исследования 54
IV. Результаты собственных исследований
І.1. Суточный ритм содержания глюкокортико- идных гормонов в плазме крови у крыс после адреналэктомии и многократного введения гидрокортизона 64
II.2. Клеточная пролиферация в эпителии пищевода крыс после адреналэктомии
2.1. Суточный ритм синтеза ДНК и митозов после адреналэктомии 74
2.2. Параметры митотического цикла клеток эпителия пищевода крыс после адреналэктомии . 80
3. Клеточная пролиферация в эпителии пищевода крыс при введении гидрокортизона 87
4. Исследование биологической эффективности кейлонов, выделенных из слизистой оболочки пищевода, при изменении гормонального баланса в организме животных 101
V. Обсуждение результатов исследования 103
VI. Предложения об использовании полученных данных 122
VII. Выводы 123
VIII. Список Литературы 125
- Суточная периодичность клеточной пролиферации в тканях млекопитающих
- Клеточная пролиферация в тканях животных при изменении содержания глюкокор-тикодиных гормонов в организме
- Суточный ритм содержания глюкокортико- идных гормонов в плазме крови у крыс после адреналэктомии и многократного введения гидрокортизона
- Параметры митотического цикла клеток эпителия пищевода крыс после адреналэктомии
Суточная периодичность клеточной пролиферации в тканях млекопитающих
Ф.Халберг (1964) определил временную организацию физиологических функций как повторение одной и той же последовательности событий в биологическом циркадном ритме организма. "Согласование частей" в организме стали понимать как "согласование частей во времени" и связывать вопросы координации функций во времени с организацией и адаптацией биологической системы.
Понятие структуры неотделимо от понятия времени (Г.Н.Крыжа-новский, 1973). Теоретическое обоснование этого положения вылилось в закон временной дискретности и биологических ритмов, включающих в себя "квантовость" биологических реакций и периодическую активность футщионирующих единиц.
Романов, Рыбаков (1973о), обсуждая вопрос о временной организации биологической системы, отметили "способность системы к установлению согласованности временной организации с внешними периодическими колебаниями". Ю.А.Романов (1980) выделяет четыре части временной организации биологических систем: I) часть, осуществляющую регу«ляцию; 2) часть, воспринимающую еиегналы регуляции; 3) часть, включающую в себя эффекторные функции, 4) часть, связывающую временную организацию биосистемы с внешней средой и другими биосистемами. По мнению Ю.А.Романова, к специальной части временной организации биосистемы следует отнести органы чувств, через которые преломляются действия датчиков времени. Связь между биоритмами разных систем может осуществляться в физико-химических взаимодействиях. Аппарат, относящийся к биологической рецепции, в том числе циторецепции, имеющий с регулирующей системой прямые и обратные связи. Третья часть включает в себя множество биоритмов "рабочих" функций организма. В системе клеточной репродукции должны существовать внутри-и внесистемные механизмы согласования ритмов между собой, с ритмами организма и окружающей средой. Внутрисистемная регуляция временной организации обеспечивается двумя механизмами (Романов, 1972, 1980). Первый - осуществляет синхронизацию вступления клеток в синтетическую фазу цикла; второй - синхронизирует переход клеток из премитотической фазы в митоз и может действовать независимо от первого механизма. Биологические ритмы выражают собой специальную форму временного поведения биологических систем (Л.Ренсинг, 1973). Согласно Ю.А.Романову (1977) устойчивость, выживание и развитие биологических систем находится в большой зависимости от колебаний их морфо-физиологических параметров. Результаты последних работ позволяют охарактеризовать митотический цикл как комплекс взаимосвязанных специфических функциональных явлений в популяции клеток, образующих систему процессов их репродукции. Многими авторами показаны ритмические изменения на протяжении суток числа клеток, находящихся в том или ином периоде митотического цикла, и продолжительности митоза и фазы синтеза ДВК.
