Введение к работе
Актуальность проблемы
Два последних десятилетия в молекулярной генетике можно смело назвать «веком мигохондриалыюй ДНК». Это связано с тем, что именно в это время появились сведения о большом числе заболеваний, вызванных дисфункцией митохондрий и, в отдельных случаях, дефектами в митохондриальном геноме (Wallace 2005). В настоящее время установлена структура мтДНК, расположение се генов на разпых цепях, особенности репликации и транскрипции, а также регуляция этих процессов ядерными факторами в условиях физиологической нормы (Fernandez-Silva et al., 2003). В то же время мехапизмы, лежащие в основе поддержания числа копий мтДНК и уровня транскрипции митохондриальных генов, практически неизвестны. Особый интерес вызывает функционирование мтДНК в условиях окислительного стресса, поскольку сами митохондрии в клетке являются генераторами активных форм кислорода и свободных радикалов. В норме в клетке сохраняется баланс между генерацией АФК и их детоксикацией, однако при воздействии внешнего источника окислительного стресса (например, рентгеновское облучение) этот баланс нарушается, что приводит к повреждению части молекул мтДНК.
Появляющиеся в последнее время новые возможности исследования (ПЦР в реальном времени) позволяют получить количественные данные о копийности мтДНК и ее транскрипции. Эти же методы позволяют исследовать функционирование митохопдриальпого генома в клетках таких тканей, которые никогда не являлись классическими моделями для исследования митохондрий, например в клетках крови. Кроме того, в кровяное русло поступают продукты распада клеток всего оргапизма, в том числе фрагменты ядерной и мигохондриалыюй ДНК. Одной из медицинских задач является поиск маркеров, которые позволяли бы неинвазивными методами оценить генотоксический груз, например, при проведении радиохимиотерашш онкологических больных. То обстоятельство, что в пределах любой ткани копийпость мтДНК - относительно постоянная величина, а число копий мтДНК на несколько порядков превосходит число копий ядерных генов, позволяет предположить, что именно фрагменты мтДНК могут потенциально быть искомым маркером.
Поскольку в настоящее время практически отсутствуют представления о нестабильности генетического аппарата митохондрий в условиях окислительного стресса, исследование функционирования мтДНК клеток крови мышей при воздействии внешнего мощного источника окислительного стресса (рентгеновского облучения) может расширить существующие представления о митохондриальном генетическом аппарате и иметь практическую ценность в медицинской диагностике.
Цели п задачи работы
Целью работы является исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
-
Определить абсолютное количество фрагментов митохондриальных генов (ND2, ND4, CYTB, АТР6) и регуляторного участка D-LOOP в ядросодержащих клетках крови контрольных мышей.
-
Определить абсолютное количество транскриптов митохондриальных генов (ND2, ND4, CYTB, АТР6) в ядросодержащих клетках крови контрольных мышей.
-
Определить количество фрагментов ядерной и митохондриальной ДНК в сыворотке крови контрольных мышей.
-
Исследовать изменения копийности мтДНК в клетках крови в разные сроки после рентгеновского облучения мышей в дозах I и 10 Гр.
-
Исследовать изменение процесса транскрипции мтДНК в клетках крови в разные сроки после рентгеновского облучения мышей в дозах 1 и 10 Гр.
-
Исследовать изменение содержания митохондриальных и ядреных фрагментов ДНК в сыворотке крови в разные сроки после рентгеновского облучения мышей в дозах 1 и ЮГр.
-
Проанализировать отношение митохондриальных фрагментов ДНК к ядерным в сыворотке крови в разные сроки после рентгеновского облучения мышей в дозах 1 и ЮГр.
Научная новизна работы
Настоящее исследование существенно расширяет современные представления о процессах репликации и транскрипции мтДНК в клетках крови. Механизм экспрессии мтДНК представляется более сложным, чем можно было бы предположить, поскольку количество транскриптов разных митохондриальных генов оказалось неэквимолярным, несмотря на то, что инициация транскрипции этих генов осуществляется с общего промотора. Полученные результаты позволяют предположить о наличии механизма постгранскрипционной регуляции числа транскриптов митохондриальных генов.
В условиях окислительного стресса (рентгеновское облучение мышей), когда уровень АФК и свободных радикалов превышает физиологическую норму, обнаружено изменение копийности мтДНК и транскрипции ее генов в зависимости от дозы облучения - от относительно низкой - 1 Гр, до летальной - 10 Гр. На фоне изменения количества мтДНК в ядросодержащих клетках крови происходит изменение количества фрагментов мтДНК и яДНК в сыворотке крови. Изменяющееся соотношение мтДНК/яДНК в сыворотке крови при
облучении мышей является показателем степени повреждения организма в целом, поскольку в кровяное русло поступают продукты распада всех радиочувствительных клеток. Научно-практическое значение
Исследование копийности мтДНК в клетках крови, измепения се репликации и транскрипции, в сумме с данными о количестве фрагментов мтДНК в сыворотке крови, может быть в перспективе использовано при оценке генотоксического груза при радиационных авариях, проведении курса радио-химиотерапии онкологических больных, изучении нейродегенеративных болезпей человека.
Апробация диссертации
Результаты диссертационной работы доложены на 10 и 12 Путинских школах-конференциях молодых ученых (2006 и 2008 гг); на V съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность» (Москва, 2006); на 35-ой конференции Европейского общества радиационных исследований (ERRS) (Киев, 2006); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы
