Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1. Строение и химические свойства фукозы і Q
1.2 Фукоза в живых организмах 12
1.2.1 Метаболизм фукозы 15
1.2.1.1 Путь de novo 15
1.2.1.2 Путь непосредственного фосфорилирования фукозы 18
1.2.1.3 Другие пути метаболизма фукозы 21
1.3 Строение и свойства фукоиданов 23
1.4.1 Химические способы получения фукозы 28
1.4.2 Способы получения фукозосодержащих олигосахаридов з 2
1.4.3 Биохимические способы получения фукозы.
Микроорганизмы - продуценты фукозидаз 35
ГЛАВА 2. Объекты и методы иследовании 43
2.1. Объекты исследований 43
2.1.1. Культивирование микроскопического гриба Aspergillus awamori ВКМF-808 43
2.2. Методы исследования 44
2.2.1 Определение активности a-L-фукозидазы 44
2.2.2 Определение степени гидролиза фукоидана 46
2.2.3 Биохимические и микробиологические методы исследования 47
2.2.4 Получение спиртоосажденного фермента 48
2.2.5 Определение уровня антителообразования 49
2.2.6 Определение степени фукозилирования ооцита 50
2.2.7 Статистическая обработка данных 51
2.3 Схема экспериментальных исследований 51
ГЛАВА 3. Разработка биокаталитической технологии фукозы из растительного сырья 53
3.1 Подбор источников фукоиданов из растительного сырья 53
3.2 Выделение фукоидана из биомассы бурых водорослей 55
3.2.1 Моделирование и оптимизация процесса экстракции фукоидана с использованием экспериментально статистического подхода 57
3.3 Поиск активного продуцента a-L-фукозидазы 73
3.4 Выбор оптимальных условий культивирования продуцента
фукозидазы 78
3.4.1 Изучение влияния источников углерода на биосинтез фукозидазы 78
3.4.2 Исследование влияния различных факторов на синтез фукозидазы g0
3.4.3. Разработка условий осаждения ферментного препарата g4
3.5 Ферментативная деструкция фукоиданов g8
3.5.1 Выбор оптимальных условий гидролиза фукоидана g9
3.6 Разработка лабораторного регламента получения фукозы 94
3.6.1 Получение фукозы из растительного сырья 94
ГЛАВА 4. Исследование биологической активности фукозы 99
4.1 Изучение пребиотических свойств фукозы 99
4.2 Исследование влияния фукозы на иммунный статус млекопитающих 104
4.3 Изучение влияния фукозы на репродуктивную функцию млекопитающих 109
Расчет себестоимости фукозы по предлагаемой технологии заключение 115
Выводы п6
Список использованных источников 117
Приложения
- Фукоза в живых организмах
- Определение активности a-L-фукозидазы
- Моделирование и оптимизация процесса экстракции фукоидана с использованием экспериментально статистического подхода
- Изучение влияния фукозы на репродуктивную функцию млекопитающих
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время в мировой науке накоплен обширный материал, свидетельствующий о важной роли «минорных» Сахаров в основных физиологических процессах млекопитающих. Особую биологическую роль играет фукоза (6-дезокси-Ь-галактоза).
Современный интерес к производству фукозы вызван ее иммуностимулирующими свойствами и определяющей ролью во многих типах реакций межмолекулярного и межклеточного узнавания.
Фукоза выполняет важные биологические функции в процессах онтогенеза, клеточной дифференциации и формирования иммунитета (Luther et al, 2009, Becker and Lowe, 2003). Гликаны клеточной поверхности представляют собой структуры, состоящие из линейных и разветвленных цепей полисахаридов, содержащих фукозу (Peterszegi et al, 2003). Установлено, что нарушение синтеза фукозилированных гликанов вызывает хронический иммунодефицит и недоразвитость ткани тимуса. Показано, что от процессов фуко-зилирования зависит дифференцировка Т-клеток (Park et al., 2007, Ali et al, 2008).
