Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ состояния вопроса и задачи работы 10
1.1 . Аллергия на молоко и молочные продукты 10
1.2.Биохимические свойства различных видов молока 12
1.2.1 .Состав белков 13
1.2.2.Использование БАВ молочной сыворотки при создании лечебно-профилактических средств 18
1.2.3. Ферменты молока 20
1.2.4. Липидный состав 22
1.2.5. Минеральный состав 26
1.2.6. Витамины молока 27
Глава 2. Организация проведения экспериментов, методы исследований 30
2.1. Организация работы и методы планирования эксперимента 30
2.2. Методы биологических исследований 32 2.2.1 .Методы микробиологических исследований 32 2.2.2.Определение бактерицидной активности препаратов 32 2.2.3.Методы гистологических исследований 33 2.2.3.1.Фиксация материла 33
2.2.3.2. Заливка материала в застывающие среды 33
2.2.3.3. Методы окрашивания 34 2.2.4.Исследование заживления ран 34 2.3 .Методы физико-химических исследований 3 5 2.3.1. Определение глутатиона 3 6 2.3.2.Определение Сахаров методом тонкослойной хроматографии 37 2.3.3.Проведение аминокислотного анализа 38 2.ЗАВыделение липидов 39 2.3.5.Раз деление липидов методом адсорбционной хроматографии в тонком слое 39
2.3.6.Определение белков 40
2.3.7.Опре деление активности липазы 41
2.3.8. Контроль качества косметических средств 42
2.3.9. Испытание косметических средств 43 2.3.10.Проведение электрофореза 43 2.3.11 .Получение фукоидана 44
Глава 3 .Результаты экспериментальных исследований 46
3.1 .Исследование аминокислот козьего молока 46
3.2. Диск-электрофорез белков козьего молока в полиакриламидном геле 48
3.3.Исследование ферментов козьего молока 51 ЗАИсследование липидного состава козьего молока 52
3.5. Исследование минерального состава козьего молока 53
3.6.Исследование содержания глутатиона 55
3.7.Исследование углеводного состава 57
3.8.Хранение козьего молока 58
3.8.1. Сублимация козьего молока и молочных продуктов 5 9
3.9. Фракционирование козьего молока 61
3.9.1.Исследование процесса получения фракций из обезжиренного козьего молока 61
3.9.2.Методика определения метилцеллюлозы в пищевых продуктах 66
3.10. Фракционирование молочного жира 7 0
3.11 .Изучение аминокислотного состава фракций обезжиренного козьего молока 73
Глава 4. Разработка биотехнологии комплексной переработки и использования козьего молока 75
4.1. Разработка блок - схемы переработки козьего молока 75
4.2. Изучение влияния фракций козьего молока на рост и развитие микроорганизмов 77
4.3. Разработка лечебно-профилактического средства «Фумагол» 79 4.3.1.Исследование действия препарата «Фумагол» на условно-патогенной микрофлоре 83
4.3.2. Проведение доклинических испытаний препарата «Фумагол» на лабораторных животных 83
4.4.Разработка косметических средств с введением фракций козьего молока 89
4.4.1 .Разработка получения крема с добавкой альбумина сыворотки козьего молока 89
4.4.2.0пределение фармакологических показателей крема 90
4.4.3.Результаты комплексного контроля крема 91
4.4.4.Фармакологические показатели крема 92
4.5.Использование козьего молока в продуктах детского питания 95
4.5.1. Создание белок-белковых концентратов 95
4.5.2. Получение биосорбента 98
4.5.3.Смесь козьего и коровьего молока и ее основные отличия от других смесей 99
4.6. Новые подходы к производству козьего сыра 104
4.6.1. Резервирование сырной массы 105 4.6.2.Промывка сгустка при производстве сыра 107
4.7. Получение пищевой добавки 107
Заключение 110
Выводы 114
Предложения производству 115
Литература 116
Приложения 139
- Аллергия на молоко и молочные продукты
- Организация работы и методы планирования эксперимента
- .Исследование аминокислот козьего молока
Введение к работе
Актуальность темы. Решение социальных проблем, сохранение и укрепление здоровья населения РФ на основе применения экологически и биологически безопасных продуктов животного происхождения и их добавок с учетом генетических, анатомических, физиологических, психофизиологических особенностей организма животных, развитие и внедрение конкурентоспособных наукоемких техники и технологий возможно только при наличии современной и объективной информации. Ранее проводились исследования химического состава козьего молока (Петрова М.А. 1952; Баранова М.Г., 1998; Конь И.Я. 2000 и др.), но научные данные по биохимии и биотехнологии козьего молока носят ограниченный характер и не отражают фракционного состава.
