Содержание к диссертации
Список сокращений 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Фенотипические изменения у трансгенных мышей 9
в эмбриогенезе и в перинатальном периоде
Неопластические изменения у трансгенных мышей 12
Канцерогенез у трансгенных мышей с генами семейства туе 12
Опухоли разного гистогенеза у трансгенных мышей 17
Динамика канцерогенеза в ряду поколений трансгенных мышей 21
Гомологичная рекомбинация 25
Трансгенные мыши с автономно реплицирующимися трансгенами 28
Изучение количественных полигенных признаков у ірансгенньїх ЗI
мышей
Изучение росто-весовых параметров у трансгенных мышей ЗI
1. Изменения веса тела у трансгенных мышей 3 J
. Изменения роста у транс генных мышей 35
Наследуемость количественных полигенных признаков 40
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Получение трансгенных мышей 44
Микроинъекции плазмид в одноклеточные эмбрионы 46
Выявление трансгенных мышей 48
Изучение неопластического роста у трансгенных мышей
gag-myc F3-F4 ' 53
Выявление гомологичной рекомбинации ДНК в геноме трансгенных
мышей пео 53
Изучение количественных полигенных признаков у трансгенных 54
мышей
Изучение наследуемости количественных полигенных признаков 55
у трансгенных мышей
РЕЗУЛЬТАТЫ
Нарушения нормального эмбриогенеза у трансгенных мышей gag-myc 56 F3-F4
Гиперпластические и неопластические изменения у трансгенных
мышей gag-myc F3-F4 56
Изучение гомологичной рекомбинации ДНК в геноме трансгенных 75
мышей пео
Изучение количественных полигенных признаков у 77
трансгенных мышей
Количественные полигенные признаки у трансгенных 77
мышей gag-myc F3-F4
Количественные полигенные признаки у трансгенных
мышей пео 82
Количественные полигенные признаки у трансгенных
мышей ars 99
Наследуемость количественных полигенных признаков у
трансгенных мышей 112
ОБСУЖДЕНИЕ 115
ВЫВОДЫ 138
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 140
Список используемых сокращений
дов. инт. - доверительный интервал
МТ - металлотионеин
нед - неделя
НТМ - нетрансгенные мыши
мес - месяц
сут- сутки
CV — коэффициент вариации
ТМ — трансгенные мыши
ТМ ars - трансгенные мьгага с автономно реплицирующимся вектором
ТМ gag-myc - трансгенные мыши с геном gag-myc
ТМ пео - трансгенные мыши с геном
аминогликозидфосфорибозилтрансферазы
DMSO - диметилсульфоксид
IGF - инсулиноггодобный фактор роста
LTR - длинный концевой повтор
MMTV — вирус опухоли молочной железы мыши
Введение к работе
Трансгенные животные используются в иммунологических и эмбриологических исследованиях. С помощью генетической трансформации лабораторных животных удается подойти к решению многих проблем молекулярной биологии, генетики, медицины, сельского хозяйства, биотехнологии, включая проблемы генной регуляции, функционирования онкогенов и иммунной системы. Трансгенные животные служат моделями для изучения различных патологических состояний, в том числе наследственных. Широкое применение трансгенные животные нашли в экспериментальной онкологии (Shvemberger, Ermilov, 1996; Anisimov, 2001; Jackson-Grusby, 2002), для выяснения способности онкогенов к синергизму в опухолевой трансформации клеток. Получение генетически модифицированных организмов животных развивается также с целью получения животных-«биореакторов», продуцентов терапевтически важных агентов (Wolf et al., 1997); получения клеточных популяций, способных преодолевать барьер «трансплантат против хозяина»; создания модифицированных животных для исследований и др. Ранние работы, выполненные на трансгенньгх мышах, фокусировавшиеся главным образом на изучении контроля экспрессии и ее тканеспецифичности на уровне организма, привели к одной из основных концепций современной молекулярной биологии, согласно которой регуляториые элементы транскрипции являются основными факторами, определяющими тканеспецифичиость экспрессии генов (Свердлов, 1996).
Введение различных онкогенов в зародышевую линию мышей, как правило, приводило к развитию у них различных опухолей (Shvemberger, Ermilov, 1996; Anisimov, 2001). Однако в большинстве опубликованных работ приведены только данные, полученные в результате наблюдения трансгенных мышей (ТМ) Fo, а также мышей первых поколений. В то же время представляет интерес влияние чужеродной генетической информации в геноме на организм трансгенных потомков. При этом важно изучение влияния нового генетического материала на фенотип животного, полиморфизм проявления нового качества в популяциях трансгенных животных и повторяемость ответа на изменение гомеостаза у них (Gama et al., 1992). Как было показано на примере изучения мобильных диспергированных элементов, несмотря на то, что фиксация в популяции ретропозонной инсерции или недавней рстропозонной перестройки занимает
несколько тысяч лет, даже "незакрепленный" генетический материал способен вызывать изменение в фенотипе, и в некоторых случаях проследить его воздействие легче на фенотип в целом, чем на какой-либо отдельный признак (Tomilin, 1999).
Изучение потомства трансгенных животных представляется важным для прогнозирования проявления заданного при введении определенного гена признака, а также для сохранение полученного фенотипа при селекции.