Необычайно важна роль молекул фукозы в репродуктивных процессах позвоночных. Установлено, что остатки фукозы, сконцентрированные на поверхности яйцеклетки, обеспечивают адгезию сперматозоида к оболочке ооцита (Intra et al, 2006, Lutjen et al, 1986).
Наиболее доступными природными источниками фукозосодержащих полисахаридов служат водоросли родов Fucus и Laminaria, однако использование биомассы этих растений в качестве сырья для производства фукозы затруднено из-за отсутствия простых и недорогих методов их расщепления. Промышленное производство фукозы и фукозосодержащих олигосахаридов отсутствует как у нас в стране, так и за рубежом.
Одним из перспективных способов получения фукозы является ферментативный гидролиз фукоиданов - матричных полисахаридов бурых водорослей. В настоящее время коммерческих препаратов ферментов, способных расщеплять сульфатированные полисахариды морских водорослей, не существует. Сведения о выделенных и охарактеризованных на сегодняшний день фукозидазах немногочисленны, большинство из них обладают низкой активностью и являются 1,2-экзофукозидазами, вследствие чего не способны гид-ролизовать фукоидан водорослей, содержащий преимущественно 1,3-, 1,4- и 1,6-фукозидные связи.
В связи с вышеизложенным, задача поиска продуцента фукозидазы, способной эффективно расщеплять фукоидан, и разработки способа получения фукозы из растительного сырья путем ферментативного гидролиза, является весьма актуальной.
Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Научные основы и практическое применение биокаталитических технологий в биоконверсии природных полимеров» при поддержке Федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы, Госконтракт № П 260 от 23.07.2009 г.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биокаталитической технологии фукозы и исследовании ее влияния на иммунный статус и репродуктивную функцию организма.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
изучение различных видов растительного сырья в качестве источников получения фукоиданов и оптимизация способа их выделения;
выбор активного продуцента фукозидазы среди микроорганизмов и определение оптимальных условий биосинтеза фермента;
получение ферментного препарата фукозидазы и исследование его некоторых физико-химических свойств;
разработка технологии ферментативной деструкции фукоидана;
изучение пребиотических свойств фукозы и ее полимеров;
определение влияния фукозы на иммунный статус и репродуктивную функцию млекопитающих.
Научная новизна. Впервые получен ферментный препарат фукозидазы Aspergillus awamori ВКМ F-808, способный гидролизовать фукоидан бурых водорослей до фукозы. Впервые разработана биотехнология фукозы из биомассы бурых водорослей с применением ферментного препарата.
Практическая значимость.
На основании результатов исследований уровня антителообразования опытных животных и степени фукозилирования ооцита впервые практически подтверждено положительное влияние фукозы на иммунный статус и репродуктивную функцию млекопитающих. Разработана биотехнология фукозы, основанная на ферментативном гидролизе фукоидана бурых водорослей, которая может найти применение при производстве лекарственных средств и биологически активных добавок иммуностимулирующего и пребиотического действия в фармацевтической и пищевой промышленности, что позволит расширить спектр подобных препаратов.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА (2009-2010 гг.), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2010,2011 гг.); 4-ой Всероссийской научно-методической конференции с международным участием
«Фармобразование-2010», 2-ом международном конгрессе «Евразия-Био» (Москва, 2010 г), симпозиуме некоммерческого партнерства институтов РАН «ОрХиМед» «Разработка лекарственных и физиологически активных соединений на основе природных веществ» в рамках конференции «Химия и полная переработка биомассы леса» (Санкт-Петербург, 2010 г), международном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2011», международном симпозиуме «Okolo-gische, technologische und rechtliche aspekte der ledtnsversorgung» (Ганновер, 2010).
Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», отмечена медалью за лучшую научно-исследовательскую работу. Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.»
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 15 работ, в том числе 2 в журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (2 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 134 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 29 рисунков и 14 таблиц. Библиография включает 132 наименования, в т. ч. 107 иностранных.