В мировой практике четко прослеживается тенденция замены коровьего молока на козье при производстве продуктов детского и лечебного питания. Ежегодное производство козьего молока в Европе, Америке, Азии и Африке, составляет 8 миллионов тонн. Однако, только две страны, США и Южная Африка, производят его в сухом виде, предназначенное для педиатрического использования (Stark В. 1988).
Помимо использования уникальных свойств козьего молока в питании, известно его благотворное влияние на кожные покровы человека, однако, не выяснено какие именно свойства козьего молока обеспечивают данные эффекты.
В настоящее время в Российской Федерации промышленная переработка козьего молока практически отсутствует, что объясняется отсутствием необходимой научной информации для переработчиков.
Таким образом, обобщение разрозненной информации по биохимии и биотехнологии козьего молока является необходимым в современных условиях, что позволит расширить использование его биологически активных
компонентов в фармации, косметике, пищевой промышленности и других отраслях народного хозяйства.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы - разработка биотехнологии фракционирования козьего молока для использования в пищевой, фармацевтической и косметической отраслях производства.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи: -изучить биохимический состав козьего молока; -оптимизировать фракционирование козьего молока; -провести анализ химического состава полученных фракций; -изучить возможности использования фракций козьего молока в качестве стимуляторов роста микроорганизмов;
-разработать рекомендации по использованию фракций козьего молока в составе лечебно-профилактических средств;
-провести медико-биологические испытания разработанных лечебно-профилактических и косметических средств;
-обосновать рекомендации по производству сыра из козьего молока в условиях фермерских хозяйств РФ;
-предложить модель комплексной переработки козьего молока; -разработать научно-техническую документацию на полученные продукты.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. - оптимальные параметры технологии фракционирования козьего молока в лабораторных условиях; - изучение физико-химических и биологических свойств полученных фракций; - применение фракций козьего молока при культивировании микроорганизмов; - использование в составе лечебно-профилактических и косметических средств белковых фракций козьего молока; - использование козьего молока в пищевом производстве. Научная новизна. Выполненная работа представляет собой современное комплексное исследование, направленное на детальное изучение козьего молока, проведение его фракционирования и изучение химического состава отдельных фракций с целью их применение в микробиологии, медицине и кос-
метике.
Впервые с применением современных методов электрофореза изучен фракционный состав белков козьего молока.
Впервые проведены испытания фракции козьего молока в качестве стимулятора роста молочнокислых микроорганизмов в лабораторных условиях.
Разработана биотехнология оригинального антибактериального ранозаживляющего средства «Фумагол» и крема «Альбуминовый», с комплексной оценкой разработанных продуктов.
Поданы заявки на изобретения и получены положительные решения №2002105544, №2002105543 от 7 марта 2002 г на способ получения антибактериального ранозаживляющего средства «Фумагол» и способ получения биосорбентов.
Практическая значимость работы. Разработанные рецептуры и технологии новых видов лечебно-профилактических препаратов на основе фракций козьего молока прошли апробацию на базе НПФ ООО "Лик-Сервис" и рекомендованы для промышленного внедрения.
Работа является частью государственной программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по темам: «Оптимизация биотехнологии получения препаратов биостимулирующего действия на основании переработки молочного сырья» и «Разработка биотехнологии получения корректирующих добавок на основе фракционирования козьего молока» (№ гос. регистрации 01.960007945).
На основе анализа и обобщения результатов, теоретических и экспериментальных исследований разработаны технологические схемы получения фракций козьего молока и продуктов с их содержанием. Обоснованы технологические режимы, обеспечивающие получение продукта в лабораторных условиях с заданными свойствами при минимальных потерях сырья, энергетических и материальных затратах. Разработан и утвержден пакет нормативно - технической документации на продукты из козьего молока на базе СГУ (ТУ 9223-001-02080718-01, ТУ 9223-002-02080718-01, ТУ 9229-003-
02080718-01, ТУ 0229-004-02080718-01, ТУ 9224-005-02080718-01, ТУ 9158-009-02080718-02, ТУ 9158-010-02080718-02).
Материалы исследований вошли в подготовленный к изданию справочник «Состав и свойства козьего молока», и используются в учебном процессе при изучении дисциплин «Статическая биохимия» и «Динамическая биохимия», «Теоретические основы биотехнологии», «Зообиотехнология» в Ставропольском государственном университете для студентов специализации «Биотехнология».