Работы по изучению росто-весовых параметров у ТМ проводились преимущественно с генами гормона роста (Clutter et al,, 1996; Ulshen et al., 1993; Wolf et al., 1991) и генами факторов роста (Murphy et al., 1995; Rajkumar et al., 1995). Однако работы, в которых бы изучалось влияние онкогена и "нейтральных" генов на количественные нолигенные признаки достаточно редки (Алимова, 2002).
До настоящего времени мало изучен полиморфизм проявления нового качества в популяциях трансгенных животных. По разным оценкам (Мазер, Джинкс, 1985), росто-весовые параметры вида контролируются сотнями генов. Большую роль на них оказывают внешние воздействия (материнский фактор, питание, состояние здоровья). Хотя введение одного гена и может вызвать изменения в росте или весе (Koops, Grossman, 1991), но генетическая передача этого изменения может и не произойти в последующих поколениях, поскольку эти количественные полигенные признаки - онтогенетически устойчивая система.
Исследования наследуемости росто-весовых параметров у трансгенных животных немногочисленны (Clutter et al., 1996; Siewerdt et al., 2000). В то же время не только экспрессия чужеродного гена, но и сам факт инсерции могут повлиять на фенотип трансгенных животных, в частности, на полигенные системы, определяющие вес и рост.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы заключалась в изучении фенотипнческих особенностей -способности к неопластическому росту и количественных полигенных признаков в потомстве трех групп трансгенных мышей с генами gag-myc, аминогликозидфосфорибозилтрансферазы (пео) и с автономнореплицирующимся вектором are.
Были поставлены следующие задачи:
Получить трансгенных мышей с генами gag-myc, пео и вектором ars.
Получить потомство трансгенных мышей с этими генами путем скрещивания трансгенных мышей с одной из родительских линий.
Изучить фенотипические изменения у трансгенных мышей в разные периоды жизни.
Изучить особенности неопластической трансформации у трансгенных мышей gag-myc F3-F4.
5. Выяснить возможность внутритрансгенной гомологичной рекомбинации у
трансгенных мышей с геном пео.
Изучить возможное неспецифическое влияние трансгенов gag-myc, пео и ars на систему количественных полигенных признаков, определяющих рост и вес животных.
Определить, наследуемость веса тела, длины тела, длины хвоста и общей длины тела у трансгенных мышей.
Основные положения, выносимые на защиту
Получены ТМ, содержащие в геноме ген gag-myc, ген пео и автономно реплицирующийся вектор ars.
Показано, что опухолеобразующая способность, наблюдавшаяся у ТМ gag-myc Fo-F2, сохраняется у ТМ gag-myc F3-F4. При этом увеличивается общее число развивающихся опухолей при сокращении их гистологического спектра за счет опухолей редких локализаций.
Выявлена внутрихромосомная гомологичная рекомбинация гена пео у трех поколений двух линий ТМ.
Проведено изучение вариабельности количественных полигенных признаков у ТМ gag-myc, пео и ars в разные возрастные периоды.
Научная новизна полученных результатов
Впервые получена онкологическая характеристика ТМ gag-myc F3-F4. Впервые показано, что способность к развитию опухолей у ТМ gag-myc сохраняется в F3-F4, но спектр развивающихся опухолей изменяется. Широкий спектр неопластической трансформации, наблюдавшийся у ТМ gag-myc в F0-F2, постепенно суживается в ряду поколений и к F3-F4, помимо опухолей кроветворной ткани наблюдалось развитие преимущественно эпителиальных опухолей эндокринных и экзокринных желез. Показано, что внутри трансгена {пео) может происходить гомологичная рекомбинация. Впервые изучено влияние трансгенов gag-myc, пео и ars на количественные полигенные признаки: вес тела, длина тела, длина хвоста и общая длина тела. Впервые получены ТМ пео и ars. Изучена наследуемость количественных полигенных признаков у ТМ gag-myc, пео и ars.
Теоретическое и практическое значение работы
Полученные данные показывают, что у ТМ gag-myc вплоть до четвертого поколения сохраняется достаточно широкий спектр неоплаети ческой трансформации, обнаруженной у ТМ gag-myc F0-F2. Выявленная у ТМ пео гомологичная рекомбинация внутри трансгена свидетельствует о том, что ТМ могут быть использованы для изучения рекомбинационных процессов в клетках разных органов и тканей в процессе их эмбрионального развития, при детерминации и дифференцировке тканей, и для выявления изменений в генетическом аппарате соматических клеток при их злокачественной трансформации и прогрессии опухолей. Присутствие в геноме мышей генов gag-myc, пео и автономно реплицирующегося вектора агз оказывает влияние на росто-весовые признаки ТМ не во всех изученных периодах жизни животных. Полученные данные позволяют сделать выводы о нестабильности динамики признаков, связанных с ростом и весом - вес тела, длина тела, длина хвоста и общая длина тела у ТМ с разными генами и о возможном влиянии «нейтральных» генов на количественные полигенные системы, определяющие рост и вес животных. Обоснована целесообразность использования коэффициента наследуемости количественных полигенных признаков у трансгенных организмов при выведении новых сортов растений и пород сельскохозяйственных животных.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 8 работ в отечественных и зарубежных изданиях. Материалы работы доложены и обсуждены на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 1992, 1996), Международной конференции «Новые направления в биотехнологии» (Москва, 1998), 5-ой Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», (Пущино, 2001), а также на научных семинарах Лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН.
Похожие диссертации на Влияние трансгенеза на неопластический рост и количественные полигенные признаки у мышей
