Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1 Структурная организация хроматина 11
2.1.1. Начальные уровни компактизации хроматина: 11
нуклеосомы и элементарная фибрилла хроматина
2.1.2. Высшие уровни организации хроматина 17
2.1.3. Роль ядерного матрикса и хромосомного скэффолда в формировании пелевых доменов хроматина
2.1.4. ДНК-белковые взаимодействия, определяющие петлевую организацию генома
2.1.5. Высшие уровни организации хроматина в интактных клетках
2.1.6. Линейная неоднородность митотических хромосом
2.2. Структура и функция конденсинов 47
2.2.1. Семейство SMC-белков 50
2.2.2. Функции конденсинов в митозе 51
2.2.3. Биохимические активности конденсинов 53
2.2.4. Взаимодействие конденсинов с ДНК.
2.2.5. Конденсины и компактизация хромосом. 57
2.2.6. Взаимодействие топоизомеразы II и конденсина в митотических хромосомах
2.2.7. Фосфорилирование и регуляция конденсинов 62
2.2.8. Роль регуляторных субъединиц конденсина в связывании с хромосомами
2.2.8. Другие факторы, участвующие в рекрутировании конденсинов
2.2.9. Взаимодействие субъединиц в составе конденсинового комплекса
2.2.10. Роль конденсинов в регуляции транскрипции 71
2.3. Структурная организация реплицирующегося хроматина 76
2.3.1. Домены хроматина и репликация 76
2.3.1. Репликативная организация нативного хроматина: репликативные сайты
2.3.2. Ультраструктура репликационного сайта 87
2.4. Структурная организация хроматина и регуляция транскрипции
2.4.1. Регуляция транскрипции на уровне нуклеосом 97
2.4.2. Петлевые домены и транскрипция 99
2.4.3. Пространственная организация транскрипции: транскрипционные фабрики
2.4.4. Роль хроматиновых фибрилл высшего порядка в регуляции транскрипции
2.4.5. Взаимосвязь транскрипционной активности генов с пространственной организацией интерфазного ядра: хромосомные территории
2.4.6. Регуляция транскрипции в масштабах целой хромосомы: инактивация Х-хромосомы
Цели и задачи работы 114
3. Материлы и методы 116
3.1. Растворы 116
3.2. Векторы и их модификация 117
3.3. Культура клеток 119
3.4. Синхронизация клеток 120
3.5. Получение трансгенных клеточных линий 123
3.6. Ингибирование транскрипции 123
3.7. Световая микроскопия и иммунофлуоресценция 124
3.8. Визуализация реплицированного хроматина 126
3.9. Получение хромосомных препаратов и дифференциальная окраска хромосом
3.10. Прижизненные наблюдения за клетками 12 8
3.11. Электронная микроскопия 128
3.12. Иммуноэлектронная микроскопия 129
3.13. Цифровая обработка изображения 13 0
3.14. In vivo иммуномечение ядерных белков 131
3.15. Гибридизация in situ 132
3.16. Определение копийности интегрированных трансгенных конструкций
3.17. Выделение РНК и РТ-ПЦР 134
3.18. Получение препаратов мейотических хромосом Xenopus laevis и иммуноокрашивание
3.19. Электрофорез и иммуноблоттинг 137
4. Результаты и их обсуждение 138
4.1. Структурные мотивы высшего порядка в организации факультативного гетерохроматина
4.1.1. Идентификация неактивной Х-хромосомы на светооптическом и электронномикроскопическом уровне
4.1.2. Ультраструктурная организация неактивной Х- хромосомы.
4.1.3. ЗБ-структура тельца Барра. 151
4.1.4. Позиционирование неактивной Х-хромосомы в ядре.
4.2. Динамика структурной организации хроматина в процессе репликации
4.2.1. Визуализация репликативных сайтов в контексте интактного хроматина.
4.2.2. Пост-репликативная реорганизации хроматина 171
4.2.3. Ультраструктура хроматина в сайтах репликации 175
4.2.4. Топология реплисом в реплицирующемся хроматине
4.3. Особенности структурной организации рано- и позднореплицирующихся доменов хроматина в составе митотических хромосом .
4.4. Динамика высших уровней организации хроматина при активации транскрипции.
