Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Организация генома эукариот 9
1.2. Особенности структуры сателлитн о К ДНК 10
1.3. Организация короткого плеча хромосом мыши 15
1.4. Роль тело мер в репликации эу кар иотических хромосом 17
1.5. Пространственное расположение центромерных и тсломсрных районов хромосом в интерфазных ядрах 18
1.6. Гетерохроматип и эффект положения 21
1.7. Эпигенетические механизмы формирования гетерохроматина 26
2. Материалы и методы 31
2.1. Плазми ды 31
2.2. Выделение плазм ид ной ДНК, электрофорез ДНК 31
2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 31
2.4. Культивирование клеток 31
2.5. Получение препаратов метафазных хромосом 32
2.6. Клеточная синхронизация, проточная цитофлюорометрия 32
2.7. Получение митотических хромосом из овулировавших ооцитов 32
2.8. Выделение ядер печени мыши 33
2.9. Выделение геномной ДНК мыши 33
2.10. Выявление сайтов репликации 33
2.11. Клонирование фрагментов ДИК фракции хромоцснтров 34
2.12. Секвинирование 34
2.13. Полимсрзиая цепная реакция 34
2.14. Получение меченых фрагментов ДНК 35
2.15. Компьютерный анализ клонированных последовательностей 35
2.16. Определение величины изгиба фрагментов ДНК 35
2.17. Гибридизация на фильтрах 35
2.18. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) 36
2.19. Олигомечение in situ со специфичными праймерами (PRINS) 37
2.20. Флюоресцентная и конфокальня микроскопия 38
2.21. Другие методы исследования 38
3. Результаты 39
3.1. Определение локализации центромерных и теломерных районов хромосом в интерфазных ядрах клеток в культуре 39
3.1.1. Синхронизация клеточной культуры L929 39
3.1.2. Морфология хромоцеитров 39
3.1.3. Локализация минорного, мажорного сателлита и теломер на метафазиых хромосомах клеток культуры L929 41
3.1.4. Распределение минорного, мажорного сателлита в интерфазных ядрах клеток культуры L929 в течение клеточного цикла 41
3.1.5. Локализация теломерной последовательности в интерфазных ядрах клеток культуры L929 в течение клеточного цикла 46
3.1.6. Локализация теломерной последовательности хромосом относительно минорного и мажорного сателлита в G0/G1 и S фазах клеточного цикла 49
3.2. Исследование структуры и локализации последовательностей MS3 и MS4 выделенных из фракции ДНК хром о центров мыши 52
3.2.1. Структура первичной последовательности MS3 и MS4 52
3.2.2. Анализ геномной организации MS3 и MS4 методом гибридизации по Саузерну и полимеразной цепной реакции 56
3.2.3. Оценка содержания MS3 и MS4 в геноме мыши 58
3.2.4. Сравнение степени изогнутости фрагментов сателлитных ДНК и их возможность формировать структуры подобные MAR 58
3.2.5. CENP-B бокс в последовательностях MS3 и MS4 62
3.2.6. Локализация MS3 и MS4 в интерфазных ядрах и метафазных хромосомах клеток линии L929 63
3.2.7. Локализация фрагментов сателлитиой ДНК в ядрах печени мыши 65
3.2.8. Определение положение последовательностей MS3 и минорного сатгсллита на препаратах преждевременно конденсированных хромосом 67
4. Обсуждение результатов 70
Выводы 89
- Особенности структуры сателлитн о К ДНК
- Выделение плазм ид ной ДНК, электрофорез ДНК
- Исследование структуры и локализации последовательностей MS3 и MS4 выделенных из фракции ДНК хром о центров мыши
- Локализация фрагментов сателлитиой ДНК в ядрах печени мыши
Введение к работе
Одной из важнейших задач биологии является изучение структурно-функциональной организации генома. На сегодняшний день известно, что клеточное ядро состоит из отдельных компартментов. К ним относится ядерная оболочка, ядрышко, хромосомные территории и интерхроматиновый компартмент, содержащий макромолекулярные комплексы, участвующие в репликации, транскрипции, постранскрипциониых модификациях РНК. Считается, что каждая хромосома в ядре занимает определенную область. Соседние хромосомные территории, изменяя свою пространственную конфигурацию в процессе жизнедеятельности клетки, не перекрываются друг с другом (Cremer, Cremer, 2001).
Хроматин центромерного и прителомерного районов хромосом в основном сформирован на основе сателлитной ДНК (сатДНК). СатДНК расположена в районах конститутивного гетерохроматина, для которого характерна транскрипционная инертность и поздняя репликация в S-фазе, повышенная плотность упаковки в интерфазном ядре, склонность к агрегации, обогащение повторами (Ilennig, 1999). Конститутивный гетерохроматин оказывает так называемый "эффект положения" па расположенные близ него гены (Brown et al., 1997).
При формировании архитектуры ядра центромерные и прицептромерные районы различных хромосом действуют как структурные центры для конденсации и декоиденеащш хроматина (Manuelidis, Borden, 1988). Показана агрегация центромерных районов как гомологичных, так и негомологичных хромосом человека (Alcobia et al., 2000), мыши (Radic et al., 1987), морских свинок (Гольдман и др., 1977). Гетерохроматиновые участки хромосом ассоциируют между собой специфичным для каждого типа клеток образом, образуя в иптсрфазных ядрах дискретные регионы — хромоцентры, сохраняющие свое конденсированное состояние в течение всей интерфазы (Fransz et a 1., 2003). Хромоцентры можно наблюдать как оптически плотные структуры (Куличков, Жимулев, 1976; Прокофьева-Б ел ьговская, 1986) или как DAPI (4, 6-диамидино-2-фенил индол) позитивные домены (Pardue, Gall, 1970; Franz et al., 2003).
