Введение к работе
Актуальность темы Понимание молекулярных механизмов возникновения и развития злокачественных опухолей является необходимым шагом для разработки эффективных методов лечения и профилактики онкологических заболеваний. Одним из активно развивающихся направлений исследований в этой области является изучение роли различных регуляторных белков (факторов роста, рецепторов, компонентов путей передачи сигналов, факторов транскрипции) в процессах канцерогенеза. Так, изменение экспрессии или активности тех или иных транскрипционных факторов под действием канцерогенных соединений может инициировать каскад событий, ведущих к злокачественному перерождению клетки. При этом в зависимости от того, на какие регуляторные белки влияют эти вещества, могут поражаться лишь определенные ткани, а именно те, в которых данные белки играют ключевую роль в поддержании клеточного фенотипа и/или в контроле пролиферации, что может объяснять трошюсть многих канцерогенных соединений к тому или иному органу. Таким образом, представляется интересным выяснение механизмов опухолесупрессориого или опухолеиндуцирующего действия факторов транскрипции, экспрессирующихся в ограниченном числе тканей и органов и обеспечивающих дифференцировку различных типов клеток.
Ранее в нашей лаборатории на линиях мышей, устойчивых и чувствительных к действию гепатоканцерогена орто-аминоазотолуола (ОАТ), были получены данные, указывающие на антиопкогенные свойства транскрипционных факторов подсемейства FoxA (по старой номенклатуре HNF3), которые играют ведущую роль в становлении и поддержании фенотипа клеток печени и вовлечены в процесс торможения пролиферации гепатоцитов. Было установлено, что ДНК-связывающая активность FoxA белков под действием ОАТ снижается только у взрослых животных тех линий, у которых он вызывает опухоли печени. Были получены также данные о видовой специфичности влияния З-метил-4-диметиламиноазобензола (З'-МеДАБ) гепатоканцерогенного для крыс, но не для взрослых мышей и гепатоканцерогенного только для мышей ОАТ на FoxA ДНК-связьшающую активность в печени этих животных. В этой связи большой интерес
]
представляло проведение более систематического исследования, включающего как изучение влияния видоспецифичных ОАТ и З'-МеДАБ, видонеспецифического гепатоканцерогена диэтилнитрозамина (ДЭНА), а также неканцерогенного 4'-метил-4-диметиламиноазобензола (4'-МеДАБ) на активность FoxA белков в печени взрослых мышей и крыс, так и действия ОАТ и З'-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени 12-ти дневных мышат, для которых оба соединения являются гепатоканцерогенами.
Известно, что антионкогенные свойства связанных с дифференцировкой транскрипционных факторов обусловлены их способностью блокировать пролиферацию клеток и/или запускать апоптоз [Timchenko et al., 1996; Wang et al, 2001; Amsterdam et al., 2002]. Поэтому логично предполагать, что среди генов-мишеней факторов FoxA должны находиться гены, продукты которых участвуют в этих процессах. Хотя к настоящему времени выявлено немало генов, контролируемых FoxA белками, круг их ограничен, главным образом, генными сетями метаболизма глюкозы, аминокислот и липидов, а также экспрессирующимися в печени генами, которые кодируют белки плазмы крови [Schrem et aL, 2002]. Гены-мишени факторов транскрипции FoxA, связанные с торможением пролиферации и апоптозом, остаются малоизучены. Выявление таких генов внесет существенный вклад в понимание тканеспецифичных механизмов регуляции процессов пролиферации и апоптоза в норме и будет способствовать развитию методов, позволяющих корректировать нарушения этих процессов при злокачественном перерождении клеток. Цель и задачи исследования Целью работы было выяснение роли транскрипционных факторов FoxA в механизмах гепатокапцерогенеза, включающее дальнейшее изучение влияния гепатоканцерогенов на FoxA белки в печени мышей и поиск генов-мишеней этих факторов, связанных с процессами пролиферации и апоптоза. Задачи исследования: 1. Изучение влияния видонеспецифического гепатоканцерогена ДЭНА и
неканцерогенного соединения 4'-МеДАБ на ДНК-связывающую активность
FoxA белков в печени мышей линии А/Не.
Исследование влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и 3'-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени 12-ти дневных мышат линии ICR, а также взрослых мышей этой линии.
Изучение влияния гепатоканцерогенов на взаимодействие FoxA с регуляторными районами их генов-мишеией в условиях in vivo на примере глюкокортикоид-индуцибельных энхансеров гена тирозинаминотрансферазы (ТАТ).
Поиск потенциальных генов-мишеней FoxA, связанных с контролем пролиферации и апоптоза, с использованием опубликованных даїшьіх массового анализа экспрессии генов мыши и компьютерных методов распознавания сайтов связывания FoxA.
