Введение к работе
Актуальность проблемы. Основными источниками активных форм кислорода (АФК) в клетках являются митохондрии и мембранные ферменты NADPH оксидазы (NOX). Продукция ферментами NOX супероксид-анион радикала (02'") и пероксида водорода (Н2О2) была впервые открыта в фагоцитирующих нейтрофилах. Это явление получило название «окислительного взрыва» и долгое время связывалось только с токсичностью АФК для бактериальных или иных чужеродныз клеток, захваченных в фагосому. Однако впоследствии стали стремительно накапливаться данные об экспрессии ферментов семейства NOX практически во всех тканях и клетках многоклеточных. Стало понятно, что в нефагоцитирующих клетках Н2О2, производимый ферментами NOX, задействован во внутриклеточной передаче сигнала. Пероксид водорода окисляет цистеины в активном центре тирозин-фосфатаз и других белков, модулируя таким образом их активность и, следовательно, активность связанных с ними сигнальных каскадов. Сигнальная функция АФК стала объектом интенсивных исследований относительно недавно, так что актуальными задачами на сегодня являются непосредственное изучения сигнальных процессов с участием АФК и разработка новых методов исследования клеточных АФК in vivo.
Важно отметить что как повышенная, так и пониженная продукция клетками эндогенных АФК связана с нейродегенеративными и сосудистыми заболеваниями, патологиями иммунной системы. Таким образом, понимание функций эндогенного Н202 в разных типах клеток важно не только для фундаментальных исследований процессов внутриклеточной передачи сигнала или фагоцитоза, но и для биомедицинских и фармакологических исследований.
Лучшими инструментами для изучения сигнальной функции АФК в индивидуальных живых клетках являются генетически кодируемые биосенсоры на основе гомологов зеленого флуоресцентного белка GFP. Биосенсор НуРег, созданный ранее в нашей лаборатории, позволяет с высокой специфичностью детектировать субмикромолярные концентрации Н202 в клетке. Ввиду растущей значимости исследования сигнальных каскадов с участием Н202 усовершенствование биосенсора НуРег представляется актуальной задачей.
Цели и задачи работы. Целью работы было изучение сигнальной роли фагоцитарной NADPH оксидазы в процессе фагоцитоза, а также усовершенствование основного
молекулярного инструмента для визуализации внутриклеточного Н202, биосенсора НуРег. Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:
-
Разработка метода визуализации с помощью НуРег эндогенного Н202, вырабатываемого клетками при различных физиологических стимуляциях.
-
Изучение динамики продукции Н202 фагоцитирущими макрофагами.
-
Выявление взаимосвязи активации фагоцитарной NOX с активацией основных МАРК (Mitogen-Activated Protein Kinase) каскадов.
-
Оптимизация биосенсора НуРег с целью увеличения диапазона флуоресцентного ответа.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы впервые получены серии изображений, отражающих продукцию пероксида водорода в индивидуальной живой клетке после физиологической стимуляции ростовыми факторами и в процессе фагоцитоза. Анализ полученных изображений позволяет лучше понять сигнальную роль АФК. Апробированы и оптимизированы методики прижизненной конфокальной и флуоресцентной микроскопии фагоцитирующих клеток. Оптимизированные в ходе данной работы методики могут применяться для фундаментальных исследований клеточной биологии и биомедицинских исследований. Изучена взаимосвязь активации NADPH оксидазы и основных МАРК каскадов в процессе фагоцитоза, что особенно важно в контексте растущей значимости МАР-киназ как мишеней лекарственных препаратов. Разработаны новые версии НуРег с увеличенным диапазоном флуоресцентного ответа, НуРег2 и HyPer-H36Y. Усовершенствованные биосенсоры позволяют осуществить более подробное исследование эндогенного Н202 в индивидуальных живых клетках.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 104 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 184 ссылки. Диссертация содержит 25 рисунков и 1 таблицу.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены на VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, Россия, 2006), XIX Международной Конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2007), Международной Конференции в честь 75-летия со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва,
Россия, 2009), конференции по химической биологии EMBL (EMBL, Гейдельберг, Германия), V Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и переспективы развития» (Москва, Россия, 2009), а также на 49-ой ежегодной конференции The American Society For Cell Biology (Сан-Диего, США, 2009). Публикации. По материалам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах.