Количество гетерохроматиновых блоков в интерфазном ядре всегда меньше количества гетерохроматиновых регионов в кариотипе, что говорит о возможной конъюгации этих районов (Прокофьева-Бельговская, 1986), Процесс, получивший название эктопической конъюгации, может играть ключевую роль в пространственной организации хромосом в интерфазном ядре (Manuelidis, Borden, 1988). Хромоцентры являются динамичными структурами, их размеры и число видо- и ткаисспецифичны и изменяются в течение клеточного цикла и при дифференцировке (Cerda ct al., 1999; Krzanowska, Bilinska, 2000). Методом электронной микроскопии показано, что хромоцентры контактируют с ядерной оболочкой и ядрышком (Comings, 1973). Данные структуры являются элементами ядерного матрикса и, следовательно, в составе хромоцснтров можно ожидать элементы хроматинового скелета. Хромосома имеет специфические участки закрепления на ядерной оболочке. Эту функцию в ядрах клеток мыши наряду с теломерным районом хромосом могут выполнять прицентромершле районы. Прицснтромерный район хромосом мыши состоит из массива мажорного сателлита (маСат) и имеет более плотную укладку, чем хроматин плеч хромосом, и менее плотную укладку относительно хроматина минорного сателлита (миСат) (Gilbert, Allan, 2001), локализованного непосредственно в области первичной перетяжки хромосом. Необходимо отметить, что хромосомы мыши являются акроцентрическими, их короткое плечо состоит из центромерной, субтеломерной и теломериой последовательностей ДНК.
При исследовании динамики и структуры хромоцентров различные авторы определяют их как структуры, ярко окрашенные DAPI, либо как конгломераты центромерных последовательностей (Alcobia et al., 2000), либо как центромерные и прицентромерные белковые конгломераты, выявляющиеся с помощью CREST сыворотки (Beil et al., 2002). В составе хромоцентров были обнаружены белки-сайленсеры транскрипции и белки, взаимодействующие с не кодирующим и последовательностями ДНК: TRF2, SAF-A/hnRNP-U (Lobov et al., 2001), CENP-B (Барсукова и др., 2001), НР1 (Scholzen et al., 2002).
Определения хромоцентров, существующие в литературе, свидетельствуют о том, что ни последовательности ДНК, входящие в них, ни белковый сосгав хромоцентров не описаны комплексно. В литературе нет исчерпывающего исследования положения клонированных тандемных повторов мыши по отношению к хромоцентрам на разных стадиях клеточного цикла. Исследования, проведенные в рамках этой работы, показали, что при использовании всех известных зондов значительная часть хромоцентров остается свободной от гибридизациошюго сигнала. Препарат хромоцентров, полученный в результате недавно разработанного метода (Прусов, Зацепина, 2002) был использован для клонирования входящую в него ДНК.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось как изучение вовлеченности известных клонированных сатДНК мыши и теломерной последовательности в структуру хромоцентров, так и поиск других последовательностей, входящих в состав хромоцентров ядер клеток Mus musculus.
Были поставлены следующие задачи:
1. Определить положение центромерпых (миСат), прицентромерпых (маСат) сатДНК и теломерной (Тел) последовательности Mus musculus по отношению к хромоцентрам па разных стадиях клеточного цикла в синхронизированной культуре клеток мышиных фибробластов L929.
2. Клонировать фрагменты выделенной ДНК хромоцентров мыши. Определить нуклеотидную последовательность отобранных клонированных фрагментов. Произвести поиск в базах данных последовательностей, гомологичных выделенным.
Охарактеризовать клонированные последовательности ДНК хромоцентров.
Определить локализацию клонированных фрагментов ДИК хромоцентров мыши на метафазных хромосомах и в интерфазных ядрах.
Основные положении, выносимые на защиту.
1. Центромерные, прицентромерные и теломерные районы хромосом меняют свое положение в течение клеточного цикла, входят в состав хромоцентров, однако не являются их основной составляющей.
2. Клонированные последовательности ДНК хромоцентров MS3 и MS4, локализованные в центромерном районе хромосом, являются новым типом сатДНК Mus musculus, обогащенной GC нуклеотидами. Их количество в геноме Mus musculus составляет 2,2% и 1,6% соответственно.
3. Суммарный сигнал всех сатДНК (маСат, миСат, MS3 и MS4) полностью не покрывает всю область хромоцентров.
Особенности структуры сателлитн о К ДНК
Впервые фракция сатДНК была обнаружена в 1961 году (Kit, 1961) при равновесном центрифугировании в градиенте плотности раствора хлористого цезия благодаря отличию се плавучей плотности от плавучей плотности фракции, не повторяющейся ДИК. Данные по ренатурации и денатурации молекул ДНК из ядер высших организмов показали, что в геномах высших организмов присутствует популяция сходных последовательностей нуклеотидов, многочисленные копии которых и обеспечивают высокую скорость реассоциации этих фракций ДНК (Britten, Kohne, 1968). Обнаружение сатДНК обусловлено тем, что многочисленные повторяющиеся последовательности нуклеотидов сгруппированы в кластеры. Если они рассеяны между блоков основной ДНК, так называемые скрытые сателлиты, выявить их как отдельный пик в градиенте плотности весьма затруднительно. СатДНК также можно выделить при обработке геномной ДНК эпдопуклеазами рестрикции (Manuelidis, 1976). Сателлиты с простой последовательностью, или собственно "классические" сателлиты", (сателлиты 1, 2, 3 человека) представлены последовательностями из мономеров длиной 5-15 нуклеотидов, например III сателлит человека с повторяющейся единицей GGAAT. Блоки сложной сатДНК состоят из мономеров значительно большей длины: 100-200 плі. Массивы сатДНК этой группы обычно располагаются непосредственно в области формирования кинетохора (т.е. в центромерном районе хромосом) или вплотную прилегают к нему (т.е. располагаются в прицентромерных участках) (Lee et al., 1997; Choo, 1997a). К сателлитам этой группы относится альфоидная (а-сателлитная) ДНК, ДНК у- и р-сателлитов человека (Manuelidis, 1976; Lee et al., 1997; Choo, 1997a), а также мажорный (маСат) и минорный (миСат) сателлиты мыши (Rattner et al., 1978). Огдельные мономеры в составе сатДНК могут различаться по нуклеотидпой последовательности заменами, делециями или инсерциями нескольких нуклеотидов. Так, альфоидное семейство сатДНК человека представлено сильно дивергироваными последовательностями с общим уровнем гомологии между последовательностями отдельных мономеров 60-80% (Willard, Wayc, 1987). От 2 до 18 мономеров альфоидного сателлита длиной 170-172 п.н. объединяются в повторы высшего порядка.