4.4.1. Создание трансгенных клеточных линий с множественные копии бактериальных искусственных хромосом, содержащих локусы DHFR, МТ и Hsp70.
4.4.2. Индукция транскрипции в трансгенных локусах. 220
4.4.3. Изменения степени компактизации высших уровней организации хроматина при индукция транскрипции.
4.4.4. При ингибровании транскрипции деконденсация высших уровней упаковки хроматина блокируется или существенно ослабляется.
4.4.5. Тепловой шок стимулирует ассоциацию трансгена Hsp70 с кластерами интерхроматиновых гранул.
4.4.6. Подвижность транскрипционно-активных локусов 2 4.5. Высшие уровни упаковки хроматина, выявляемые в ходе 250 естественной компактизации хромосом в митозе.
4.6. Роль ионов Са в стабилизации высших уровней 262 компактизации ДНК
4.7. Динамика рекрутирования и хромосомная локализация 273
конденсинов в ходе профазной компактизации хромосом.
4.8. Исследование поведения конденсинов при искусственном 287
изменении степени компактизации хромосом в живых клетках
4.8.1, Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках при искусственной декомпактигации хромосом в условиях обратимого гипотонического шока.
4.8.2. Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках после воздействия цитостатиков.
4.9. Конденсировый комплекс в мейозе. 296
4.9.1. Ядерная локализация конденсинов в профазе мейозаI
4.9.2. Дифференциальная ассоциация субъединиц конденсинов с профазными мейотическими хромосомами
4.9.3. Независимое рекрутирование субъединиц 304
конденсинового комплекса в нехроматиновые домены
ядра.
5. Заключение 313
6. Выводы 321
7. Благодарности 324
8. Список цитированной литературы
- Линейная неоднородность митотических хромосом
- Взаимосвязь транскрипционной активности генов с пространственной организацией интерфазного ядра: хромосомные территории
- Получение хромосомных препаратов и дифференциальная окраска хромосом
- Особенности структурной организации рано- и позднореплицирующихся доменов хроматина в составе митотических хромосом
Линейная неоднородность митотических хромосом
Концепция петлевой организации хромосом эукариот предполагает существование специфических архитектурных элементов, которые селективно связываются со определенными последовательностями ДНК, располагающимися в основании петель ДНК. В качестве таких архитектурных элементов принято рассматривать компоненты ядерного матрикса и скэффолда митотических хромосом. Соответственно, участки прикрепления петель к матриксу/скэффолду получили название MAR/SAR (matrix or scaffold associated regions).
Препараты ядерного матрикса с фрагментами ДНК получают путем ДНКазного гидролиза и последующей экстракции хроматина концентрированными солевыми растворами (Berezney, Coffey, 1974). По структуре ядерный матрикс гетерогенен - он включает остаточное ядрышко, внутриядрную фибро-гранулярную сеть и ламину. Такие воздействия, по мнению ряда авторов, приводят к неспецифической агрегации негистоновых белков (Aaronson, Blobel, 1975; Hadlaczky et al, 1981; Galcheva-Gargova et al, 1982; Cook, 1988; Jack, Eggert, 1992). Более того, препараты ядерного матрикса, полученные в результате экстракции в присутствии EDTA (Krachmarov et al, 1986; Cockerill, Garrard, 1986; Boulikas, Kong, 1993) или в присутствии Mg (Obi et al, 1986; Xu et al., 1994) имеют разный состав. Предварительная обработка ядер окисляющими агентами, которые стабилизируют дисульфидные связи, приводит к увеличению содержания белков во фракции ЯМ, тогда как присутствие антиоксидантов приводит к обеднению белкового состава ЯМ (Kaufmann et al, 1991; Stuurman et al; 1992). Существенную роль в стабилизации ядерного матрикса, по-видимому, играют также ионы двухвалентных металлов, входящих в состав металлопротеинов (Lewis, Laemmli, 1982; Lebkowski, Laemmli, 1982; Chiu et al, 1993).
Ультраструктурные исследования показали, что различия в процедурах получения ядерного матрикса приводят к существенным изменениям его морфологии. Предварительная обработка гипотоничным раствором, РНКазой или антиоксидантами приводит к деполимеризации внутриядерной сети негистоновых белков, оставляя только комплекс ядерной поры-ламины (Krachmarov et al, 1980; Kaufmann et al, 1981; Bouvier et al, 1982; 1985; Smith et al, 1982; Smith, Berezney, 1982; Kaufmann, Shaper, 1984; Fields et al; 1986).