Фукоза в живых организмах
Все фукозил-трансферазы используют активированную форму фукозы - гуанидиндифосфат-фукозу (ГДФ-фукозу) в качестве донора фукозы для построения фукозилированных олигосахаридов. Два пути синтеза ГДФ-фукозы в цитозоле клетки были описаны для всех тканей млекопитающих. Путь de novo представляет собой трансформацию ГДФ-маннозы в ГДФ-фукозу путем трех последовательных ферментативных реакций, катализируемых двумя ферментами: ГДФ-манноза-4,6-дегидратазой (ГМД) и ГДФ-кето-6-дезоксиманноза-эпимераза-4-редуктазой (так называемый FX-протеин). Второй путь представляет собой синтез ГДФ-фукозы из свободной фукозы, получаемой клеткой извне. Многие исследования показали, что около 90% фукозы, используемой клеткой, синтезируется по пути de novo. Однако существование пути непосредственного фосфорилирования фукозы делает его перспективным для коррекции нарушений фукозилирования при различных патологиях.
Этот путь синтеза фукозы был впервые исследован более 40 лет назад В. Гинзбургом, в работе которого было продемонстрировано, что ГДФ-манноза превращается в ГДФ-фукозу через промежуточный продукт ГДФ-4-кето-6-дезоксиманнозу [63, 64]. Первая реакция этого пути осуществляется ГМД, которая катализирует превращение ГДФ-маннозы в ГДФ-4-кето-6-дезоксиманнозу путем окисления гидроксильной группы у С-4 атома с отщеплением гидроксила у С-6 атома. ГМД стабильно связана с никотинамиддинуклеотидфосфатом (NADP), который служит переносчиком электронов от С-4 к С-6 атому [рис. 1.3].
Последовательность генов, кодирующая ГМД, выделена и изучена у многих организмов: бактерий (более 20-ти видов), растений (Arabidopsis), насекомых (С. elegans, D. melanogaster) и млекопитающих {Н. sapiens, М. musculus). Последовательность, кодирующая ГМД, транскрибируется и экспрессируется практически во всех тканях организма, но уровень выработки данного фермента значительно варьирует [93, 95].
ГМД из Е. coli был выделен в кристаллическом виде и было показано, что он относится к семейству короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктаз. ГМД — гомодимерный протеин, каждый мономер которого состоит из двух доменов, один из которых связывается с NADP, а второй с ГДФ-маннозой [121]. ГДФ-фукоза является конкурентным ингибитором для ГМД и демонстрирует типичный пример обратной связи - ингибирования конечным продуктом реакции пути его синтеза. ГДФ-4-кето-6-дезоксиманноза превращается в ГДФ-фукозу с помощью бифункционального фермента эпимеразо-редуктазы, известного как FX-протеин. В первой реакции С-3 атом и метильная группа у С-5 атома маннозы эпимеризуются с образованием ГДФ-4-кето-6-окси-галактозы. Затем происходит перенос электрона от NADP к кето-группе у С-4 атома с образованием NADP+ и ГДФ-фукозы [48, 129].
FX-протеин был впервые выделен в середине 1970-х и позднее изучен более подробно. Сравнительное изучение этого протеина показало эволюционный консерватизм его строения (более 93% идентичности между протеином человека и мыши и около 50% идентичности FX-протеина человека и протеина Е.coli). FX-протеин из Е. coli был получен к кристаллическом виде и показал большое сходство строения с ГМД, включая гомодимерность строения и наличие двух доменов связывания в каждом мономере [62, 108].
Биосинтез ГДФ-фукозы из ГДФ-маннозы может быть воспроизведен in vitro с использованием эктракта цитозоля или рекомбинантных ферментов. Многими исследователями было показано, что активность ГМД в клеточном экстракте может быть измерена отдельно от активности FX-протеина, т. к. при отсутствии экзогенного NADPH и эпимеразная и редуктазная активности FX-протеина инактивируются и происходит накопление продукта действия ГМД -ГДФ-4-кето-6-дезоксиманнозы [114, 116]
Клонирование последовательности, кодирующей ГМД и FX-протеин, позволило реконструировать этот путь синтеза с участием рекомбинантных бактериальных ферментов [94]. Реакции с ГМД и миллимолярными количествами ГДФ-маннозы идут до полного завершения, при последующем добавлении FX-протеина и NADPH образуется стехиометрическое количество ГДФ-фукозы [30]. Одновременное проведение обеих реакций в одном объеме невозможно из-за ингибирования ГМД ГДФ-фукозой.
Определение активности a-L-фукозидазы
К настоящему времени выделено и охарактеризовано достаточно большое количество фукозидаз из различных источников. Многие из них имеют значительные отличия в субстратной специфичности, следовательно, возможно создание комплексных препаратов для полного гидролиза фукоиданов из растительного сырья.
Кроме того, интерес представляет и создание препаратов фукозидаз, специфичных к различным связям, для их применения в медицинских исследованиях и терапии заболеваний, связанных с нарушениями фукозилирования.
Абнормальное фукозилирование часто наблюдается при различных заболеваниях человека, включая рак, и часто связано с нарушением синтеза фукозидаз. Биологическую активность, опосредованную концевыми остатками фукозы, используют не только клетки высших эукариот, но и бактерии. Например, остатки фукозы выполняют ключевые функции в процессах адгезии бактериальных клеток Helicobacter pylori и Campylobacter jejuni к клеткам хозяина при инфекции [77].
Кроме описанных выше биохимических свойств, a-L-фукозидаза обладает рядом важных биологических активностей. Например, недавно было обнаружено, что a-L-фукозидаза регулирует проникновение лейкоцитов из кровеносного русла в ткани. Оказалось, что этот фермент выполняет функции медиатора поздних стадий воспаления.[81]
В настоящее время исследователями предпринимаются попытки использовать фукозидазы в борьбе с различными заболеваниями, в том числе и в противораковой терапии. И на этом пути уже достигнуты определенные успехи. Так, недавно было показано, что обработка клеток рака молочной железы a-L-фукозидазой приводила к снижению их инвазивной способности [46].
Перспективность исследований, связанных с получением высокоактивных фукозидаз, не вызывает сомнения. Отличия в субстратной специфичности известных фукозидаз свидетельствуют о возможности создания комплексных препаратов ферментов для полного гидролиза фукоиданов из растительного сырья и разработки биотехнологического способа получения фукозы. Кроме того, интерес представляет и создание препаратов фукозидаз, специфичных к различным связям, с целью их применения в медицинских исследованиях и терапии заболеваний, связанных с нарушениями фукозилирования.
Таким образом, фукоза играет важную роль в основных физиологических процессах млекопитающих: эмбриональном и постэмбриональном развитии, борьбе с заболеваниями, реакциях межклеточной сигнализации и высокоспецифичного узнавания. Она входит в состав углеводной части многих гормонов млекопитающих, таких как: тиреотропный гормон, пролактин, фолликулостимулирующий и лютеипизирующии гормон, хорионическии гонадотропин. Препараты чистой фукозы и фукозосодержащих олиго- и полисахаридов (фукоиданов) обладают широким спектром биологических активностей. Поддержание природного уровня содержания фукозы играет важную роль не только в процессах жизнедеятельности и развития высших организмов, но и в борьбе с заболеваниями.
Однако промышленное производство фукозы и фукозосодержащих олигосахаридов отсутствует как у нас в стране, так и за рубежом. В то же время существует ряд перспективных путей получения фукозы из растительных полисахаридов, а также из других источников, поэтому задача разработки бикаталитической технологии получения фукозы и фукозосодержащих олигосахаридов является весьма актуальной. Наиболее рациональными и доступными для реализации представляются ферментативные способы переработки дешевого природного растительного фукоидан-содержащего сырья, в изобилии имеющегося в России.