При этом повторы высшего порядка почти идентичны между собой (90 % и более процентов гомологии). Различные варианты повторов высшего порядка характерны для отдельных хромосом и могут формировать независимые блоки п составе одной хромосомы (Wevrick, Willard, 1991; Ikcno ct al., 1994; He ct al., 1998). Присутствие в составе центромерного района двух независимых, не перекрывающихся блоков альфоидной ДНК показано для хромосом человека 7, 21 и X (Wevrick, Willard, 1991; Ikeno et al., 1994; He et al., 1998) и, вероятно, свойственно другим хромосомам человека. МаСат и миСат домовой мыши (Mas musculus) весьма однородны по нуклеотидной последовательности: в маСат нуклеотидные последовательности мономеров различаются не более чем на 5 % (Vissel, Choo, 1989), а в миСат — примерно на 5.6 % (Kipling et al., 1994). Иерархическая организация, по-видимому, не характерна для этих сатДНК. Наличие хро.мосомо-специфичных вариантов миСат также показано лишь для некоторых хромосом (Kipling et al., 1994). МиСат и маСат имеют протяженные участки гомологичные на 83% (Wong, Ratlner, 1988). Помимо высокого уровня внутривидовой изменчивости, проявляющейся в наличии хромосомспецифичных вариантов последовательностей, для сатДНК также характерен высокий уровень межвидовой изменчивости. Так, два вида мыши Mus musculus и Mus spretus содержат различные количества одних и тех же сатДНК. В геноме Mus musculus обнаружено две сатДНК - маСат и миСат, — которые составляют около 5-10% и 1% от всей ядерной ДНК соответственно (Waring, Britten, 1966; Wong, Rattner, 1988). У Mus spretus соотношение между количествами маСат и миСат оказывается обратным (Pietras ct al., 1983), — преобладает сатДНК, гомологичная миСат (Narayanswami et al., 1992). Геном трегьего вида мыши - Mus caroli — содержит лишь незначительные количества сатДНК, гомологичной маСат (Pietras ct al., 1983), и не содержит миСат (Wong ct al., 1990). Однако в геноме этого последнего вида выявлено две других сатДНК с повторяющейся единицей длиной 60 и 79 п.н. (Kipling ct al., 1995). Последовательность маСат Mus musculus и Mus caroli сильно дивергирована (Sutton, McCallum, 1972). Однако, у видов Mus musculus и Mus spretus ДНК маСат консервативна, хотя и сильно редуцирована у Mus spretus (Dover et al., 1982). Общей чертой, объединяющей различные сатДНК, лок&тизованные в центромерном домене хромосом млекопитающих, несмотря па отсутствие гомологии, является наличие в их составе сайта связывания консервативного белка CENP-B (CENP-B бокса). СатДНК в составе прицентромерного домена не содержат или содержат меньше копий сайта связывания CENP-B (Willard, Waye, 1987; Wong, Rattner 1988; Trowel et al., 1993). CENP-B бокс выявлен при анализе центр ом ерных сатДНК далеких в эволюционном плане видов: человека (Masumoto et al., 1989; Muro et al,, 1992), Mus musculus и Mus caroti (Kipling et al., 1995), зеленой африканской мартышки (Goldberg et al., 1996), тупайи, гигантской панды, песчанки, хорька (Kipling, Warburton, 1997) и североафриканского грызуна Lemniscomys barbanis (Stitou et al., 1999). Наличие CENP-B бокса в сатДНК различных организмов и отсутствие других сходных мотивов между цен промерными ДНК различных видов позволяет предполагать ключевую роль CENP-B при формировании активного центромера (Choo, 1997а). Однако, против этой гипотезы говорят следующие факты: отсутсвие CENP-B бокса в альфоидной сателлитной ДНК (а-сатДНК) Y- хромосомы (Cooper et al., 1993), локализация белка во внутреннем центромерном домене кипстохора (Earnshaw et al., 1987; Sugimoto et al. 1999), наличие белка как в активном, так и в неактивном центромере (Earnshaw et al., 1989; Gimelli et al., 2000; Saffery et al., 2000) и его отсутствие в нсоцентромерах не содержащих ос-сат ДНК (Barry et al., 1999; Gimelli et al., 2000), жизнеспособность мышей с мутантным или выключенным геном сепрЪ (Hudson et al., 1998). По всей видимости, для формирования центромера необходимы и другие факторы, белок же CENP-B играет вспомогательную роль.