Несколько иная процедура получения ядерного матрикса была предложена группой Laemmli (Mirkovich et al, 1984). Этот метод использует экстракцию гистонов хаотропным агентом 3,5-дииодосалицилатом лития (LIS) при низкой ионной силе, что, по мнению авторов, должно предотвратить неспецифическую агрегацию белков, в первую очередь транскрипционных комплексов (Kirov et al, 1984; Mirkovich et al, 1984; Roberge et al, 1988). Сравнительный анализ матриксов, изолированных при помощи солевой экстракции и с применением LIS показал, что в последнем случае сохраняется гораздо меньшее количество белков (Smith et al, 1987). Ультраструктурный анализ показал, что остаточные структуры ядра в этих условиях не содержат ядрышек и внутренней фиброгранулярной сети, если в ходе выделения не использовались специальные методы химической или тепловой стабилизации (Smith et al, 1987; Belgrader et al, 1991).
Поскольку экстракция концентрированными солевыми растворами может вызывать неспецифическую агрегацию белков, а обработка LIS может разрушать существующие взаимодействия ДНК с матриксом, была предложена модифицированная процедура получения ядерных матриксов при физиологических ионных условиях (Jackson, Cook, 1985, 1986). Она включает инкапсуляцию клеток в агарозные шарики для предотвращения агрегации хроматина и последующую пермеабилизацию и расщепление ДНК нуклеазами. Фрагменты хроматина затем удаляются из ядер при помощи электроэлюции. Оказалось, что связанная с матриксом ДНК, полученная после такой процедуры, по своему составу практически идентична ДНК из препаратов, полученных методом солевой экстракции. Вдобавок, данный метод также не использует гипотонических обработок, необходимых для получения очищенных препаратов ядер, которые, как было показано, способствуют возникновению артефактных взаимодействий ДНК с матриксом (Jackson et al, 1990). Следует отметить, что не только метод экстракции, но и последовательность процедур в ходе выделения (нуклеазная обработка до или после экстракции гистонов 2 М NaCl или LIS) влияют на структуру и состав ЯМ (Mirkovich et al, 1984; Cockerill and Garrard, 1986). Вероятно, это связано в частности с ограничением в доступности ДНК для нуклеаз в интактном хроматине.
Структура и некоторые свойства скэффолда митотических хромосом также зависят от условий выделения. В связи с этим, в ряде работ скэффолд рассматривается как артефакт, связанный с неспецифической агрегацией негистоновых белков в растворах с высокой ионной силой. При экстракция гистонов в мягких условиях, препятствующих агрегации, \ осевых структур хромосом получить не удается (Okada, Comings, 1980; Hadlaczky et al, 1981; Labhart et al; 1982). Вместо этого в таких препаратах обнаруживаются хаотично рассеянью мелкие гранулярные остаточные структуры (Hadlaczky et al, 1981, Nasedkina, Slesinger, 1982).
С другой стороны, осевые структуры митотических хромосом можно выявить не только на электронномикроскопических препаратах (Adolph et al., 1977; Paulson, Laemmli, 1977; Mullinger, Johnson, 1979, 1980; Earnshaw, Laemmli, 1983; Paulson, 1989), но и на светооптическом уровне, например, после селективного окрашивания неэкстрагированных хромосом (Howell, Hsu, 1979; Satya-Prakash et al, 1980; Burkholder, 1983; Earnshaw, Laemmli, 1984; Earnshaw, Heck, 1985) или после экстракции гистонов (Jeppesen et al, 1978; Gooderham, Jeppesen, 1983). Важно подчеркнуть, что даже в таких препаратах, где скэффолд хромосом четко визуализуется, его протяженность в 2-3 раза превышает длину интактной хромосомы (Gooderham, Jeppesen, 1983; Paulson, 1989).
