Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Прерывистые гены эукариот 5
2. Низкомолекулярные РНК 12
3. Повторяющиеся последовательности генома эукариот 17
За. Длинные повторяющиеся повледовательности 20
36. Короткие повторяющиеся последовательности... 25
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Клоны 31
2. Введение метки в ДНК 31
3. Клетки 32
4. Введение радиоактивной метки 32
5. Выделение ядерной и цитоплазматической РНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха 33
6. Выделение ядерной, цитоплазцатической и полисом-ной РНК из печени мышей и плазмоцитомы М0РС-І04Е.
7. Дополнительная очистка препаратов РНК... 34
8. Выделение поли(А) содержащей РНК на полиС^)-сефарозе 34
9. Электрофорез РНК в агарозном геле 35
10. Приготовление диазобензилоксиметил (ДБМ) -бумаги 35
11. Перенос РНК на ДБМ-бумагу 36
12. Гибридизационные эксперименты 37
13. Контактная гибридизация
14. Элгация РНК из агарозного геля 38
15 Посадка ДНК на нитроцеллюлозные фильтры 38
16. Гибридизация РНК с нитроцеллюлозными фильтрами.. 38
17. Элюция гибридов и обработка их РНКазой 39
18. Электрофорез РНК в геле полиакриламида с мочевиной 39
19. Определение длины поли(А)-последовательностей... 40
20. Радиоавтография 40
21. Просчет радиоактивности в пробах 41
22. Реактивы и материалы 41
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Исследование гомологии повторяющихся последовательностей BI и Б2 с малыми ядерными и цитоплазма-тическими РНК 43
2. Изучение характера транскрипции повторяющихся последовательностей BI и В2 45
3. Доказательство наличия поли(А)-последовательностей в составе малых В2 + РНК... 51
4. Исследование малых ВГ* и В2+ РНК с помощью электрофореза высокого разрешения 57
5. Изучение путей биосинтеза малых В1+ и В2+ РНК... 61
Глава ІУ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 67
ВЫВОДЫ 83
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85
- Прерывистые гены эукариот
- Введение радиоактивной метки
- Исследование гомологии повторяющихся последовательностей BI и Б2 с малыми ядерными и цитоплазма-тическими РНК
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Прерывистые гены эукариот
Благодаря новым методическим подходам достигнуты существенные успехи как в изучении тонкой структуры некоторых генов, так и в понимании общих принципов строения эукариотического генома. Наряду с этим обнаружено большое разнообразие способов организации генетического материала клетки.
В конце 60-х годов в исследованиях кинетики ренатурации ДНК было показано, что геном эукариот состоит из последовательностей существенно отличающихся друг от друга по степени повтоя-емости /16/. Степень повторяемости различных последовательностей генома варьирует весьма значительно. На основании этого можно выделить основные классы повторяющихся последовательностей.
1) Высокоповторяющиеся последовательности (сателлитная ДНК) 10 копии на гаплоидный геном.
2) Умеренно повторяющиеся последовательности 10 -10 .копий.
3) Уникальные и слабоповторяющихся последовательности.
Рассмотрим особенности строения уникальных генов эукариот.
В последние годы, благодаря современным методам исследования генома (молекулярное клонирование, рестрикционный анализ, анализ первичной структуры) было обнарукено прерывистое строение генов эукариот. Оказалось, что внутри генов последовательности ДНК, кодирующие белки, дискретны и разделены другими некодирую-щими последовательностями /29/. Гилбертом была предложена терминология, согласно которой расчленяющие последовательности получили название "нитронов", а дискретные участки структурных генов - "экзонов".
Впервые прерывистость генов была показана на вирусах животных SV -40 и аденовирусах. Однако, в этих случаях наблюдалась только прерывистость нетранслируемой последовательности на 5»-конце мРНК, тогда как часть гена, кодирующая белок, была непрерывной как у прокариот.
Прерывистое строение кодирующего участка ДНК впервые было показано для генов jb -глобина мыши и кролика /80,159/. Эти гены содержат по два интрона, один из которых расположен в 5 -концевой нетранслируемой части мРНК и в случае мыши имеет размер 115 нуклеотидов, а второй, большой интрон, находится в районе 104-105 кодонов структурной части гена и имеет размер 640 нуклеотидов. Аналогичная структура была установлена для із -гло-биновых генов человека /67/, цыпленка /41/ и ксенопуса. Интересно отметить, что расположение интронов во всех исследованных -глобиновых генах одинаково, но размеры их могут заметно варьировать. Двух интронная структура продемонстрирована и в случае других глобиновых генов ( , , у, ).