Предполагается, что частое, периодическое расположение CENP-B на массиве а-сатДНК домена а-1 может являться основой для специфической укладки хроматина в центромерной области. Необычная укладка хроматина распознается другими белками или является поддерживающей средой (supporting domain) для других кинетохорорганизующих белков (Yoda et al., 1996; Choo et al., 1997a; Sugimoto et al., 1999; Choo, 2000). Кроме CENP-B, различные мотивы ДНК миСат и а-сатДНК узнаются белками pJa, HMG-1 (Choo, 1997). Однако, роль этих белков в организации сатДНК пока не ясна. Дтя сатДНК показано наличие некоторых консервативных особенностей структуры, которые могут оказывать влияние, как на упаковку хроматина, так и служить сигналом для узнавания последовательности ДНК специфическими белками. Участкам ДНК, содержащим несколько остатков адснозина подряд (олиго(А) блок), свойственна суженная малая бороздка. Данная особенность структуры молекулы ДНК может распознаваться белками HMG-I и Dl (Reeves, Nissen, 1990). Показано, что в 17 и? 20 проанализированных АТ-богатых последовательностей различных сатДНК остатки адснозина распределены по последовательности не случайным образом, а образуют олиго(А) блоки (Martinez-Balbas et al., 1990). Наличие олиго(А) блоков является одним из характерных свойств таких сатДНК. Многим сатДНК свойственно наличие стабильного изгиба молекулы, что обусловлено наличием в их составе олиго(А) блоков, которые распределены по последовательности с периодом около 10.5 п.н., совпадающим с шагом спирали ДНК (Wu, Crothers, 1984; Ulanovsky, Trifonov, 1987). К их числу относятся маСат мыши (Radic et al., 1987), сатДНК мартышки и крысы (Martinez; -Balbas ct al., 1990; Nakamura et at. 1991), лебедя (Fitzgerald et al., 1994), курицы, фазана и индюка (Kodama et al., 1987; Saitoh et al., 1989), саламандры (Barsacchi-Pilone et al., 1986), Drosophila melanogaster (Doshi et al., 1991), жуков (Barcelo et al., 1997) и креветки (Benfante et al., 1989). Было выдвинуто предположение о том, что изгиб молекулы ДНК является фактором, способствующим более компактной укладке хроматина, и таким образом определяет конденсацию гетерохроматина (Radic et al„ 1987).
Выделение плазм ид ной ДНК, электрофорез ДНК
Плазмидную ДНК выделяли методом [делочного лизиса (Маниатис и др., 1984) и дополнительно очищали равновесным центрифугированием в градиенте плотности раствора CsCl (Маниатис и др., 1984). Электрофорез ДНК проводили в 1%-ном агарозном геле в ТАЕ (40 мМ Трис-ацетат (рИ 7,5); 1 мМ EDTA). Гель после электрофореза окрашивали в растворе 0,5 мкг/мл бромистого этидия. 2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля. Фрагменты для субклонирования получали обработкой изолированной фракции ДНК хромоцентров рестриктазами BamHl и EcoR\ (СибЭнзим, Россия). После проведения препаративной рестрикции, ДНК хромоцентров разделяли в агарозном геле. Из геля вырезали полоску с нужным размером фрагментов ДНК длиной от 200 п.п. до 1 т.п.н. и помещали в пробирку со стекловатой (0,5 мл, Eppendorf). Гель растирали стеклянной палочкой и замораживали. Затем фрагмент геля откручивали, собирая жидкость в другую пробирку (1,5мл Eppcndorf), ДНК осаждали спиртом и растворяли в удобном количестве ТЕ (10 мМ Tris-HCl (рН 8,0);0,1мМЭДТА). 2.4. Культивирование клеток. В работе использовалась линия мышиных фибробластоподобных клеток L клон 929, полученных из соединительной ткани мышей линии СЗН/Ап. Клетки выращивали на покровных стеклах в атмосфере 5% С02 при 37С па среде DMEM, содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки. По достижении 60% конфлюэнтности слоя, клетки промывали фосфатно-солсвым буфером (PBS) рН 7,4. Клетки фиксировали в метаиол:уксусном (3:1) фиксаторе на льду. Препараты высушивали на воздухе. 2.5. Получение препаратов метафазных хромосом. Культуру клегок культивировали одни сутки. Для получения препаратов метафазных хромосом, за 3 ч. до окончания культивирования в среду добавляли 0,5 мкг/мл колхицина. Гипотоническую обработку проводили раствором содержащим 0,075 М КС1 и 1% цитрата натрия в течение 15 мин при 37С. Клетки фиксировали в трех сменах метапол:уксусного (3:1) фиксатора на льду. Полученную суспензию раскапывали на мокрые холодные стекла. Препараты высушивали на воздухе. 2.6. Клеточная синхронизация, проточная цитофлюоромстрия. Для синхронизации клеток использовали методику истощения среды сывороткой (Brooks, 1976). Дня этого через 24 ч после посева клеток на предметные стекла их переносили в среду содержанию 0,1% сыворотки на 48 ч., а затем возвращали в среду с 10%-ной сывороткой на 14-17ч. Количество клеток L929 на всех стадиях клеточного цикла оценивали с помощью проточной питофлюорометрии. К суспензии клеток добавляли раствор йодистого пропидия (PI, 50 мкг/мл), раствор РНК-зы (0,25 мкг/мл), инкубировали 20-30 мин. при 37С и помещали в холодильник (+4С) еще на 30 мин. Распределение клеток по содержанию ДНК изучали методом проточной цитофлюорометрии (Розанов, 1988). Образцы анализировали на цитофлуориметре АТС-3000 (Odam-Bruker, Франция). Дополнительный контроль G2/M фази клеточного цикла проводили по интегральной яркости окрашенных DAPI (0,05 мкг/мл) ядер.