Отличия в субстратной специфичности известных фукозидаз свидетельствуют о возможности создания комплексных препаратов ферментов для полного гидролиза фукоиданов из растительного сырья и разработки биотехнологического способа получения фукозы.
Моделирование и оптимизация процесса экстракции фукоидана с использованием экспериментально статистического подхода
В результате статистической обработки экспериментальных данных получено уравнение регрессии, адекватно описывающее зависимость выходного параметра от исследуемых факторов: у2 =4,2 + 0,282ЛГ,+ 0,2 \Х2 + 0,422 Х3 +0,113Х,Х2 + + 0,038X 3 +0,013Х2Х3 -0,159Х,2 -0,141Х22 -0,283Х32; (3.6) где X, - кодированные значения факторов, связанные с натуральными значениями д;,- соотношениями: Х,= х1 - 3,5 0,89 : Х2 = х2 - 2,0 0,89 Х3= 55,0 8,93 (3.7) Второй этап заключался в геометрической интерпретации и анализе регрессионного уравнения (3.6).
Графические интерпретации зависимости (3.6) представлены на рис. 3.4 — 3.5. Значения независимых переменных Х\: Х и Х$ при этом представлены в кодированном виде. В целом все полученные результаты не противоречат известным закономерностям и связаны с особенностями экстракции полисахаридов.
Задача оптимизации при этом была сформулирована следующим образом. Необходимо найти такие значения независимых переменных Хи Х2 и Х3, при которых выход продукта у2 достигает максимального значения. При этом независимые переменные Х\, Х2 и Хз должны находиться в области эксперимента, границы которой определяются значениями факторов в «звездных» точках, т. е. —1,68 Xt +1,68 . Поскольку глобальный максимум параметра оптимизации у\ находится на значительном удалении от области эксперимента, то осуществим поиск локального максимума, для чего запишем условие оптимизации в виде у2 = 4,2 + 0,282Х, + 0,2 \Х2 + 0,422Х3 + ОД 13Х,Х2 + + 0,038Х,Х3 + 0,013Х2Х3 - 0,159Х,2 - 0,141Х22 - 0,283Х32 - max (3 8) Xf+Xl+X23=R2, в котором последнее уравнение определяет границы области эксперимента (сфера радиусом R) и является ограничением на значения независимых переменных. Для решения поставленной задачи воспользуемся методом неопределенных множителей Лагранжа. Для этого составим целевую функцию F: F = 4,2 + 0,282 X, + 0,2 1X2 + 0,422X3 + 0,113X,X2 + + 0,038X,X3 + 0,013X2X3 - 0Д59Х2 - 0,141X2 - 0,283X2 + + л(х2+х2+х2-;г2), где Я - неопределенный множитель Лагранжа. В соответствии с вычислительным алгоритмом метода неопределенных множителей Лагранжа составим систему уравнений:
Для решения системы уравнений (3.10) с последующим вычислением значений функции отклика уг воспользуемся интегрированным пакетом MAPLEW 8. Вычисления проводим при изменении радиуса сферы R в диапазоне от 0 до 1,7 (табл. 3.7).
Как видно из результатов оптимизации (табл. 3.7), движение по поверхности отклика от центра к ее периферии сопровождается постепенным увеличением параметра оптимизации у2. Однако оптимальными следует признать условия, полученные на 10 шаге оптимизации, так как в этом случае независимые переменные Х\, Х2 и Х не выходят за границы области эксперимента. Переходя от кодированных значений факторов к натуральным по формулам (3.7) с учетом характеристик планирования (табл. 3.5), получим оптимальные значения факторов: в
Для проверки соответствия определенных при математическом моделировании процесса экстракции оптимальных параметров реальному максимуму выхода был поставлен контрольный эксперимент при значениях входных параметров, соответствующих оптимальным значениям факторов. При этом согласно результатам оптимизации должен быть достигнут максимальный суммарный выход фукоидана, составляющий 6,0 %. В результате проведения экстракции при оптимальных значениях параметров в эксперименте был достигнут выход, составляющий 5,6 %, что видимо объясняется частичным химических гидролизом фукоидана в процессе экстракции и неполным осаждением низкомолекулярных фрагментов. Таким образом, наибольший выход фукоидана достигается при следующих условиях экстракции: концентрация кислоты на первом этапе 0,15 М, продолжительность экстракции 16 часов, температура 25 С, продолжительность экстракции на втором этане 4,5 и 3,0 часа, температура экстракции 62 С. Экстракция в таких условиях позволяет увеличить выход фукоидана из водоросли Fucus vesiculosis с 4,8 до 5,6 % от воздушно сухой биомассы водоросли.