Большинство данных указывает на то, что максимальное число клеток, синтезирующих ДНК, наблюдается, как правило, на границе светового и темнового периодов суток - в вечернее время. Наибольший митотический индекс обнаруживается чаще всего в ранние утренние часы суток. В первых исследованиях ритма синтеза ДЖ В тканях ЖИВОТНЫХ С Pilgrim, ЕгЪ, MaurerI963; Pilgrim et al 1965) было обнаружено отставание пика митозов от максимума синтеза ДНК на 12 час. На основании этих данных авторами было высказано мнение о постоянстве длительности периодов s + G2 митотиче-ского цикла. Однако вскоре появились сообщения о том, что максимумы синтеза ДНК и митотической активности в суточном ритме могут разделяться короткими интервалами времени или совпадать. Такие данные были получены на эпителии роговицы крша ( scheving, Pauly, 1967), на эпителии роговицы мышей (С.Г.Мамонтов, 1969), эпидермисе ( Tvermyr, 1972), эпителии толстой кишки ( Chang, 1971), эпителии паращитовидной железы и строме щитовидной железы (Ю.А. Романов, 1970). Факт совпадения во времени максимальной ДНК-синтетической и митотической активности в тканях может быть объяснен существованием независимых механизмов синхронизации клеток перед вступлением в s -или М-фазу митотического цикла. Действительно, В.П.Рыбаков и соавт. (1977, 1979) обнаружили, что в эпителии пищевода на 75$, а в печени полностью пик митозов обеспечивается клетками, не участвовавшими в синтезе ДНК в предыдущие сутки. Таким образом, синхронный выход клеток из резервных популяций должен рассматриваться как один из основных механизмов формирования суточного ритма деления клеток.
При анализе результатов исследования суточного режима пролиферации обращает на себя внимание неодинаковая степень синхронизации синтеза ДНК и клеточного деления в разных тканях. Принимая показателем синхронности пролиферации амплитуду колебаний РИ и Щ на протяжении суток, можно отметить, что она уменьшается в тканях с высоким уровнем клеточного размножения.
Помимо изменения числа клеток, вступающих в период синтеза ДНК или в митоз, на протяжении суток изменяется также длительность ЭТИХ периодов (табл. $ 4). Pilgrim и Maurer, (1965); Pilgrim, (1964), применяя метод двойного маркирования клеток, синтезирующих ДНК, нашли в эпителии пищевода мышей колебания на протяжении суток сильно и слабо пометившихся клеток. Причем, максимум их были асинхронны. Сделано предположение, что имеет место неодинаковая продолжительность s-фазы для эпителия пищевода в течение суток. Из расчета, сделанного авторами, следует, что продолжительность s -фазы 10,5 часа - в 17 часов, 7,1 часа - в 23 часа, 4,2 часа - в 5 часов, 7,4 часа - в II часов, среднесуточная величина s-фазы - 7,2 часа.
Клеточная пролиферация в тканях животных при изменении содержания глюкокор-тикодиных гормонов в организме
Действие адреналэктомии на эпителиальные ткани изучено недостаточно. Исследования, касающиеся действия адреналэктомии на клеточное размножение в эпителии пищевода, практически отсутствуют .
Clark с соавт. (1962) отметили незначительное влияние адреналэктомии на суточный ритм митотической активности в эпителии желудка, а именно, некоторое увеличение числа митозов в вечерние часы суток.
Cardoso et al., (1967) рассматривали эффект адреналэктомии и введения дексаметазона на циркадное распределение митозов в роговице крыс. Установлено, что в норме МА имеет наивысший уровень в позднее утро (10 ч) и наименьший - ночью (в 23 ч.). Введение дексаметазона адреналэктомированным крысам восстанавливает нормальное соотношение день - ночь.
Scheving and Pauly, (1967) при исследовании суточного ритма митозов после удаления надпочечников нашли, что в эпителии роговицы адреналэктомированных крыс число митозов уменьшается и нарушается синхронизация деления клеток на протяжении суток. Более демонстративные результаты, указывающие на регуляторную роль гормонов коры надпочечников в организации пролиферативного режима в тканях, получаются при использовании в экспериментах статмокинетических препаратов. Tat ton, (1973), используя колхицин для регистрации клеток, вступивших в деление за время исследования, обнаружили уменьшение пролиферативной активности в эпителии тонкого кишечника крыс. С.Г.Мамонтов и соавт. (1980) при исследовании суточного ритма митотической активности в эпителии роговицы и языка с предварительным введением животным колхамина обнаружили следующее. Адреналэктомия предотвращает подъем митотической активности в суточном ритме. Амплитуда колебаний индекса к-митозов на протяжении суток снижается более чем в два раза. Уменьшается, следовательно, синхронность клеточного деления в течение суток.
Скорость физиологической регенерации изученных эпителиев снижается. У адреналэктомированных мышей нарушается также суточная периодичность синтеза ДНК (Мамонтов, Иванова, 1976; Мамонтов, 1977). Авторы приходят к заключению, что глюкокортико-идные гормоны участвуют в регуляции суточного ритма клеточного размножения и служат фактором, определяющим интенсивность клеточного размножения в тканях.
Knutson p. et Lundin P.M. утверждают, что стероиды коры надпочечников усиливают реутилизацию ДНК в лимфоидных тканях, особенно в тимусе. Данные Knutson et al об увеличении относительного веса тимуса после адреналэктомии согласуются с данными Каболовой с соавт. (1971). Правда, Каболова З.А. и Попов А.П. наблюдали в эпителиальных клетках мозгового вещества ви-лочковой железы усиление синтетических процессов (увеличение числа зерен в 2 раза) при авторадиографическом исследовании крыс, спустя 2 недели после адреналэктомии. В этом случае (по мнению Каболовой с соавт., 1971) имеет место стимуляция белкового и нуклеинового обмена после удаления надпочечников. Усиление митотическои активности и появление бластных форм среди лимфоцитов в тимусе отмечали также после адреналэктомии С.М.Кремли и С.Г.Мамонтов (1979).
В большинстве работ по адреналэктомии определение МА и ДНК-синтезирующих клеток проводилось не в суточном плане. Поскольку в течение суток чувствительность тканей к гормонам меняется (Мамонтов и соавт., 1974; Романов, 1977) и при недостатке или при избытке гормонов может происходить нарушение фазовой структуры ритма. Сведения, имеющиеся в литературе и отражающие эффект адреналэктомии на пролиферацию эпителиальных клеток, противоречивы. После адреналэктомии описано как увеличение МА И ИМЯ (H.Teir и I.Carpen (1959)- в эпидермисе, Clark et al(I962) - в эпителии желудка, Саидов (1970) - в эпителии кишечника, Desser-Wiest (1974) - в регенерирующей печени), так и снижение МА и повышение амплитуды ее колебаний на протяжении суток (Scheving and Pauly (1967); Tutton (1973) - на эпителии крипт jejunum І С.Г.Мамонтов (1977) - на эпителии роговицы) . Наряду с этим по данным И.А.Алова (1964) адреналэктомия не влияет на МА эпидермальных тканей.
По данным С.Г.Мамонтова (1977), ритм синтеза ДНК в базаль-ном слое эпителия языка у адреналэктомированных мышей оказался сходным с ритмом у контрольных животных. Среднесуточные величины также не отличались. Поскольку адреналэктомия вызывает изменения в суточном ритме митозов, а не в суточном ритме синтеза ДНК, очевидно, имеет место неодинаковая чувствительность к глю-кокортикоидам механизмов синхронизации клеток перед s и М-фазой.
В литературе нет данных по длительности G-, , G2 , S и митоза в эпителиальных клетках в условиях дефицита глюкокорти-коидов. Первые работы С.Г.Мамонтова (1975, 1977) по изучению длительности митоза в роговице показали, что имеет место замедление митоза при недостатке глюкокортикоидов у адреналэктомированных крыс.
Роль глюкокортикоидных гормонов в регуляции клеточного деления можно более полно оценить путем выключения их влияния на клетки, двусторонняя адреналэктомия у крыс приводит к резкому снижению уровня глюкокортикоидов в крови. В этих условиях в эпителии роговицы, языка и печени крыс суточная фракция клеток (Рс), вступивших в митоз , (по данным С.Г.Мамонтова, 1977) уменьшается на 18-23$ по сравнению с нормой; соответственно увеличивается время клеточного обновления тканей.
Суточный ритм содержания глюкокортико- идных гормонов в плазме крови у крыс после адреналэктомии и многократного введения гидрокортизона
Интенсификация процессов физиологической регенерации эпителия пищевода крыс в условиях гиперкортицизма демострируется также результатами опыта по определению суточной фракции ДНК-синте-зирующих клеток в этой ткани. С этой целью контрольным и подопытным крысам вводили 3Н-тимидин каждые 4 час на протяжении суток. Индекс меченых ядер оказался равным 48,5 2,7$ в контроле и увеличивается в опыте до 68,1 5,7$ (Р = 0,021), т.е. на 40$ (рис.14). Полученные результаты также отражают ускорение физиологической регенерации эпителия пищевода при многократном введении животным гидрокортизона.
В связи с обнаруженным усилением митотической и ДНК-синтетической активности клеток эпителия пищевода у животных с повышенным содержанием глюкокортикоидных гормонов в организме, в следующей серии опытов (серия 5) был исследован суточный ритм деления клеток в этой ткани у крыс, получавших многократные инъекции гидрокортизона.
У контрольных животных наибольшее число митозов встречается в 10-13 час, снижается к 22 час (Р = 0,002) и вновь повышается в утренние часы суток. У крыс, получавших инъекции гидрокортизона, в 10-13 час митотический индекс невысок. По сравнению с контрольными показателями в этот период суток различия МИ в опыте достоверны (Р = 0,003). К 16 час. МИ резко повышается (Р = 0,01) и вновь снижается к 19 час. (Р С 0,05). В 22-1 час. наблюдается второй пик митозов, сменяющийся затем низким МИ. Ба основании этих данных можно считать, что период ритма митозов у подопытных крыс составляет в эпителии пищевода 6-9 час в отличие от 24 час в контроле.