Сравнительный анализ многочисленных данных показывает, что ядерный матрикс и скэффолд митотических хромосом значительно различаются по своему составу. В первую очередь, хромосомы лишены ламины, тогда как многими исследователями этот компонент ядра рассматривается как основная структура, заякоривающая петлевые домены ДНК (Luderus et al, 1994). В то же время, имеется ряд белков, общих для обоих структур. Если индивидуальные петлевые домены являются стабильными единицами структурной организации генома и остаются неизменными в клеточном цикле, следует ожидать, что именно компоненты, общие для обоих структур, определяют структурную целостность доменов. В этом случае способность матрикса и скэффолда связываться с ДНК должна быть идентичной. Так, было показано, что из семи протестированных MAR дрозофилы все с высокой эффективностью связываются с матрисом и скэффолдом in vitro, и некоторые из них демнстрируют аффинитет к препаратам скэффолда метафазных хромосом HeLa (Mirkovich et al, 1988). Эти данные позволяют предположить, что по крайней мере некоторые MARs дрозофилы не взаимодействуют непосредственно с ядерной ламиной. Это несоответствие можно объяснить тем, что у этого объекта имеется только один тип ламинов и, ссответственно, меньше разнообразия возможных типов взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой. Таким образом, вопрос о существовании матрикса и скэффолда как константной ригидной структуры в нативных ядрах и хромосомах остается открытым. Можно предположить, что петлевые домены взаимодействуют не с нерперывным остовом, а с дискретными белковыми комплексами.
Взаимосвязь транскрипционной активности генов с пространственной организацией интерфазного ядра: хромосомные территории
Приведенные выше примеры указывают на то, что функциональное состояние генов связано не только локальной конформацией высших уровней упаковки хроматина, но и от надхромонемной организацией интерфазных хромосом, высшим проявлением которой можно считать хромосомные территории — дискретные области ядра, занимаемые индивидуальными хромосомами и разделенные межхромосомным пространством (см. Cremer et al, 2006). Изначально концепция компартментализации ядерного пространства на изолированные хромосомные территории, предложенная Бовери еще в 1909 году (Bovery, 1909), получила свое экспериментальное подтверждение в результате наблюдений за распределением повреждений ДНК, индуцированных ультрафиолетовым микрооблучением локальных областей ядра (Zorn et al, 1979; Cremer et al, 1982), а также в экспериментах по изучению сегрегации радиоактивно меченых молекул ДНК в ряду клеточных делений (Онищенко и др., 1972). В дальнейшем существование хромосомных территорий было подтверждено при помощи методов FISH (Cremer et al., 1988, 1993; Lichter et al, 1988; Manuelidis, 1985, 1990; Pinkel et al., 1988; Schardin et al., 1985). При этом оказалось, что индивидуальные хромосомные территории располагаются неслучайно как в радиальной системе координат (центр-периферия), так и относительно друг друга (см. Parada, Misteli, 2002; Bolzer et al, 2005), что может обуславливать неслучайную частоту транс-взаимодействий между различными хромосомами (Bickmore, Tiague, 2002; Parada et al, 2004).
Более детальный анализ локализации субхромосомных доменов и отдельных генов в составе хромосомных территорий также выявил корреляцию между расположением генов на поверхности или внутри хромосомной территории и их транскрипционной активностью. Так, методом FISH было показано, что транскрибирующиеся гены располагаются преимущественно на поверхности территорий, в первую очередь обращенных к центральной зоне ядра (Kurz et al, 1996; Mahy et al, 2002; Bridger et al., 1998, 2005; Gorisch et al., 2003, 2005; Reichenzeller et al., 2000). В ряде случаев наблюдалось перемещение генов из внутренних районов хромосомных территорий на их поверхность при активации и наоборот (Dietzel et al, 1999; Brown et al, 1997, 1999; Schubeler et al, 2000). Более того, в некоторых исследованиях было показано, что активно транскрибирующиеся гены могут покидать область соответствующей хромосомной территории и выпетливаться в межхромосомное пространство (Mahy et al, 2002; Brown et al, 2006; Volpi et al, 2000; Williams et al, 2002; Chambeyron, Bickmore, 2004; Morey et al, 2007). Bee эти наблюдения обычно интерпретируются в пользу представлений о том, что граница хромосомной территории представляет собой диффузионный барьер для макромолекул, в первую очередь, для факторов транскрипции. Как следствие, перемещение генов между двумя субкомпартментами хромосомной территории является механизмом контроля генной экспрессии. Однако некоторые исследования показали, что большие макромолекулы могут свободно проникать внутрь компактного хроматина (Verschure et al, 2003; Chen et al, 2005; Bancaud et al, 2009). Более того, детальный анализ колокализации хромосомных территорий и транскрипционных сайтов выявил, что значительное число последних обнаруживается во внутренних областях хромосомных территорий (Verschure et al, 1999; Sadoni, Zink, 1999; Mahy et al, 2002). Таким образом, хромосомные территории не являются гомогенными с точки зрения плотности упаковки хроматина в их составе, что хорошо соответствует описанным выше особенностям внутриядерного распределения хроматиновых доменов на электрономикроскопическом уровне. По-видимому, с точки зрения регуляции транскрипции на уровне упаковки хроматина более важную роль играет локальная организация хроматиновых доменов высшего порядка, нежели структура хромосомной территории в целом.
