Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1. АРТЕРИАЛЬНАЯ ГИПЕРТОНИЯ 10
Гипертония человека 10
Стресс как фактор, провоцирующий развитие артериальной гипертонии 12
2. ГИПОТАЛАМО-ГИПОФШАРНО-АДРЕНОКОРТИКАЛЬНАЯ СИСТЕМА
(ГГАС) И ЕЕ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ 14
2.1, Организация ГГАС 14
2.2. Проопиомсланокортин (ТІОМЮ 18
2.2. /. Продукты ПОМК и их сосудистые эффекты 18
2.2.2. Рецепторы меланокортинав 22
Классификация 22
Рецепторы меланокортииов и регуляция артериального давления 23
2.2.3. Регуляция экспрессии ПОМК 28
Регуляция транскрипции гена ПОМК 28
Регуляция стабильности мРНКгена ПОМК 33
Регуляция трансляции ПОМК 34
Регуляция поеттрапеляционпого прог\ессгшга ПОМК 34
Кортиштропин-рилизинг гормон (КРГ) 36
Глюкокортикоиды 39
Сосудистые эффекты глюкокортикоидов 39
Стероидные пеиеппюры 40
Биохимия стероидных рецепторов 40
Участие стероидных рецепторов в регуляции ГГАС 42
3. КРЫСЫ ЛИНИИ НИСАГ КАК ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ
ИССЛЕДОВАНИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИИ 45
РЕЗЮМЕ 48
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50
1. МАТЕРИАЛЫ 50
2. МЕТОДЫ 51
Выделение суммарной РНК из тканей 51
Получение кДНК 51
Определение уровня мРНК гена ПОМК методом конкурентной ПЦР 52
Определение уровней мРНК генов КРГ, РС1 и ГР методом мультиплексной ПНР 54
Определение нуклеотидной последовательности кДНК гена ПОМК 55
Подготовка вставки клишированию 55
Подготовка вектора клишированию 56
Лигированис 56
Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК 57
Выявление колоний, несущих пяахмиду с нужной вставкой 57
Выделение плазмидной ПНК 57
Секвенироваяие 57
Определение количества АКТГ в ткани гипофиза и плазме крови 58
Определение количества,кортикостсрона в плазме крови 58 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ 59
1. УРОВЕНЬ мРНК ГЕНА ПОМК В ТКАНИ ГИПОФИЗА КРЫС ЛИНИЙ
WAG И НИСАГ 59
СОДЕРЖАНИЕ АКТГ В ТКАНИ ГИПОФИЗА И ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 61
СОДЕРЖАНИЕ КОРТИКОСТЕРОНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 63
УРОВЕНЬ мРНК ГЕНА КРГ В ГИПОТАЛАМУСЕ КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 65
УРОВЕНЬ мРНК ГЕНА РС1 В ГИПОФИЗЕ КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 65
УРОВЕНЬ мРНК ГЕНА ГР В ГИПОФИЗЕ, ГИПОТАЛАМУСЕ И ГИППОКАМПЕ КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 65
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ кДНК
ГЕНА ПОМК КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 71
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 76
1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ ГИПОТАЛАМУСА И
ГИПОФИЗА КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 77
УРОВЕНЬ КОРТИКОСТЕРОНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 82
УРОВЕНЬ мРНК ГЕНА ГР В ГИППОКАМПЕ, ГИПОТАЛАМУСЕ И ГИПОФИЗЕ КРЫС ЛИНИЙ WAG И НИСАГ 84
ВОЗМОЖНАЯ ВЗАИМОСВЯЗЬ ОБНАРУЖЕННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ АКТИВНОСТИ ГГАС С ПОВЫШЕНИЕМ УРОВНЯ АД У КРЫС
ЛИНИИ НИСАГ 87
5. СРАВНЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ГГАС У КРЫС ЛИНИЙ НИСАГ И SHR 87
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 92
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЦИТИРОВАНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 95
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
АГ артериальная гипертония
АД артериальное давление
АКТГ адренокортикотропный гормон
АНП атриальный натриурстичсский пептид
БТШ белки теп лов го шока
ВИП вазоактивный интестинальный пептид
ГАМІС у-аминомасляная кислота
ГГАС гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система