Таким образом, у животных, получавших многократно инъекции гидрокортизона, ритм митозов перестраивается, становится двухвершинным. Среднесуточный МИ, так же как амплитуда ритма, существенно не изменяются.
В исследованиях, проведенных С.Г.Мамонтовым на эпителии роговицы у тех же животных, получены такие же результаты. В эпителии роговицы наибольшее число митозов обнаружено в период с 4 до 10 час, минимальное - с 19 до I час, как это было найдено у крыс во многих других исследованиях (В.Н.Доброхотов и соавт., 1961; С.Г.Мамонтов и соавт., 1980). У крыс, получавших инъекции гидрокортизона, МИ высокий в период от 10 до 12 час и еще более возрастает к 16 час - в то время когда в контроле число митозов уменьшается. Различия между МИ в 16 час в контроле и опыте достоверны (Р = 0,007). Затем МИ снижается к 22 час и вновь возрастает в I час (Р = 0,01). Второй пик МИ, обнаруженный в I час, достоверно отличается от МИ в 4 час. Таким образом, ритм митозов в эпителии роговицы у крыс, получавших гидрокортизон, также как в эпителии пищевода, представлен на протяжении суток двухвершинной кривой. На основании полученных данных можно полагать, что монофазный характер ритма митозов у контрольных животных сменяется на бифазный с длиной периода, равной 9 час (с 16 до I час) и 15 час (от I до 16 час). При этом среднесуточный МИ в опыте в обеих тканях практически не отличается от контроля. Амплитуда ритма также не меняется.
Следовательно, и в эпителии роговицы, и в эпителии пищевода крыс после длительного введения гидрокортизона наблвдаются в принципе сходные изменения ритма митозов по сравнению с контролем Ритм приобретает бифазный характер при неизменной амплитуде и среднесуточных значениях МИ.
В условиях повышения пролиферативной активности эпителия пищевода у животных, получавших многократные инъекции гидрокортизона, можно ожидать ускорения прохождения клетками периодов митотического цикла. С целью проверки этого предположения был поставлен опыт (серия 6) по исследованию продолжительности митотического цикла при длительном повышении уровня глюкокортикоид-ных гормонов в организме. в 14-15 час. Среднесуточный МИ составил 4,1 т.е. величину, близкую к среднесуточным значениям митотической активности, полученным в других сериях опытов. Первые меченые митозы появлялись через 0,5 час. после инъекции Н3-тимидина, таким образом G2 min =0,5 час, tG средн. 0казаЛ0СЬ равным 4 час. и Огтах = 5 час. При определении продолжительности периода синтеза ДНК получаем величину, равную 6,5 час. После снижения процента меченых митозов через 14 час. после импульсного мечения наблюдается второй подъем, меньше первого, который продолжается до конца исследования. На этом основании можно приблизительно оценить продолжительность митотического цикла в целом как равную 16-18 час.
У крыс, получавших инъекции гидрокортизона, первые меченые митозы также появляются через 0,5 час.после введения 3Н-тимиди-на, затем процент меченых митозов быстро увеличивается и достигает максимальных значений через 3 часа после введения изотопа. Таким образом, tG2 средн# = 2 час, t ma3C = 3 час. После достижения 85$ уровня число меченых митозов снижается и второй подъем наблюдается через 6 час после введения 3Н-тимидина. Третий подъем наблюдается, как и в контроле, через 17-19 час. после начала опыта. Таким образом, в условиях гшіеркортизма продолжительность S-фазы митотического цикла в эпителии пищевода крыс сокращается приблизительно в 2 раза и составляет около 3-3,5 часов.
Параметры митотического цикла клеток эпителия пищевода крыс после адреналэктомии
Именно поэтому выяснение вклада глюкокортикостероидов в регуляцию клеточного обновления тканей является первостепенной задачей при исследовании механизмов поддержания структурного гомеостаза. Вместе с тем уровень пролиферации в тканях в конечном счете определяется характером взаимодействия тканевых и ор-ганизменных факторов регуляции (С.Г.Мамонтов, 1983). Вследствие этого выявление взаимосвязей между глюкокортикоидами и тканевыми регуляторами пролиферации необходимо для более полной характеристики влияния глюкокортикоидов на ткань.