С другой стороны, периферическая локализация активных генов на границе межхромосомного компартмента обеспечивает их предпочтительную связь с ядерными тельцами (кластеры интерхроматиновых гранул, транскрипционные фабрики) (Smith et al, 1999; Shopland et al, 2003, Osborne et al, 2004; Moen et al, 2004; Brown et al, 2006; Cope etal, 2010).
Ряд наблюдений, полученных с помощью крио-FISH, дающей существенное улучшение разрешающей способности FISH-анализа, показывает, что выход генов за пределы хромосомной территории, визуализуемой методом FISH, носит не спорадический, а массовый характер, что выражается, во-первых, в размытии границ индивидуальных хромосомных территорий, а во вторых, в значительном «перемешивании» генных локусов, принадлежащих разным хромосомам (Branco, Pombo, 2006; Pombo, 2007). Подобное перемешивание наблюдалось и ранее при анализе взаимного расположения репликативно-меченых хроматиновых по доменов (Visser et al, 2000). Некоторые наблюдения указывают на то, что взаимодействие удаленных генных локусов не только связано с их транскрипцией как таковой, но является важным элементом корегуляции функционально связанных генов (LaSalle, Lalande, 1996; Spilianakis et al, 2005; Lomvardas et al, 2006; Ling et al, 2006; Xu et al, 2006; Baher et al, 2006). И в этом случае позиционирование генов на поверхности хромосомных территорий также существенно для установления транс-взаимодействий.
Также в соответствие с ультраструктурными данными о распределении эу- и гетерохроматина. более деконденсированное состояние и более центральное положение в ядре характерны для богатых генами хромосомных территорий (Croft et al, 1999), субтерриторий (Goetze et al, 2007) и индивидуальных генных локусов (Zink et al, 2004, Shopland et al, 2006). При этом пространственная сегрегация богатых генами и бедных генами хромосомных локусов и взаимодействие функционально сходных участков хромосом, принадлежащих одной хромосоме или даже разным хромосомам, могут служить основой для создания специфических микроокружений, способствующих активации или репрессии транскрипции (Shopland et al, 2006; Simonis et al, 2006; Lieberman-Aiden et al, 2009).
Получение хромосомных препаратов и дифференциальная окраска хромосом
Для специфического мечения сайтов репликации и пострешшкатив-ной организации хроматина с сохранением максимальной нативности хроматина мы использовали два экспериментальных подхода. Сайты, где происходит синтез ДНК мы визуализовли при помощи экспрессии в клетках культуры тканей химерного белка EGFP-PCNA (Leonhard et al, 2000). Экспресия EGFP-PCNA осуществлялась в режиме временной трансфекции, а также была получена стабильная линия, экспрессирующая EGFP-PCNA.