Анализ изображений окрашенных DAPI ядер полученных с CCD-камсры был проведен с помощью программы VideoTest-morphology (Видео-Тест, Россия). 2.7. Получение митотических хромосом из овулировавщих ооцитов. Для получения препаратов преждевременно конденсированных хромосом (I1KX) первого митотического деления зиготы, использовались 10-12 недельные мыши линии F1(C57BL/CBA)BL (Dyban et al., 1993). Овуляция была индуцирована введением 7,5 сд. сывороточного гонадотропина жеребой кобылы (PMSG, Sigma) и через 46-48 ч. введением хорионического гонадотропного гормона человека (hCG, Serono). Через 26 ч. после оплодотворения мышиные зиготы были вымыты из яйцеводов и обработаны раствором М-2 содержащим 200 мМ/мл гиалуронидазы (Sigma). Затем яйцеклетки переносили р несколько капель среды М16 (Sigma), содержащей окадаевую кислоту (ОА) в конечной концентрации 5 мМ, и инкубировали под парафиновым маслом (7,5 % С02) при 37С в течение 45 мин. Затем яйцеклетки отмывали средой М16, инкубировали в пей 45 мин. и использовали для приготовления хромосомных препаратов. Хромосомы фиксировались метанол: уксусным (3:1) фиксатором. 2.8. Выделение ядер печени мыши. Ядра клеток печени мыши (Black) выделяли стандартным методом с некоторыми модификациями (Berezney, Coffey, 1974). Все растворы для выделения ядер содержали 0,1 мМ PMSF. Около 15 г печени гомогенизировали в 10 объемах следующего раствора: 25 мМ буфер трис- НС1 (рН 7,5); 5 мМ MgCl2 (ТМ-буфер); 0,32 М сахарозы. Осадок, полученный центрифугированием гомогепата при 1500 g, рссуспепдировали в ТМ, содержащем 2,1 М сахарозы, наслаивали на подушку из того же раствора и центрифугировали при 100000 g 40 мин. Чистоту выделенных ядер контролировали под микроскопом. Препарат ядер использовали для определения локализации сателлитпой ДНК мыши методом флуорисцентной гибридизации in situ. Для проведения настоящего исследования нам была предоставлена фракция хромоцентров выделенная Прусовым (Прусов, Зацепина, 2002). 2.9. Выделение геномной ДНК мыши. Печень мыши гомогенизировали в лидирующем растворе (10 мМ Tris-HCl (рЧ 8,0); 10 мМ EDTA (рН 8,0); 0,5% SDS; 500 мкг/мл проназы) и инкубировали 5 ч. ДНК очищали фенол-хлороформом (1:1) и переосаждали этанолом. 2.10. Выявление сайтов репликации. К синхронизованной клеточной культуре добавляли 5-бромдезоксиуридин (BrdU) в конечной концентрации 100 мМ. Для определения различных стадий S фазы клетки инкубировали 5-30 мин при 37С (O Keef et al., 1992). Клетки фиксировали 3%-ным раствором параформальдегида (Sigma) на PBS в течение 10 мин. при комнатной температуре и обрабатывали 0,01% раствором Tritona Х-100 (Sigma) на PBS в течение 10 мин. В качестве первых антител использовали моноклональные мышиные антитела к BrdU (1:1000) (Roche) и инкубировали 40 мин. при комнатной температуре.
В качестве вторых антител использовали антитела к иммуноглобулинам мыши коныогированные с АІеха 594 (Molecular Probes) и инкубировали 40 мин. при комнатной температуре. В качестве блокирующего агента для антител использовали 5% раствор БСА (Sigma) на PBS. Затем препараты повторно фиксировали, проводя их через серию спиртов возрастающей концентрации 70%, 80%, 90% и использовали, для последующей гибрибизации in situ (FISH). 2.11. Клонирование фрагментов ДНК фракции хромоцентров. Для клонирования фрагментов ДНК хромоцентров использовали вектор pUC19. Фрагменты для субклонироваиия получали обработкой изолированной фракции ДНК хромоцентров рсстриктазами ВатН\ и EcoRX. Вектор pUC19 обрабатывали рестриктазами ВатНХ и EcoRX одновременно. Лигазная смесь содержала 0,1 мкг рестрицированной векторной ДНК; 0,2 мкг соответствующей вставки; 5ед л и газы (СибЭнзим, Россия) и буфер для лигирования. Лигазную смесь инкубировали в течении ночи +4С и затем использовали для трансформации компетентной культуры клеток Е.соШ (штамм DH5a) с применением СаС12 (Маниатис и др., 1982). Трансформированные клетки высевали на чашки, содержащие X-gal/IPTG (2 нг/мл). ДНК отобранных бесцветных клонов гидролизовали соответствующими рестрикгазами и анализировали электрофоретическим методом. 2.12. Секвенирование. 9 нлазмид содержащих вставку секвенировалн на автоматическом ссквинаторе ABI Prism 377 с использованием набора Big Dye Terminator kit v.2.0 (Perkin Elmer) и примеров M13 в фирме "Helix" (Санкт- Петербург). На основании сиквенсов клонированных последовательностей и известной последовательности миСат с использованием программы РгітегЗ (hUp://www.broad, mit.edu/cgi-bin/primer/primer3 _www.cgi) были подобраны следующие специфичные к MS3, MS4 и миСат пары праймеров :
Исследование структуры и локализации последовательностей MS3 и MS4 выделенных из фракции ДНК хром о центров мыши
Метод выделения ДНК хромоцентров (Прусов, Зацепина, 2002) основан на обработке ядер растворами низкой ионной силой, ультразвуком и разделении структур ядра и хромоцентров в градиенте сахарозы. Для сохранения натмвпого состояния хромоцентров, ядра получал :i гомогенизацией печени в расі воре, содержащем высокую концентрацию ионов магния (5 мМ) при относительно низкой ионной силе раствора (50-60 мМ). В этих условиях компактное состояние хромоцснтров, характерное для клеток in vivo, сохраняется. Конденсированное состояние хромоцсшров позволяет отделить их от диспергированных фрагментов растворимого хроматина, ядрышек, остатков ядерной мембраны при последующих центрифугированиях (Прусов, Зацепина 2002), ДНК хромоцснтров мыши обрабатывали ферментами рестрикции ВатЖ и EcoR\ и фракционировали в агарозном геле. Сайты для этих рестриктаз отсутствуют в составе миСат и маСат. Для клонирования использовали вектор pUC 19. При помощи селекции на среде, содержащей X-gal/IPTG, отобрали 9 клонов несущих плазмиды со вставкой. Клонированные фрагменты секвенировали используя стандартные праймеры М13. Сравнение сиквенсов с базами данных GcneBank и EMBL показало, что мы получили 8 новых последовательностей ДИК мыши и известную последовательность маСат. Выделенная последовательность маСат содержит 482 п.