Фукоиданы — матричные сульфатированные гетерополисхариды клеточных стенок бурых водорослей представляют научный и практический интерес как самостоятельные биологически активные вещества, так и в качестве сырья для получения фукозы. Для получения фукозы из фукоидана необходимо провести его гидролитическое расщепление, которое реализуется путем действием кислот (кислотный гидролиз) или ферментов класса гидролаз (ферментативный гидролиз). Ферментативный гидролиз предпочтительнее, т. к. под действием высокоспецифичных ферментов исключается образование побочных продуктов реакции. В настоящее время коммерческих препаратов ферментов, способных расщепить сульфатированные полисахариды морских водорослей, не существует. Также, несмотря на значительный объем информации о фукозидазах, вырабатываемых микроорганизмами, не найдено. продуцентов высокоактивных фукозидаз, способных расщеплять фукоидан водорослей и перспективных для промышленного применения.
С целью поиска продуцента фукозидазы, способной расщеплять фукоидан водорослей и перспективной для промышленного применения, был проведен скрининг микроорганизмов - потенциальных продуцентов фукозидаз. Для скрининга были отобраны представители родов, наиболее часто упоминаемых в литературе как продуценты фукозидаз: микромицеты рода Aspergillus, бактерии родов Bacillus, Clostridium, Alteromonas, актиномицеты родов Thermus и Streptomyces, а также штаммы высокоактивных продуцентов карбогидраз из музея чистых культур кафедры микробиологии и биохимии ВГТА (всего 52 штамма).
Скрининг проводили на минимальной агаризованной модифицированной среде Чапека с 1% фукоидана в качестве единственного источника углерода. Критерием отбора служила интенсивность роста микроорганизма на данной среде, указывающая на его способность расщеплять фукоидан до фукозы. Сравнительная характеристика проверенных штаммов по интенсивности роста представлена в табл. 3.8. Изученные штаммы, не показавшие способности к росту на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода фукоидан, в таблице не приведены.
Изучение влияния фукозы на репродуктивную функцию млекопитающих
По данным Института питания РАМН, в России наблюдается ухудшение состояния здоровья всех категорий населения, что в первую очередь связано со снижением иммунитета и полезной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека, поэтому поиск новых веществ с иммунотропными и иммуностимулирующими свойствами является актуальной проблемой. Не вызывает сомнения тот факт, что коррекция микробиоценоза кишечника должна являться базисной составляющей терапии значительного количества заболеваний человека.
Одним из путей поддержания нормальной микрофлоры является использование пребиотиков - веществ, являющихся субстратным и энергетическим материалом для пробиотической микрофлоры (бифидо- и лактобактерий).
В настоящее время изучению пребиотического действия олигосахаридов уделяется большое внимание. Создана Европейская комиссия по неперевариваемым олигосахаридам — ENDO (European commission on non-digestible oligosaccharides). В соответствии с положениями, выдвигаемыми ENDO, пребиотические эффекты олигосахаридов реализуются по следующим направлениям: - увеличение числа и активности бифидо- и лактобактерий, - оптимизация функции кишечника, - увеличение абсорбции кальция, магния и других металлов, - модуляция липидного обмена, - снижение уровня триглицеридов и холестерина [4, 26].