В последнем случае EGFP-PCNA (Leonhard et al. 2000) был переклонирован в вектор, содержащий ген устойчивости к генетицину (см. Материалы и методы). Нашей задачей было получение клеточной линии, экспрессиру-ющей целевой белок на достаточно высоком уровне, пригодном для надежной визуализации сайтов репликации на электронномикроскопическом уровне. В то же время, экзогенный белок не должен интерферировать с нормальным процессом репликации и нарушать клеточную физиологии. Поэтому полученные стабильные клоны в первую очередь тестировали на предмет внутриядерного распределения химерного белка, а также проверялись параметры клеточного цикла (продолжительность S-фазы, динамика смены паттернов репликации и т.п.) На рис. 4.2.1 показаны результаты ло Рис.4.2.1. Паттерны репликации, выявляемые по флуоресценции EGFP-PCNA
Динамика смены паттернов репликации в живых клетках линии СНО, экспрессирующих EGFP-PCNA. кализации EGFP-PCNA в интактных клетках СНО. Наблюдаемые в ядрах паттерны распределения PCNA хорошо соответствуют описанным для данной клеточной линии типам распределения сайтов репликации (O Keefe et al., 1992; Li et al, 1998): для ранней S-фазы характерно более-менее равномерное распределение мелких фокусов в центральной области ядра (за ис-ключением ядрышка) (т.н. Паттерны 1 и 2), в средней S-фазе сайты репликации располагаются преимуществено по периферии ядра и вокруг ядрышек (паттерн 3), в поздней S-фазе реплицируются крупные блоки гетеро-хроматина, число которых прогрессивно снижается (паттерны 4, 5). Измерение продолжительности фаз клеточного цикла при помощи отложенной метки БрдУ, а также анализ динамики паттернов репликации, проведенный на клеточной популяции, синхронизированной на границе G1/S, показали, что продолжительность отдельных периодов S-фазы и ее суммарная длительность (6-7 часов) не отличаются у контрольных клеток, и клонов, стабильно экспрессирующих EGFP-PCNA. Такие же результаты были получены и при прижизненном наблюдении за динамикой паттернов репликации в полученных нами линиях (рис.4.2.3).
Наконец, решающим подтверждением того, что в полученных клеточных линиях EGFP-PCNA действительно локализуется в сайтах репликации может служить включение в EGFP-позитивные фокусы меченых дез-оксинуклеотидов. На рис. 4.2.3 представлен монтаж, иллюстрирующий взаимное расположение EGFP-PCNA и сайтов синтеза ДНК, меченых при помощи импульсного (5 мин) включения EdU (Salic, Mitchison, 2008, Buck et al, 2008). Детекция данного производного уридина осуществлялось при помощи катализируемой ионами меди клик-реакции с азидом флуорохрома А1еха-594. Благодаря малому размеру меченой молекулы структура двойной спирали ДНК не является стерическим препятствием, поэтому в отличие от использования антител против галогенпроизводных нуклеотидов, денатурации ДНК не требуется. Это обстоятельство очень важно для исследования организации реплицирующегося хроматина с высоким разрешением, поскольку позволяет максимально сохранить его нативную структуру. Как видно из рис. 4.2.3., EGFP-PCNA и EdU демонстрируют практически полное совпадение на всех стадиях S-фазы. Данные визуальной инспекции подтверждаются статистическим анализом ЗБ-колокализации, представленным на рис. 4.2.6А. Таким образом, можно утверждать, что в созданных нами клеточных линиях EGFP-PCNA располагается исключительно в сайтах репликации и может быть использован в качестве маркера для визуализации репликативных фокусов.
Для анализа взаимного расположения и динамики новореплициро-ванного хроматина относительно репликативных фокусов мы использовали клетки, находящиеся в средней и поздней S-фазе. Данный выбор диктуется следующими соображениями: во-первых, в ранней S-фазе большое количество мелких репликативных фокусов затрудняет анализ из-за высокой вероятности случайной колокализации новосинтезированной ДНК и сайтов репликации. Не в последнюю очередь это связано с ограниченным пространственным разрешением флуоресцентного микроскопа. Во-вторых, в начале S-фазы реплицируется преимущественно транскрипционно-актив Рис. 4.2.4. Колокализация новосинтезированнои ДНК (красный) и PCNA-позитивных репликативных фокусов при импульсном (5 мин) мечении ЭдУ в поздней S-фазе. Тотальная ДНК окрашена ДАПИ (синий).
(А) Большее увеличение фрагмента ядра из рис.4. демонстрирующее колокализацию фокусов PCNA и сайтов репликации, меченых ЭдУ, в клетках СНО при импульсном (5 мин) мечении; (Б) профили интенсивностей флуоресценции ДАЛИ (синий), EGFP-PCNA (зеленый) и ЭдУ-А1еха 594 (красный). ный эухроматин, характеризующийся более низкой степенью компактизации (O Keefe et al., 1992), в то время как нашей основной целью является исследование репликативнои динамики высших уровней компактизации ДНК, практически отсутствующих в эухроматине.