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях: Международная конференция "Экология и жизнь - 2000" (В Новгород, 2000); IV региональная научно-техническая конференция "Вузовская наука Северо-Кавказскому региону" (Ставрополь, 2000); V Пущинская конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2001); I Международный салон инвестиций и инноваций (Москва, ВВЦ, 2001); Всероссийская конференция "Катализ в биотехнологии, химии и химических технологиях" (Тверь, 2001); Краевая научно-практическая конференция студентов, молодых ученых и специалистов «Молодежь и наука III тысячелетия» (Ставрополь, 2001); II Международный салон инвестиций и инноваций (получена золотая медаль за биотехнологию антибактериального ранозаживляющего препарата «Фумагол») (Москва, ВВЦ, 2002).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 12 рисунков и 31 таблицу. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 285 источников, в том числе 102 на иностранных языках. Приложение содержит заявки на патенты, технические условия и технологические инструкции на производство продуктов из козьего молока.
link1 Аллергия на молоко и молочные продукты link1 \
В наши дни актуальна проблема обеспечения питанием детей первого года жизни, так как в этот момент очень интенсивно идет процесс роста ребенка, формирование и совершенствование многих органов и систем.
К сожалению не всегда есть возможность кормить ребенка материнским молоком. В результате замены женского молока коровьим нередко у детей возникает аллергия. По данным некоторых авторов 7,5 % всех рожденных детей имеют повышенную аллергическую чувствительность к коровьему молоку [214, 236], известную как аллергия коровьего молока (АКМ). Для некоторых взрослых людей также характерна непереносимость коровьего молока, но из них 99 % нормально переносят козье молоко, между тем как на замену коровьего молока соевым белком 20 % детей испытывают непереносимость сои [223].
Возможные признаки аллергии: вздутие живота, судороги, газы, высыпание на коже (экзема 21 %), понос или запор, бронхит, кровь в кале, астма, аллергический ринит [218].
Кто реагирует: взрослые люди из Африки, Азии, Северной Америки. Дети - до 8 % младенцев [277].
Причина - неспособность пищеварительной системы расщеплять молочный сахар в молоке и молочных продуктах или аллергическая реакция к белку в молоке и молочных продуктах [19, 260].
Дети испытывающие аллергию на коровье молоко, но не на козье молоко, также реагируют на сыр из коровьего молока, но не на сыр из козьего молока [201].
В возрасте от четырех до шести месяцев большинство детей теряет аллергическую чувствительность к коровьему молоку, и ребенок может быть возвращен к питанию на коровьем молоке. Некоторые дети никогда не теряют аллергию к коровьему молоку, по крайней мере до двухлетнего возраста. Замена коровьего молока козьим молоком удаляет один из наиболее обычных аллергенов и улучшается эффективность переваривания [98, 202].
В результате, возрастает интерес к альтернативным источникам молока, что увеличивает процент потребности козьего молока и изделий из него [2].
Исследования доказали что, когда коровье молоко удалено из диеты детей, признаки аллергии уменьшались. Аллергия связана со скоростью и эффективностью процесса переваривания и поглощения протеинов. Размер белков козьего молока меньше, чем коровьего, что приводит к более быстрому и полному распаду белков, под действием пищеварительных ферментов человека [207]. В течение переваривания казеин козьего молока формирует менее жесткий и более хрупкий сгусток, чем казеин коровьего молока, таким образом возрастает доступность действия протеолитического фермента [216]. В США приблизительно 6 % младенцев страдают непереносимостью коровьего молока. Из этого количества только 14 % реагирует на наличие в коровьем молоке серосодержащих аминокислот [205].
Аллергия к казеину коровьего молока составляет 51 %, к Р-лактоглобулину до 80 %, к иммуноглобулинам 27 %, к а-лактальбумину - 21 %, к сывороточному альбумину -18 % [53, 252]. Деминерализованный сывороточный белок теряет аллергические свойства, при гидролизации с трипсином. В женском молоке (3-лактоглобулиновой фракции практически нет. В козьем же молоке эта фракция обладает полиморфизмом и по своей электроподвижности близка к а-лактальбуминовой фракции коровьего молока [240, 263].
Другие типы аллергических расстройств, могут быть из-за непереносимости лактозы. Она связана с недостатком фермента лактазы, которая синтезируется клетками тонкой кишки [253]. Лактаза расщепляет молочный сахар в более простые формы, которые могут быть поглощены клетками и включены в кровообращение [101].
В редких случаях, дети с рождения не способны к перевариванию лакта-зы. После двухлетнего возраста, организм человека начинает производить меньшее количество лактазы [227].
Также имеются различия и в жире различных видов молока. Жир козьего молока содержит значительно большее количество жирных длинноцепо-чечных кислот (С4:о - С12:о) чем жир коровьего молока [188]. Эта разность вносит вклад в более быстрое переваривание жира козьего молока, так как липаза воздействует на эфирные связи таких жирных кислот с большей активностью [47]. Средний размер жировых шариков козьего молока меньше, чем у коровы. Средние диаметры жировых шариков для козы, коровы равны соответственно 3,49 и 4,55 нм [203].
По этим причинам, детям, питающимся не женским молоком от рождения лучшие начинать с козьего молока, для предупреждения аллергии к молоку коров.