На мировом рынке появляется все большее количество добавок и пищевых продуктов, содержащих пребиотические углеводы, но перечень применяемых углеводов весьма ограничен: инулин, лактулоза, тагатоза, микрокристаллическая целлюлоза. Следует отметить, что объемы потребления пребиотиков недостаточны как у нас в стране, так и за рубежом. По данным USD А, жители США вместо 25-35 г пребиотиков в сутки потребляют 2,6 г инулина и 2,5 г олигофруктанов. К сожалению, достоверных данных по потреблению в России пребиотиков нет, но можно с уверенностью предполагать, что мы в данном вопросе мало отличаемся от американцев.
Кроме того, особое внимание должно уделяться изучению и разработке пребиотиков для детского питания, входящих в состав заменителей грудного молока. Известно, что в грудном молоке содержится уникальный комплекс галактоолигосахаридов, включающий глюкозу, галактозу, олигомеры фукозы, N-ацетилглюкозамин, которые способствуют развитию бифидобактерий и формированию иммунитета новорожденных [73]. Однако, существующие на сегодняшний день пребиотики, входящие в состав заменителей грудного молока, содержат галактоолигосахариды, состоящие из остатков галактозы и глюкозы, и фруктолигосахариды, состоящие из остатков фруктозы. При этом олигомеры фукозы в их составе отсутствуют, хотя уже давно получены данные, показывающие, что именно наличие фукоолигосахаридов в составе грудного молока является его характерной особенностью, придающей ему определенные свойства и не позволяющей пока создать полноценный заменитель [73].
В настоящий момент уже накоплены многочисленные данные, подтверждающие участие фукозы в важнейших процессах молекулярного и клеточного узнавания, синтезе гормонов и иммуноглобулинов. Фукоза выполняет важные биологические функции в процессах онтогенеза и клеточной дифференциации. Установлено, что у мышей с нарушенным синтезом фукозилированных гликанов наблюдается хронический иммунодефицит и недоразвитие ткани тимуса. Показано, что от процессов фукозилирования зависит дифференцировка Т-клеток. Абнормальное фукозилирование часто наблюдается при различных заболеваниях человека, включая рак.
Немаловажным является и тот факт, что гетероолигосахаридные цепи иммуноглобулинов содержат в основном остатки таких гексоз как галактоза, манноза, фукоза. Предполагается, что включение минорных Сахаров на раннем этапе синтеза иммуноглобулинов способствует их конформационным изменениям.
Пребиотическая активность фукозы и ее полимеров практически не изучена. Исследование способности фукозы стимулировать рост бифидобактерий представляет большой практический интерес не только для создания новых пребиотиков, но и для получения комплексных препаратов иммуностимулирующего и пребиотического действия.
С целью установления пребиотических свойств фукозы осуществляли культивирование бактерий Bifidobacterium bifidum in vitro на средах с различными источниками углерода. В работе были исследованы in vitro пребиотическая активность инулина из плодов цикория (Raftiline), фукозы, фукоидана из водорослей Fucus vesiculosis (молекулярная масса 170-200 кДа), ферментативного гидролизата фукоидана (молекулярная масса 30-40 кДа)
Накопление биомассы В. bifidum определяли нефелометрически, путем измерения оптической плотности клеточной суспензии бактерий при длине волны 560 нм. Биохимическую активность бифидобактерий определяли по нарастанию активной кислотности (рЫ). Бактерии культивировали в течение 42 часов. Определение биохимической активности и накопления биомассы производили через 18, 24 и 42 часа культивирования. Полученные данные представлены на рис. 4.1, 4.2.
Из представленных данных следует, что изменение величины рН, характеризующее интенсивность метаболических процессов у бифидобактерий, коррелировало с накоплением биомассы клеток. Максимальное снижение рН наблюдалось на всех испытываемых средах к 42 часам культивирования, наиболее интенсивное накопление кислот и биомассы бактерий происходило на средах с фукозой и гидролизатом фукоидана.
![Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс]](/i/i/4612/199276.png "Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс] Ефременко Анна Александровна")