Введение радиоактивной метки
Клетки асцитной карциномы осаждали центрифугированием (2500 об/мин. 5 мин) и промывали средой Игла. Для получения месі ченой РНК клетки из 2 мл асцитной жидкости, (2 10 клеток) инкубировали при слабом встряхивании в 50 мл бесфосфатной среды Игла, содержащей 10-20 мК / Р/- ортофосфорной кислоты в течение 6 часов. В некоторых случаях клетки облучали ультрафиолетом с длиной волны 254 нм при дозе 13 9$г/ол - до суммарной дозы 200 эрг и 800 эрг или же инкубировали в течение 5 часов в бесфосфатной среде Игла, содержащей 15 мкг/мл оС -аманитина. Затем вносили / 2Р/ ортофосфорную кислоту и инкубировали клетки еще 2 часа.
Исследование гомологии повторяющихся последовательностей BI и Б2 с малыми ядерными и цитоплазма-тическими РНК
Одним из аспектов нашей работы было исследование гомологии между BI- и В2 - последовательностями и дискретными малыми РНК. Гомология между 4,5 5 и повтором BI была установлена ранее при сравнении их первичных структур (65, 90). Неполиаденилированные РНК выделяли из ядер, цитоплазмы и полисом клеток печени и АКЭ, подвергали электрофорезу, переносу на ДБМ-фильтры и гибридизации с 32Р ВІ-ДНК и В2-ДНК.
Из данных, приведенных на рис.1 видно, что В1-последова-тельность действительно способна гибридизоваться с 4,5 5 малой ядерной РНК. Кроме того, она гибридизуется с 1$малой цитоплаз-матической РНК (не связанной с полисомами). Не была обнаружена гибридизация повтора BI с какой-либо полисомной малой РНК. Мы также провели гибридизацию малых РНК с меченым фрагментом клона ЇЇІҐУІ 3IC, содержащего половину последовательности BI (с I по 72 нуклеотид). Этот фрагмент гибридизуется как с 4,5 S РНК (что ожидалось, исходя из структуры последовательности, так и с 1 S РНК (рис.1,с). Это указывает на то, что 7 РНК имеет гомологию с той же частью последовательности BI, что и 4,55РНК.
Аналогичные эксперименты были проведены и для В2-последова-тельности. Однако, при стандартных условиях отжига не была обнаружена гибридизация ее с какой-либо малой ядерной или цитоплаз-матической РНК.
Обсуждение результатов
Данные нашей работы по изучению характера транскрипции повторяющихся последовательностей ВІ и В2 указывают на то, что эти последовательности присутствуют в генах и транскрибируются в составе РНК. При этом наиболее высокое содержание транс-криптов с повторяющихся последовательностей отмечено для гяРНК.
Показано также, что транскрипты с ВІ и В2 присутствуют и в мРНК, хотя содержание их в этих РНК значительно ниже, чем в гяРНК. В мРНК из клеток разных тканей содержание последовательностей, гомологичных коротким повторам может сильно различаться. Так, В2 - последовательности почти отсутствуют в мРНК из асцитной карциномы Эрдиха, тогда как в мРНК из клеток печени и М0РС-104 они легко детектируются. Мы обнаружили, что значительную часть В2-содержащих мРНК клеток печени составляет РНК длиной 2,1 тыс. нуклеотидов.
Наши данные согласуются с результатами более ранних работ /81,92/, в кошорых было показано, что не только гяРНК, но и мРНК содержат последовательности, гибридизующиеся с двуспираль-ной РНК-В. Так как было известно, что последние транскрибируются с коротких повторов, из этих работ следовало, что короткие повторы входят в состав генов. Однако, некоторые авторы считали /23/, что не существует молекул мРНК, содержащих последовательности коротких повторов. Из первых работ по клонированию индивидуальных генов - глобинового, овальбуминового, иммуноглобули-нового (29) также следовало, что в составе генов отсутствуют короткие повторы. Однако, наши результаты и данные друтих авторов приводят к противоположному выводу.