н. и состоит из двух повторяющихся мономеров. Семь из девяти последовательностей оказались практически полностью идентичными (рис. 12, а) и объединены под общим именем MS3 (Mouse Satellite 3). Нуклеотшшая последовательность MS3 депонирована в Gcnbank под № AY 439017. Средняя длина последовательностей MS3 равна 300 п.н. Эти последовательности различаются 5-Ю п.н. на 5 -конце и отдельными никлеотидными вставками или заменами. Расхождение в нуклеотидном составе между различными последовательностями MS3 равно 0,7%. Поиск в Gcnbank показал, что последовательность MS3 на 89% гомологична контигам ДНК АЕ011721.1 Xanthomonas axonopodis и АЕ012181.1 Xanthomonas campcst. Анализ последовательности MS3 (рис. 12, а) выявил два тандем но расположенных вырожденных мономера длиной 157 п.н, и 142 п.н. Консенсусная последовательность составлена на основе последовательностей отдельных мономеров MS3, полученных в результате секвенировапия 7 фрагментов ДИК хромопептров. В консенсусном мотиве этой последовательности только 89 п.н. являются консервативными (рис. 12, б). Оставшаяся последовательность длиной 606 п.н названа MS4 (Mouse Satellite 4) и депонирована в Genbank № AY 439018. Поиск в Genbank не выявил гомологии с известными последовательностями. С помощью программы выравнивания Clustal (Thompson et al., 1994) мы сравнили последовательности MS4 и MS3 друг с другом (рис. 13). Район последовательности MS4 300-597 п.н. имеет 50% гомологию с последовательностью MS3. Содержание GC пар в MS3 составляет 66,6%, а в MS4 65,3%.
Последовательность MS4 условно можно разделить также на две части длиной около 300 п.н., каждая из которых представляет сильно вырожденный мономер. Область деления совпадает с уникальным сайтом рестрикции для рестриктазы Есо47\\\ (рис. 13) Определяются также короткие последовательности по 5-9 п.н. локализованные приблизительно в одних и тех же местах каждого мономера (рис. 13). Отсутствие четко выраженного мономера может говорить о том, что клонированная последовательность MS4 либо не является повторяющейся в геноме мыши, либо сильно вариабельна. На основании того, что мы получили 7 одинаковых клопов одной и той же последователь пости MS3, и анализа первичной последовательности MS3 и MS4, мы предположили, что клонированные последовательности являются повторяющимися в геноме мыши. Анализ MS3 и MS4 показал наличие и этих последовательностях единственного сайта для рестриктазы Hinfi (рис. 13). Блот-гибридизация по Саузерну с мечеными зондами MS4 и MS3 показала, что в продуктах переваривания геномной ДНК мыши рестриктазой Hinfl фрагменты, гомологичные MS4 и MS3, формируют правильную "лестницу" с размером минимального фрагмента и шагом около150 п.н. для MS3 и 300 п.н для MS4 (рис. 14, а). Такая картина гибридизации говорит о том, что клонированные последовательности MS4 и MS3 расположены в геноме тандем но на протяженных участках и большинство мономеров содержит сайт для Hinjl в соответствии с компьютерным анализом (рис. 13). Используя рестриктазу ЯгнІІ, мы не получили "лестницы" состоящей из большого количество ступенек, однако шаг между зонами гибридизации кратен длине одного мономера каждой последовательности (рис. 14, а), В качестве контроля гибридизации использовали миСат, у которого известна длина повторяющегося мономера и картина гибридизации (рис. 14, a; de la Torre etaL, 1991). ПЦР анализ со специфичными праймерами к последовательности MS3 дает длинную правилыгую лестницу (рис, 14, б). Продукт ПЦР реакции с праймерами к последовательности MS4 выявил только 3 фрагмента, кратные длине одного мономера (рис, 14, б). Это подтверждает предположение, сделанное на основе компьютерного анализа о том, что последовательность MS4 в геноме состоит из сильно вырожденных мономеров. Тандемио повторенные последовательности с вариабельным мономером характерны для сатДНК. Таким образом, клонированные из хромо центров фрагменты MS3 и MS4 можно отнести к классу GC богатых сатДНК Чтобы рассчитать содержание MS3 и MS4 в геноме мыши мы провели гибридизацию клонированных фрагментов MS3 и MS4, меченных дигоксигенином, с рестрицированиой геномной ДНК мыши и плазмидной ДНК, несущей вставки миСат, MS3 и MS4 (рис. 14, в). Интенсивность гибридизации оценивали путем сравнительной денситометрии точек на нейлоновой мембране в двух незазисимых экспериментах с помощью программного обеспечения Gel-Pro Analyzer Version 3.1.00.00. В качестве внутреннего контроля использовали тример (362 п.н) последовательности миСат. Результаты в двух независимых экспериментах не отличались. Показано, что миСат составляет около 1% мышиного генома, что соответствует литературным данным (Wong, Rattner, 1988). Последовательность MS4 составляет около 1,6%, a MS3 около 2% от генома мыши. Возможно, что таким большим количеством последовательности MS3 можно объяснить, полученные нами 7 одинаковых клонов содержащих вставку последовательности MS3. 3.2.4, Сравнение степени изогнутости фрагментов сателлитных ДНК и их возможность формировать структуры подобные MAR. Последовательности MS3 и MS4 являются GC богатыми, в них выявлено множество сайтов для образования шпилечных структур. Внутри каждого повторяющегося мотива изучаемых последовательностей выявлен короткий прямой повтор GCGC повторяющийся 5 раз в MS3 и 8 раз в MS4.