ГК глюко корти ко иды
ГР глюко корти ко идный рецептор
КРГ кортикотропинрилизинг гормон
КРГ-РІ рецептор 1 го типа для кортикотропинрилизинг гормона
КРГ-Р2 рецептор 2го типа для кортикотропинрилизинг гормона
КТПП кортикотропинподобпый пептид
(3-ЛПГ р-липотропный гормон
у-ЛПГ у-липотРОШ|ЫИ гормон
MP минералокортикоидный рецептор
а-МСГ а-меланоцитстимулирующиЙ гормон
[3-МСГ р-меланоцитстимулирующий гормон
у-МСГ у- мелапоцитстимулнрующий гормон
НИСАГ наследственная индуцируемая'стрессом артериальная гипертония
НТР нстранслируемый район
ПВЯ паравентрикулярное ядро
ПКА протеинкиназа А
ПОМК проопиомеланокортии
СОЯ супраоптическоеядро
стДНК стандартная (конкурентная) ДНК
ЧСС частота сердечных сокращений
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭПР эндоплазматический ретикулум
Введение к работе
Актуальность проблемы. Артериальная гипертония (АГ) является сложным, в большинстве случаев полигенным заболеванием, в развитии которого наряду с генетической предрасположенностью существенную роль играют воздействия определенных факторов среды. В человеческом обществе одним из важных факторов, обусловливающих формирование гипертензивного статуса, может быть психоэмоциональный стресс. В связи с этим значительный интерес представляет исследование механизмов возникновения и поддержания стресс-индуцированной формы А Г.
В настоящее время для исследования патологий человека, имеющих генетическую детерминанту, широко используются эксперймитальпые модели, линии животных (чаще всего - крыс, мышей), что открывает новые возможности для комплексного изучения генетико-физнологических механизмов, лежащих в основе того или иного заболевания. Оригинальной экспериментальной моделью генетически обусловленной стресс-зависимой АГ являются крысы линии НИСАГ (аббревиатура от слов "наследственная индуцируемая стрессом артериальная гипертония"). Данная линия получена из крыс нормотензивной линии Вистар путём многолетнего отбора (число инбредных скрещиваний более 20) на повышение АД в условиях мягкого эмоционального стресса (Markel, 1992; Markcl et al., 1999). Крысы линии НИСАГ стали объектом нашего исследования.
Большинство форм А Г имеют основу в виде комплекса генетических нарушений, приводящих, в конечном счете, к развитию патологии. Эти нарушения могут затрагивать системы, контролирующие баланс электролитов, синтез вазоактивных соединений, функцию нейроэндокринной и гормональной систем и т.д. Поскольку для возникновения АГ у крыс линии НИСАГ существенным фактором является стресс, можно предположить, что у них имеется нарушение функций, отвечающих за развитие стрессовой реакции. Одной из важнейших нейро-гормональных систем организма, организующих развитие стрессовой реакции, является гипоталамо-гипофизарпо-адренокортикальная система (ГГАС). Ее активность значительно возрастает при стрессе, что приводит, в том числе, к росту АД и, в ряде случаев, к развитию АГ (Hashimoto et al., 1989; Clark, 1998; Gomez et al., 1999; Rosmond, Bjomtorp, 2000). Следовательно, анализ активности ГГАС является одним из приоритетных направлений в исследовании природы АГу крыс линии НИСАГ.
8 Цель и задачи исследования.
Цель работы заключалась в сравнительном исследовании активности ГГАС, включая основные ее звенья - гипоталамус, гипофиз и кору надпочечников, в покое и при стрессе, у крыс линий НИСАГ и WAG, как на молекулярном, так и на физиологическом уровнях.
Непосредственные задачи работы заключались в следующем:
1. У крыс линий НИСАГ и WAG в покое и при стрессе исследовать уровень
экспрессии гена, кодирующего кортикотропин рилизипг гормон в гипоталамусе, являющемся
центральным звеном регуляции функции ГГАС.