В связи с этим в настоящей работе были использованы эксперименты с отложенной меткой ЭдУ. Предшественник синтеза ДНК вводили в среду инкубации на 5 мин, затем отмывали клетки свежей средой и фиксировали немедленно или инкубировали в среде, содержащей 1 мМ тимидина в течение 20, 30 или 120 мин. Клетки перед фиксацией пермеабилизовали 0.1% Тритоном Х-100 на конденсирующем буфере для стабилизации высших уровней организации хроматина и фиксировали 3.7% формальдегидом. Как уже отмечалось выше, при импульсном мечении наблюдалась полная коло-кализация сайтов включения ЭдУ и PCNA-позитивных фокусов, которые представляли округлые или эллипсовидные структуры размером 0.2-0.3 мкм. В ряде случаев близко расположенные индивидуальные репликатив
Анализ колоколизации репликативных сайтов, меченых EGFP-PCNA (зеленый) и реплицированного хроматин, меченого ЭдУ-Алекса 592, в экспериментах с отложенной меткой. ные фокусы сливались в более крупные агрегаты (рис. 4.2.4). Поскольку в данных экспериментальных условиях структура хроматина хорошо сохраняется, хорошо видно, что репликативные фокусы представляют собой сегменты фибриллярных хроматиновых структур высшего порядка и чаще всего полностью совпадают с ними по диаметру. Случаи, когда на индивидуальных оптических срезах репликативные фокусы располагались на поверхности хроматиновых доменов, чаще всего связаны с низким аксиальным разрешением используемой микроскопической системы и при оптимальной фокусировке также полностью совпадали с сечениями хромонем. Важно отметить, что интенсивность флуоресценции ДАПИ непосредственно в местах расположения репликативных фокусов оказывалась несколько ниже, чем в соседних хроматиновых доменах с теми же линейными параметрами (рис. 4.2.5). Это может быть связано с частичной деконденсацией хроматина в реплицирующихся сегментах хромонемы.
Одновременно с удалением реплицированного хроматина от сайтов репликации во многих случаях наблюдаются изменения в структурной организации реплицированных локусов. Если при импульсном мечении реплицированный хроматин организован в виде округлых или эллипсоидных доменов, то через 20 мин после мечения он принимает более вытянутую конфигурацию. Иногда можно наблюдать достаточно протяженные сегменты (фибрилл высшего порядка, гомогенно меченые по всей длине. Подобные изменения распределения метки, по нашему мнению, не связаны с продолжающимся включением ЭдУ из внутриклеточного пула, не полностью удаленного при отмывке, поскольку при более коротких интервалах между мечением и фиксацией не наблюдается увеличения интенсивности мечения, а также не происходит сегрегации метки от сайтов репликации (по крайней мере, на том уровне разрешения, с которым производилось исследование, не иллюстрировано). В связи с этим можно предположить, что наблюдаемые в экспериментах с отложенной меткой изменения конфигурации меченых сайтов отражают пост-репликативную перестройку высших уровней организации хроматина.
Увеличение интервала между введением метки и фиксацией вплоть до 2 часов сопровождается дальнейшей сегрегацией и снижением коэффициента колокализации между GFP-PCNA и EdU, меченым А1еха-594 (рис. 4.2.6). В этих случаях фибриллярная структура реплицированных сегментов хроматина становится еще более выраженной (рис. 4.2.9, 4.2.10).
Особенности структурной организации рано- и позднореплицирующихся доменов хроматина в составе митотических хромосом
Восстановление структуры хромосом в клетках, обработанных глутаровым альдегидом, можно стимулировать обработкой кальциевым ионофором А23187. При добавлении ионофора в концентрации 1 мкМ через 15-20 мин после начала действия гипотонического шока происходит быстрая реконденсация хромосом и восстановление структуры хромонемных элементов (рис. 4.6.3).