Обе последовательности содержат небольшие блоки AT оснований (рис. 12, 13), которые вызывают искривление ДНК, хотя основная последовательность обогащена GC п.н. Известно, что наличие в составе молекулы ДНК участков из 3-6 остатков аденозина (или тимидина), распределенных по последовательности с периодом около 10,5 п.н., совпадающим с шагом спирали ДНК, приводит к изгибу молекулы (Wu, Crothers, 1984; Ulanovsky, Trifonov, 1987). Было показано, что ДНК маСат имеет изогнутую конфигурацию (Radic et al., 1987) и, что изгиб цепи ДНК может служить фактором, обусловливающим специфическое связывание белка с ДНК (Harata et al. 1988; Saitoh et al., 1989; Radic et al. 1992; Lobov ct al., 2001; Podgornaya et al., 2003). Известно, что фрагменты ДНК, имеющие изогнутую конфигурацию, движутся при электрофорезе в полиакриламидном геле при +4 С или комнатной температуре медленнее, чем предполагает их истинный размер. Однако те же фрагменты имеют нормальную подвижность при электрофорезе в агарозпом или полиакриламидном геле при +55С, или в присутствии интеркалирующих красителей - бромистого этидия, Ilocchst 33258, DAPI (Anderson, 1986). Сравнение относительных подвижностей фрагментов маСат, MS3 и MS4 в присутствии и отсутствии бромистого этидия показало, что в отличие от фрагмента маСат фрагменты MS3 и MS4 не изогнуты (рис. 15, а). Фрагмент маСат движется в 1% агарозпом геле как фрагмент длиной 600 н.н., а в присутствии бромистого этидия в таком же геле как фрагмент 500 п.н. Относительная подвижность фрагмента MS4 меняется не значительно, a MS3 не зависит от условий электрофореза (рис. 15, а). Компьютерный анализ фрагментов сателлитной ДНК проведен с помощью клин- модели Улановского и Трифонова (Ulanovsky, Trifonov, 1987). В соотвегствии с данной моделью, каждый АА и ТТ динуклеотид в составе молекулы ДНК приводит к отклонению оси спирали ДНК от прямой на определенный угол. Таким образом, модель позволяет оценить величшгу изгиба ДНК, исходя непосредственно из нуклеотидпой последовательности. Величину изгиба оси спирали ДНК, выраженную в градусах, оценивали как суммарный эффект отдельных изгибов между АА и ТТ динуклеотидами.
Локализация фрагментов сателлитиой ДНК в ядрах печени мыши
Количество хромоцентров в ядрах печени мыши в среднем составляет 11±4 (рис.19), что в два раза меньше количества хромоцентров в клетоках культуры L929 в GO/G1 стадии клеточного цикла (рис. 3, а). Известно, что в процессе клеточной дифференцировки (Mamielidis, 1988) и старения (Krzanovvska, Bilinska 2000) количество и размер хромоцентров уменьшается, и они становятся более конденсированными. Возможно, что в дифференцированных ядрах клеток печени последовательности MS3 и MS4 будут располагатся внутри хромоцентров, в отличие от хромоцентров клеток в культуре. Методом двойной in situ гибридизации мы определили взаимное расположение миСат, маСат, MS3 и MS4. МиСат во всех случаях располагается точками по периферии хромоцентров (рис.19, а, д, е), маСат гибридизуется отдельными глобулами внутри или по периферии хромоцентров (рис.19 а, в, г). Сигналы миСат и маСат перекрываются по периферии хромоцентров (рис.19, а). MS3 (рис. 19, б, в, г) и MS4 (рис. 19, б, д, е) во всех случаях локализованы по периферии хромоцентров. Наблюдается частичное перекрывание сигналов MS3 и MS4 (рис.19, б), некоторые сигналы MS4 располагались внутри хромоцентров. В случаях двойной гибридизации новых последовательностей с миСат (рис. 19, д, е) и маСат (рис.19, в, г) наблюдали отдельные, редкие перекрывающиеся сигналы. Таким образом, при определении относительного положения 4х типов сатДНК относительно хромоцентров и друг друга, видно, что ни одна из последовательностей полностью не принадлежит внутренней части хромоцентров, а суммарный сигнал всех фрагментов не покрывает область хромоцентров, как в дифференцированных клетках печени мыши, так и в течение клеточного цикла клеток в культуре. 3.2.8. Определение положение последовательностей MS3 и минорного сателлита на препаратах преждевременно конденсированных хромосом. Метод мечения in situ со специфичными праймерами (PRINS) можно использовать как альтернативу флуорисцентной in situ гибридизации (FISH) для определения локализации последовательности на цитологическом уровне (Koch et al., 1989). Такой подход главным образом используется для определения локализации повторяющихся последовательностей на хромосомах или выделенных ядрах (Russo et al., 1996). PRINS уменьшает вероятность неспецифической гибридизации для многих длинных проб. Продемонстрирован высокий уровень специфичности метода PRINS для определения хромосом человека in situ (Koch et al., 1989). Препараты преждевременно конденсированных хромосом (ПКХ) получали из мышиных ооцитов, обработанных О A (Dyban et al., 1993). Обработка О А (специфическим ингибитором фосфопротеин фосфотазы їй 2А) индуцирует фрагментацию ядерной оболочки и преждевременную конденсацию интерфазных хромосом в проядрышках также как и ядре второго полярного тельца (Dyban et al., 1993). ПКХ имеют различную степень конденсации и связаны с ядрышком. Степені, конденсации хромосом зависит от стадии клеточного цикла ооцита в момент обработки ОЛ (Dyban et al., 1993; Dozortsev et al., 2000). Использованные нами ПКХ находились в G2 стадии клеточного цикла (Dyban et а!., 1993), в это время хромосомы только начинают конденсироваться и выглядят вытянутыми (рис. 20). Ранее мы видели, (I) что в интерфазных ядрах, как клеток культуры, так и гепатоцитов, сигналы миСат и MS3 частично перекрываются, а на метафазных хромосомах оба сигнала располагаются в центром ері і ой области; (2) фрагмент MS3 является «прямым» и не обладает способностью связывать ядерный матрикс (рис. 15, в).
