Введение к работе
Актуальность проблемы
ДНК-связывающий белок GAGA, кодируемый геном Trithorax-like (Trl), требуется для развития многих органов и тканей D. melanogaster. Этот эволюционно- консервативный белок принимает участие в формировании «открытой» конформа- ции хроматина в различных регуляторных элементах, задействованных в регуляции транскрипции (Farkas et al., 2000; Matharu et al, 2010). Данные по локализации белка GAGA на политенных хромосомах (Raff et al., 1994), сравнительный анализ промоторных последовательностей (Arkhipova, 1995; FitzGerald et al., 2006), результаты экспериментов по профилированию хроматина с использованием Dam (van Steensel et al., 2003), а также данные ChIP-chip анализа (Negre et al., 2010) говорят о том, что число генов, регулируемых GAGA-фактором, может быть очень большим. Однако на сегодняшний день к экспериментально доказанным генам-мишеням GAGA-фактора относится небольшое число генов, включая Ultrabithorax (Ubx), fushi-tarazu (ftz) и engrailed (en). В регуляторных районах этих генов были обнаружены сайты связывания GAGA-фактора (Biggin and Tjian, 1988; Soeller et al., 1988; 1993; Katsani et al., 1999; Mahmoudi et al., 2003; Schweinsberg et al., 2004), а также были проведены эксперименты, доказывающие участие GAGA в регуляции транскрипции этих генов (Topol et al., 1991; Farkas et al., 1994; Bhat et al., 1996; Laney and Biggin, 1996; Orihara et al., 1999; Bejarano and Busturia, 2004; Огиенко и др., 2006).
В данной работе с использованием комбинированного компьютерно-экспериментального подхода был проведен поиск генов, в регуляции экспрессии которых участвует GAGA-фактор. Поиск осуществляли среди генов, контролирующих формирование дорзальных выростов хориона (ДВХ). ДВХ - респираторные фила- менты, расположенные на переднем конце яйца дрозофилы и обеспечивающие дыхание развивающегося эмбриона. Реорганизация эпителиальной ткани в трубчатые структуры (тубулогенез) лежит в основе формирования не только ДВХ, но и таких органов, как сердце, почки, легкие, кишечник, нервная трубка у различных видов животных. Понимание генетических механизмов, контролирующих развитие трубчатых структур, необходимо для выяснения закономерностей формирования и функционирования органов не только в условиях in vivo, но и органов, выращенных искусственных путем (Berg, 2008).
Известно, что формирование ДВХ контролируется большим количеством генов, многие из которых входят в состав важнейших сигнальных путей, участвующих в органогенезе не только дрозофилы, но и позвоночных (Berg, 2008). Участие гена Trl в формировании ДВХ в настоящее время не изучено, однако в данной работе было обнаружено, что при недостатке белка GAGA наблюдаются нарушения этого процесса. Поскольку белок GAGA является эволюционно-консерватив- ным (Matharu et al., 2010; Kumar, 2011), результаты данной работы могут быть полезны при исследовании роли GAGA-фактора у млекопитающих, включая человека. Также полученные данные могут послужить основой для понимания генетических процессов, контролирующих формирование органов, в основе которых лежит образование трубчатых структур.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было выявление генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA среди генов, участвующих в формировании дорзальных выростов хориона Drosophila melanogaster.
В ходе выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:
-
провести анализ ранее доказанных сайтов связывания транскрипционного факто
ра GAGA для выявления структурных вариантов этих сайтов и создать обучающие выборки для последующего компьютерного распознавания сайтов связывания GAGA-фактора.
-
проверить эффективность предсказания GAGA-сайтов методом задержки ДНК- пробы в геле.
-
проанализировать распределение потенциальных сайтов связывания GAGA-фак-
тора в геноме в целом и в различных районах генов дрозофилы.
-
провести поиск потенциальных сайтов связывания GAGA-фактора в регулятор- ных районах генов, играющих ключевую роль в формировании ДВХ.
-
проверить генетическое взаимодействие Trl с генами, участвующими в формиро
вании ДВХ.
-
с использованием ПЦР в реальном времени провести сравнительный анализ относительной экспрессии генов, контролирующих развитие ДВХ, в норме и у Trl-мутантов.
Научная новизна
В данной работе впервые созданы две качественных выборки (структурные варианты GAGnGAG и GAGnnnGAG) для компьютерного распознавания GAGA- сайтов в последовательностях ДНК. Экспериментально подтверждено связывание с 30-ю новыми сайтами GAGA-фактора. Впервые показано, что мутации гена Trl вызывают нарушение формирования ДВХ и оперкулума яйца дрозофилы. Обнаружено генетическое взаимодействие Trl с gurken, decapentaplegic, Notch, broad, saxophone, thickveins и bunched в развитии ДВХ. Показано, что экспрессия генов gurken и saxophone понижается, а экспрессия гена Notch увеличивается на фоне снижения количества белка GAGA в ходе оогенеза дрозофилы.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты дополняют имеющуюся информацию о сайтах связывания и генах-мишенях транскрипционного фактора GAGA, показывают важность экспрессии гена Trl для нормального формирования ДВХ. На основании результатов, полученных в данной работе, модифицирована генетическая сеть, контролирующая формирование ДВХ. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и биоинформатических специальностей.
Положения, выносимые на защиту
-
-
Белок GAGA участвует в регуляции морфогенеза дорзальных выростов хориона
дрозофилы.
-
-
Гены gurken и saxophone, играющие ключевую роль в формировании дорзальных
выростов хориона, являются генами-мишенями транскрипционного фактора GAGA.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: VII Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology — BGRS\SB-2010) (Россия, г. Новосибирск, 2010 г.); III
Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Украина, г. Канев, 2012 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 6 работ - статьи в отечественной и зарубежной печати (в журналах, входящих в список ВАК).
Структура и объем диссертации
Похожие диссертации на Идентификация генов-мишеней транскрипционного фактора GAGA, участвующих в формировании дорзальных выростов хориона яйца Drosophila melanogaster
-
-