Для определения гормональной активности аденогипофиза крыс линий НИСАГ и WAG исследовать содержание мРНК гена проопиомеланокортина в ткани железы, а также уровень адренокортикотропного гормона в ткани гипофиза и плазме периферической крови в покое и при стрессе.
Оценить глеококортикоидную активность коры надпочечников крыс линий НИСАГ и WAG в покое и при стрессе по содержанию кортикостерона в плазме периферической крови.
4. У крыс линий НИСАГ и WAG в покое и при стрессе исследовать уровень
экспрессии гена глкжокортикоидного рецептора в тканях гипоталамуса, гипофиза и
гиппокампа для оценки эффективности функционирования механизма отрицательной
обратной связи между звеньями ГГАС.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Ранее было показано, что активность ГГАС у крыс НИСАГ отличается от состояния этой системы у нормотензивных аутбредных крыс популяции Вистар, как на ранних этапах постнатального развития (Маслова и др, J 996; Bulygma et al., 2002), так и в зрелом возрасте (Юрисова и др., 1989; Maslova et al., 1991). Однако более корректным представляется сравнение функции ГГАС инбредпой линии НИСАГ с другой также инбредной линией. В настоящей работе в качестве нормотензивного контроля впервые использована инбредная линия крыс WAG (Wistar Albino Glaxo), которая, как и линия НИСАГ, селектирована из популяции Вистар. Высокая степень инбредности обеих линий подтверждена ранее различными методами геномного фингерпринтинга (Адаричев и др., 1996; Кривенко и др., 1998).
Для оценки состояния ГГАС крыс линии НИСАГ впервые наряду и параллельно с физиологическими методами использованы методы молекулярной биологии, позволяющие оценить уровень экспрессии генов, вовлеченных в регуляцию функции ГГАС.
В результате впервые было показано, что у крыс линии НИСЛГ по сравнению с крысами WAG содержание мРНК гена ПОМК в ткани гипофиза в покое повышено. Это, однако, не приводит к увеличению концентрации АКТГ в плазме периферической крови у пестресссированных крыс. Межлинейных различий в содержании мРНК генов КРГ в гипоталамусе и PCI в гипофизе, а также кортикостерона в плазме крови в покое не найдено.
В условиях эмоционального стресса, вызванного ограничением подвижности, крысы линии НИСАГ отличаются от крыс линии WAG, повышенным содержанием мРНК гена ПОМК в гипофизе, и повышенным ответом коры надпочечников, о чем можно судить по более высокому уровню циркулирующего в крови кортикостерона. В условиях эмоционального стресса у крыс линии НИСАГ происходит увеличение мРНК гена КРГ в гипоталамусе, чего не наблюдается у крыс линии WAG. У крыс линии НИСАГ в условиях стресса повышается также уровень АКТГ в гипофизе и плазме крови, тогда как у крыс WAG стресс вызывает повышение содержания АКТГ только в плазме крови.
Впервые у крыс НИСАГ и WAG исследована динамика изменений изучаемых показателей в процессе продолжающегося эмоционального стресса. У крыс линии НИСАГ происходит существенный рост и последующее незначительное понижение уровня АКТГ в ткани гипофиза, тогда как уровень АКТГ в гипофизе крыс WAG на протяжении стресса существенно не изменялся. Достижение максимального уровня АКТГ в плазме крови у крыс линии НИСАГ во время стресса происходит позже, чем у крыс WAG. Кроме того, только у крыс НИСАГ зафиксирован прирост уровня кортикостерона между 15-ой и 30-ой мин стресса. У стрессированных крыс линии НИСАГ, в отличие от крыс WAG, наблюдается рост уровня мРНК гена ГР в гипофизе и снижение количества этой мРНК в гиипокампе.
Полученные новые результаты имеют значение для выяснения природы стресс-чувствительнй формы АГ, что, в свою очередь, может внести вклад в профилактику и лечение этого широко распространенного заболевания.
Апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты исследований были представлены на 10ш международном симпозиуме Rat Genetics, Genomics and Model Systems for Human Diseases (Берлин, 2001), а также на 2— научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения проф. М.Г. Колпакова «Эндокринные механизмы регуляции физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002).