На основании этих данных последовательности миСат и MS3 выбрали для определения их относительного положения на вытянутых ПКХ методом PRINS. Центромерные регионы ПКХ определяются по яркой окраске DAPI (рис. 20, б) и видно, что они не полностью конденсированы. Основная часть PR1NS сигналов миСат и MS3 соответствует основному, ярко окрашенному DAPI региону хромосом, и только незначительная часть - плечам хромосом (рис. 20, а). Неполная конденсация хромосом делает PRINS сигнал на ПКХ отличным от FISH сигнала на обычных метафазных хромосомах (рис. 4, 17). PRINS сигнал для миСат и MS3 выглядит как большое количество не перекрывающихся мелких точек. При большем увеличении центромерных районов, ярко окрашенных DAPI (рис. 20, с) видно, что PRINS сигналы MS3 располагаются более центрально на центромере чем миСат. Полученные результаты подтверждают возможность участия MS3 в организации центромер наряду с миСат. В настоящее время под термином "центромер" подразумевают структуру, регулирующую и обеспечивающую удержание хромосом, место прикрепления митотического веретена, область контроля за правильностью выстраивания хромосом в метафазе и их прикрепления к веретену; участок, ответственный за контроль наступления анафазы (Craig et al, 1999). Традиционно центромер подразделяют на 3 домена: кииетохорный, центршіьньїй и домен контакта. Центральный домен, или собственно центромер, представляет собой блок транскрипционно инертного хроматина, на основе которого собираются остальные части кинетохора (Mitchell, 1996; Craig et al, 1999). У человека в этой области располагается а-сат ДНК локуса a-I (Manuelidis, 1978; Ikeno et al, 1994; Lee et al., 1997; Соловьев и др., 1998), a у Mas musctilus миСат (Pietras et al., 1983). В этом домене также располагаются белки CENP, в частности CENP-B, и INCENP (Earnshaw et al, 1987; Craig et al 1999), а также предполагается локализация гипотетических центромерных белков, участвующих в удержании сестринских хроматид (AHshire, 1997). Кипетохором называют специализированный центромерный субдомсн, формируемый перед вступлением клетки в митоз и ответственный за прикрепление микротрубочек веретена к центромеру. В интерфазных ядрах термином "прскинетохор" принято обозначать место образование активного кинетохора. Домен контакта иногда объединяют с собственно центромером под общим названием "прицентромер" (Willard, 1998; Craig et al, 1999; Stitou et al, 1999). О том, что у многих насекомых и растений хроматиды соединены не в области внутреннего центромерного домена, а в околоцентромерной области известно давно (Lima-de-Faria, 1955). Однако в последнее время аналогичные данные бы. їй получены на человеке и мыши (Не et al, 1998; Vig, Willcourt, 1998). Это дает основание говорить об участии околоцентромерного гетерохроматина в удержании хроматид (Sumner, 1998; Vig, Willcourt, 1998).
Предполагается, что этот домен является местом действия Topoll, необходимой для топологического разделения хроматид (Sumner, 1996). Показано изменение локализации центромерного гетерохроматина в течение клеточного цикла на клетках человека (Bartholdi, 1991; Ferguson, Ward, 1992; Wcimer et al.,1992; Hulspas ct al, 1994) и мыши (Vourc h et al .1993). Наши результаты совпадагот с литературными данными о том, что в клетках различных тканей мыши миСат выявляется в виде мелких компактных гранул внутри и по периферии окрашенных DAPI регионов в G0/G1 фазе, а также в эухроматиповых регионах (Cerda ct al., 1999). Мы показати зависимость распределение миСат и маСат от фазы клеточного цикла. В течение клеточного цикла маСат из больших компактных граіг/л в G0/G1 фазе, разбирается в S и располагается по периферии хромоцентра что, вероятно, связано с декластеризацией и декомпактизацией во время репликации. Необходимо отметить, что декластеризация миСат и маСат происходит в начале S фазы (рис. 6, I, II, а), в то время как увеличение количества сигналов происходит после репликации, в поздней S фазе (рис. 6,1, II, б). Степень декопденсации маСат, который в G0/G1 фазе наблюдался большими глобулами, при переходе клетки в S фазу значительчо больше чем миСат (рис. 5, з, б). В G0/GI фазе глобулу маСат окружают точечные сигналы миСат и происходит незначительное перекрывание сигналов по периферии хромоцентров (рис. 5, а). Несмотря на высокую степень гомологии миСат и маСат, а также их соседствующее положение па хромосоме, полного перекрывание последовательностей маСат и миСат в течение клеточного цикла не наблюдалось. Наибольшая степень перекрывания между сигналами маСат и миСат обнаруживалась в поздней профазе (рис. 5, д), что, вероятно, связано конденсацией хроматина при подготовке клетки к митозу. В GO фазе ядер лимфоцитов мыши конгломераты маСат наблюдали в основном во внутреннем пространстве ядра (Weicrich ct al., 2003). Мы показали движение миСат в течение клеточного цикла, хотя в работе сделанной на циклирующих клетках лимфоцитов мыши не наблюдали изменения в локализации миСат в течение клеточного цикла (Vourc h et al., 1993). В ядрах лимфоцитов и ядрах клеток некоторых других клеточных типов (Solovei et al., личное сообщение) в ранней G1 центромеры располагаются в центре клеточного ядра, в то время как в поздней G1 центромеры перемещаются к ядерной периферии и кластеризуются. В начале S фазы происходит декластеризация центромер и к середине S фазы центромеры начинают двигаться внутрь ядра. В поздней G2 фазе большинство центромер определяются внутри ядра.