Организация работы и методы планирования эксперимента
Работа выполнялась автором в период с 1999 по 2002 гг. на базе Научно - образовательного центра «Технологий живых систем» Ставропольского государственного университета и Всероссийского научно - исследовательского института овцеводства и козоводства Российской сельскохозяйственной академии в рамках Государственной программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по темам: «Оптимизация биотехнологии получения препаратов биостимулирующего действия на основании переработки молочного сырья» и «Разработка биотехнологии получения корректирующих добавок на основе фракционирования козьего молока» (№ гос. регистрации 01.960007945).
При оценке состава и свойств объектов определяли следующие показатели: концентрацию водородных ионов - потенциометрическим методом; содержание белков и углеводов - фотометрическим методом на анализаторе живых систем BTS-310; определение жирнокислотного состава - методом ГЖХ; аминокислотный состав - на автоматическом анализаторе аминокислот ААА-339М; микробиологические показатели - по общепринятым методам микробиологического исследования; содержание макро- и микроэлементов -методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на приборе PERKIN-ELMER 2280; изучение фракционного состава белков молока - с помощью диск-электрофореза в ПААГ на приборе фирмы «Bio-Rad», модель 155, (США); математическое планирование и обработка данных - с применением дробного многофакторного эксперимента и методов математической статистики на ЭВМ, с использованием программ «Z-lab», «Total-lab» и «Statist 5.0»; кратность опытов п = 3-6, коэффициент вариации во всех случаях не превышал 10%. Объектами исследований служили козье молоко и отдельные его фракции.
Для ряда исследований дана графическая интерпретация экспериментальных данных. Эксперименты проводили в соответствии со схемой исследований, представленной на рисунке 1.
.Исследование аминокислот козьего молока
Изучение фракционного состава белков в исследованных нами образцах (козье и женское молоко; кислотный и нативный казеин козьего молока; кислотная и нативная сыворотка козьего молока; альбумины, глобулины и протеозо-пептозы козьего молока) проводили с помощью диск-электрофореза в ПААГ на приборе фирмы «Bio-Rad», модель 155, (США).
Качественный анализ протеинограмм изучаемых препаратов проводили по относительной электрофоретической подвижности белковых фракций, определяемой по формуле: где Rf - относительная электрофоретическая подвижность фракции; In - длина пути, пройденного фракцией п в мм; L - длина пути, пройденного индикатором (свидетелем) в мм. Количественный анализ протеинограмм изучаемых препаратов проводили с помощью сканирования электрофореграмм на лазерном компьютерном денситометре (Lazer Computer Densitometer, модель 2202, ЛКБ, Швеция).
В результате исследований белков с помощью электрофореза обнаружено, что электрофоретическая картина белков молока коз в полиакриламидном геле отличается от коровьего молока. В частности это относится к 3-лактоглобулиновой и а-лактальбуминовой фракциям. На рисунках 4 и 5 представлены электрофореграммы с денситограммами казеина и сывороточных белков козьего молока.
Пик 1, считая от катода, был определен нами в обоих электрофореграм-мах как низкомолекулярный пептид, обнаруженный и в женском молоке в соотношении 18,39 % и 19,52 % соответственно. Данная фракция предположительно идентифицирована как лизоцим. Таким образом, можно объяснить ранозаживляющий эффект козьего молока наличием именно этой фракции.
Пики 3, 5, 6, 7, и 9, считая от катода, на электрофореграмме казеина козьего молока были идентифицирована как к - казеин, Р - казеин, у- казеин , ос2 - казеин, ар- казеин соответственно. Пики 2, 4 и 8 предположительно ит-носятся к промежуточным фракциям пока не установленного характера. Распределение фракций казеина козьего молока было следующим (в %): ос і- казеин - 12,7 ±0,9; ос2 - казеин - 42,4 ±1,3; Р - казеин - 38,5+1,1; у - казеин -3,4±0,2; к - казеин - 6,8±0,8.
Пики 2, 3, 4, 5, 6 и 7, считая от катода, на электрофореграмме сывороточных белков козьего молока были идентифицирована как сывороточный альбумин, ос-лактальбумин, [3-лактоглобулин, псевдоглобулин и эвглобулин соответственно. Большая часть всех сывороточных белков молока по электроподвижности относится к а-лактальбуминовой фракции. Соотношение белковых фракций сыворотки молока коз составляет (в %): сывороточный альбумин — 6,6 ±0,4; а-лактоглобулин— 18,3±0,8; [3-лактоглобумин 53,2±1,5 и иммунные глобулины — 14,8±0,3. Основным сывороточным белком коровьего молока является Р-лактоглобулин, а козьего а-лактоальбумин.
![Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс]](/i/i/4612/199276.png "Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс] Ефременко Анна Александровна")