Получение GST-слитых белков, содержащих ДНК-связывающие домены FoxA2 и FoxA3 крысы и мыши соответственно, проверка их активности и специфичности.
Экспериментальная проверка предсказанных компьютерными методами сайтов связывания FoxA с использованием рекомбинантных белков и белков ядерного экстракта.
Определение влияния ОАТ (снижающего FoxA ДНК-связывающую активность в печени мышей) на экспрессию потенциальных генов-мишеней FoxA мыши и взаимодействие этих транскрипционных факторов с регуляторными районами таких генов в условиях in vivo.
Новизна и научно-практическая значимость исследования Установлено, что ДНК-связывающая активность транскрипционных факторов FoxA в печени мышей снижается под действием видонеспецифического канцерогена ДЭНА, вызывающего опухоли печени как у крыс, так и у мышей. Показано, что неканцерогенный для обоих видов животных аминоазокраситель 4'-МеДАБ на активность FoxA белков в печени мышей не влияет. Показано, что у 12-ти дневных мышат FoxA ДНК-связывающая активность снижается как под действием «мышиного» гепатоканцерогена ОАТ, так и «крысиного» гепатоканцерогена З'-МеДАБ, вызывающего развитие опухолей печени и у мышей при условии его введения в возрасте 12-и дней. На мышах линии ICR
показана прямая связь между активностью FoxA белков и снижением глюкокортикоидной индукции ТАТ (тиразинаминотрапсферазы).
Обнаружены два района на расстоянии -2,5 и -6,2 т.п.н. от старта транскрипции гена ТАТ мыши, высокогомологичные глюкокортикоид-шщуцибельным эпхансерам гена ТАТ крысы, и впервые показано взаимодействие с ними FoxA белков (Foxa2 и FoxA3) in vivo. Впервые показано снижение под действием ОАТ связывания FoxA белков с данными регуляторпыми районами in vivo. Найден новый тип "сильных" сайтов связывания FoxA белков, организованных в виде трех и более повторов тетрануклеотида TTTG. Выявлено два потенциальных гена-мишени FoxA белков - Си12 и Cdc73. Показано, что уровень экспрессии гена СиП под действием ОАТ, снижающего активность FoxA белков, увеличивается в 10 раз, a Cdc73 в 5 раз, что позволяет предполагать репрессию данных генов этим транскрипционным фактором. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания роли тканеспецифичных транскрипционных факторов, в частности FoxA, в механизмах возникновения и формирования опухолей печени под действием гепатоканцерогенов.
Выявленный новый тип сайтов связывания в виде TTTG повторов позволяет проводить предварительный поиск новых генов-мишеней FoxA белков контекстным анализом. Материалы данной диссертации используются при чтении лекций по ряду спецкурсов на ФЕН НГУ. Положения, выносимые на защиту
FoxA ДНК-связывающая активность снижается под действием видонеспецифичного гепатоканцерогепа ДЭНА в печени мышей и не изменяется при введении пеканцерогешюго 4'-МеДАБ.
Под действием ОАТ ДНК-связывающая активность FoxA белков снижается как у взрослых, так и у 12-ти дневных мышей линии ICR. З'-МеДАБ снижает активность FoxA у мышей линии ICR только в возрасте 12-ти дней, но в меньшей, чем ОАТ степени.
Транскрипционные факторы FoxA2 и Fox A3 in vivo связываются с районами, расположенными на расстоянии -6,2 и -2,5 т.п.н. от старта транскрипции гена ТАТ мыши. ОАТ снижает связывание FoxA с этими районами in vivo.
Уровень изменения ДНК-связьгоающей активности белков FoxA у мышей линий ICR и А/Не соответствует изменению уровня глюкокортикоидной индукции гена ТА Т.
Найдено 12 потенциальных генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA.
Показано, что ОАТ увеличивает экспрессию Cull в 10 раз, a Cdc73 - в 5 раз; уровень экспрессии генов СгеЬЗІЗ, Ppp2r5d, Ptk2b и Pdcd8 изменяется недостоверно.
Транскрипционные факторы FoxA эффективно связываются с сайтами организованными в виде 3 и более повторов тетрануклеотида TTTG.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II Съезде Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007) и 34th FEBS Congress (Prague, Czech Republic. 2009).
Публикации no теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (189 наименований). Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 20 рисунков. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ
Работа выполнена на 12-ти дневных и взрослых самцах мышей линий А/Не и ICR, а также самцах крыс Wistar весом 200-250 г разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Связывание белков экстракта ядер и рекомбинантных GST-слитых белков, синтезированных в Е.соН, с различными олигоиуклеотидами изучали методом задержки ДНК пробы в геле. Уровень экспрессии измеряли с помощью ПЦР в реальном времени. Для определения
связывания белков FoxA2 и FoxA3 с их регуляторными участками в генах в условиях от vivo использовали метод иммунопреципитации хроматина.