Материальным субстратом для действия регуляторов клеточного размножения служат клеточные популяции, составляющие ткань. По отношению к пролиферации в каждой обновляющейся ткани можно выделить по крайней мере несколько популяций: "быстрые клетки" с коротким митотическим циклом; "медленные клетки" с длительным митотическим циклом; клетки, входящие в состав резервной R2 популяции; клетки, входящие в состав резервной R- -популяции; клетки, необратимо дифференцированные и утратившие способность к вступлению в цикл. Каждая из популяций обладает разными проли-феративными потенциалами и вносит неодинаковый вклад в показатели общей пролиферативной активности. Вероятно также, что они проявляют неодинаковую компетентность к факторам,индуцирующим или ингабирующим вступление клеток в фазу синтеза ДНК или в митоз.
Одним из доказательств неодинаковой чувствительности клеток эпителия пищевода к действию регуляторних факторов служит неполная синхронизация из перед s и м-фазой митотическо-го цикла в суточном ритме. В любое время суток обнаруживаются ДЖ-синтезирующие или делящиеся клетки (рис. 7, 8). Вместе с тем изменения показателей суточного ритма синтеза ДНК и митозов служат важным источником информации о закономерностях действия регулирующих факторов на размножение клеток и особенностях про-лиферативного ответа ткани на то или иное воздействие.
В наших экспериментах исследованы показатели пролиферативной активности и параметры суточного ритма размножения клеток эпителия пищевода при снижении уровня глюкокортикоидных гормонов в организме путем адреналэктомии и в условиях гипер-кортицизма, создаваемого введением гидрокортизона.
Для того, чтобы оценить адекватность избранных экспериментальных моделей, мы определили на протяжении суток концентрацию глюкокортикоидов в плазме крови контрольных животных, адреналэк-томированных крыс и крыс, получавших многократные инъекции гидрокортизона. У контрольных животных обнаружен суточный ритм содержания гормонов в крови с максимальными значениями в 18.30 и минимальными в утренние часы суток. Таким образом, усиление секреции глюкокортикоидов приходится на границу светового и твинового периодов суток, как это находили и многие другие исследователи (Ю.А.Романов, В.А.Таболин, 1975; Ulrich et al, 1976; Malaova, Ahlers, 1977). Адреналэктомия приводит к снижению среднесуточной концентрации гормонов до 57$ от контрольного уровня. Наиболее резкое снижение концентрации гормонов наблюдается в период активной фазы ритма их концентрации у интактных животных (рис. 2). В соответствии с описанными изменениями ритма глюкокортикоидов изменяется и суточный ритм деления клеток.У адренал-эктомированных крыс отсутствует утренний подъем митотического индекса, наблюдаемый у контрольных животных в 6.30 (рис. 6). Поскольку пик митозов, как правило, обусловлен предшествующим на 10-12 час. пиком синтеза ДНК, можно полагать, что сглаживание ритма митозов обусловлено уменьшением синхронности вступления клеток в фазу синтеза ДНК в вечерние часы предыдущих суток.
В группе крыс, получавших многократные инъекции гидрокортизона, содержание глюкокортикоидов в крови резко повышается. В этих условиях ритм митозов перестраивается, становится бифазным с максимумами в 22.30 и в 10.30. Период ритма уменьшается до 12 час. Полученные результаты позволили предположить, что между характером ритма и концентрацией глюкокортикоидных гормонов и интенсивностью и ритмичностью клеточного деления в эпителии пищевода имеется причинная связь. Исследование других параметров пролиферации в условиях гипо- и гилеркортицизма подтверждают это предположение. В отдельном эксперименте был изучен суточный ритм синтеза ДНК и митозов у адреналэктомированных крыс. Характер суточного ритма митозов в эпителии пищевода в норме сходен с обнаруженным другими исследователями (Ю.А.Романов, И.К.Рахматуллина, 1970; В.П.Рыбаков, 1972; В.П.Рыбаков, Ю.А.Романов, 1976; В.П.Рыбаков и соавт., 1979; С.М.Кузин, Ю.А. Романов, 1979; Pilgrim et al,1963). Среднесуточный МИ в эпителии пищевода контрольных животных составил 3,9 0,6 0. Данные согласуются с данными В.И.Васильевой и соавт. (1970), В.И.Доброхотова и соавт., (1977). У адреналэктомированных животных, как и в контроле, минимальный МИ наблюдается в вечерние часы. Кривая суточного ритма сходна с контрольной. Период повышенной митотической активности более растянут, чем в контроле, а значения МИ не достигли контрольных величин. Амплитуда колебаний МИ на протяжении суток снижается в 2раза по сравнению с контролем.