Влияние добавления ионофора на процесс реконденсации хромосом в клетках, обработанных глутаровым альдегидом, указывает на возможную роль ионов Са в формировании и поддержании структуры высших уровней организации хромосом. Отсюда также следует, что гипотоническое воздействие на живые клетки должно приводить к изменениям внутриклеточной концентрации Са, и эти изменения должны коррелировать с изменениями структурного состояния хромосом. Для того, чтобы установить эту связь, мы провели оценку-2. Как показали измерения, снижение осмолярности среды сопровождается резким падением концентрации свободного С а, однако затем по мере адаптации уровень Са возвращается на исходный уровень в течение 5-10 мин (рис. 4.6.4, кривая (А)). Если измерения производились в присутствие глютарового альдегида, подобного восстановления не наблюдалось, и динамики внутриклеточной концентрации свободного Са в процессе гипотонической обработки пр помощи измерения флуоресценции Са-зависимого флуорохрома Fura пониженная концентрация Са сохранялась в течение по крайней мере 20 мин (рис. 4.6.4. (кривая (Б)). Добавление ионофора А23187 приводило к резкому повышению концентрации Са до уровня, превышающего исходный (рис. 4.6.4). Это повышение концентрации Са, как было показано выше, сопровождалось быстрой реконденсацией хромосом (рис. 4.6.3).
В ряде исследований было показано, что ионы Са играют важную роль в регуляции митоза в клетках растений и животных (Hepler, 1989). В живых клетках многие зависимые от Са процессы опосредованы участием различных ферментативных систем, в том числе киназных каскадов (Planas-Silva, Means, 1992). Помимо этого, Са может, по всей вероятности, Са непосредственно влиять на структуру хроматина и митотических хромосом, в результате чего, степень компактизации хромосом прямо зависит от концентрации Са в среде инкубации (Zatsepina et al, 1983). Однако, концентрации Са (2 10-4 М), используемые для стабилизации структуры хроматина in vitro, на несколько порядков превышают реальную концентрацию внутри клетки (Whitaker, Patel, 1990). Более того, инъекция примерно такой же концентрации Са в живую клетку приводит к ее быстрой гибели. Конденсирующий эффект Са на структуру хромосом в условиях, близких к физиологическим, требует дополнительного исследования. Предложенная в данной работе экспериментальная модель позволяет анализировать эффекты физиологических концентраций Са на структурную организацию хромосом и интерфазного хроматина. По данным литературы, внутриклеточная концентрация Са не должна превышать 1.8 мкМ, а в среднем составляет 0.5 мкМ (Swann, Whitaker, 1986; Whitaker, Patel, 1990). Однако в изолированных хромосомах и интерфазных ядрах при концентрации Са в интервале 100-150 мкМ, что значительно превышает физиологически релевантные концентрации, хроматинмнаходится в полностью декомпактизованном состоянии. Можно предложить по крайней мере два объяснения тому факту, что в живых клетках физиологических концентраций Са достаточно для поддержания хроматина в конденсированном состоянии. Во-первых, в живых клетках эффект Са может быть опосредован специфическими Са-связывающими структурными белками хроматина, которые непрочно связаны с хроматином и легко экстрагируются в процессе выделения хромосом и ядер. Действительно, в составе хромосом был идентифицирован целый ряд Са-связывающих белков, в том числе, к таковым относится, по некоторым данным, и топоизомераза II (Lebkowski, Laemmli, 1982; Lewis, Laemmli, 1982; Strik et al, 2001).
Во-вторых, действие Са может быть основано на его участии в регуляции энзиматических систем, например, протеинкиназ, фосфорилирующих гистоны. В пользу этого предположения свидетельствует тесная корреляция между уровнем компактизации хромосом в митозе и степенью фосфорилирования гистонов HI и НЗ (Prigent, Dimitrov, 2003) . Однако, вне зависимости от того, каков механизм действия Са, важным является то, что высшие уровни организации хроматина, образующиеся в результате действия ионофора А23187, полостью соответствуют структурным элементам хроматина, наблюдаемым in situ (см. выше) или восстанавливающимся при естественной адаптации клеток к гипотонии (Киреев и др., 1988). Сходные структурные элементы выявляются в составе хромосом и интерфазных ядер и in vitro при постепенном снижении концентрации Са (Zatsepina et al., 1983; Зацепина и др, 1985). Таким образом, эти наблюдения, на наш взгляд, являются сильным аргументом в пользу адекватности используемых условий для стабилизации хроматина in vitro и правомерности экстраполяции данных ультраструктурного анализа изолированных хромосом и ядер на нативную организацию хроматина in vivo.
