Введение к работе
Актуальность темы.
Разработка недорогих эффективных препаратов кормового, пищевого и медицинского назначения отечественного производства является одной из актуальных задач современной биотехнологии. Среди такого рода препаратов наибольшее практическое значение имеют гидролизаты белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы
Препараты нуклеотидной природы находят широкое применение в качестве лекарственных средств. Они регулируют обмен нуклеотидов в тканях, обладают иммуномодулирующими свойствами, применяются для лечения абиотрофий различного происхождения, псориаза, рассеянного склероза и других социально значимых заболеваний. [Шабанова М.Е., 2005 и др.]
Препараты белковой природы в виде гидролизатов и ферментолизатов находят применение в качестве азотсодержащей основы питательных сред для культивирования микроорганизмов, в качестве пищевых добавок, а при соответствующем уровне очистки в виде смеси аминокислот и в медицине для парентерального питания и в качестве сырья [Нестерова Е.И., 2001].
Гидролиз углеводсодержащих субстратов позволяет получать моносахара, которые можно использовать для производства кормовых и пищевых препаратов углеводов. [Мамыкин В.К. и др., 1998]. На основе жировых отходов получают свободные жирные кислоты, применяемые для производства различных видов мыл, высших спиртов, пищевых, парфюмерно-косметических и фармацевтических продуктов [Малахов И.А. и др., 2003].
Для получения гидролизатов биополимеров наиболее перспективно использовать возобновляемые отходы пищевой и микробиологической промышленности, животного, растительного и микробного происхождения. Примером отходов растительного происхождения является пивная дробина - отход пивоваренной промышленности, животного - жиросодержащие и кератинсодержащие отходы мясоперерабатывающей промышленности, микробного - биомасса хлебопекарных дрожжей - отход спиртового производства, биомасса бактерий Brevibacterium glu-tamicum - отход производства аминокислот микробиологическим синтезом и др.
Практическая ценность перечисленных отходов обусловлена следующими причинами:
высоким содержанием липидов, белков, углеводов, нуклеиновых кислот;
возможностью улучшения экологической обстановки на соответствующих производствах в случае утилизации данных отходов;
возможностью организации выпуска дополнительной конкурентоспособной продукции, что позволит повысить рентабельность основного производства.
Вследствие высокого содержания биополимеров данные отходы целесообразно перерабатывать в гидролизаты белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы пищевого, кормового или медицинского назначения. Для этого используют химический и ферментативный гидролиз. К недостатку первого относятся жесткие условия проведения: высокая температура, сильнокислые или сильнощелочные значения рН среды, что приводит к образованию нежелательных побочных продуктов, а также увеличению содержания минеральных примесей в получаемых гидролизатах, что осложняет и удорожает их очистку. Вышеуказанных недостатков лишен ферментативный гидролиз, проводимый в более мягких усло-
виях. Однако в этом случае не удается достичь высокой степени гидролиза субстрата по причине инактивации ферментов. В связи с этим гидролиз проводят в режиме дробной подачи фермента. Это ведет к повышению нормы расхода последнего, и, следовательно, к увеличению себестоимости готового продукта, т.е. эффективность ферментативного процесса существенно снижается. Одним из путей ее повышения является стабилизация ферментов. Для этого в реакционную среду или в ферментный препарат вводят различные химические соединения: по-лиолы, амины, аминокислоты, минеральные соли и др. [Tropak М.В.,2007]. Однако в этом случае у потребителей продуктов ферментативного гидролиза, особенно, для пищевых, медицинских и кормовых целей могут возникнуть проблемы с качеством гидролизатов. Наиболее просто решить данную проблему, если найти природный источник нетоксичных стабилизаторов. В качестве таких стабилизаторов можно использовать вырабатываемые микробными клетками ауторегуляторы, называемые факторами di, которые стабилизируют ферментные системы клетки и обеспечивают ее выживание в анабиозе. Известно, что данные соединения относятся к классу алкилоксибензолов (АОБ) и способны расширять температурный и рН оптимум действия фермента, что значительно снижает риск развития посторонней микрофлоры при продолжительном гидролизе и не требует поддержания стерильных условий. Кроме того, введение АОБ приводит к значительному увеличению скорости ферментативного гидролиза [Колпаков А.И., 2000].
«Узким» местом существующих технологий ферментативного гидролиза является также очистка получаемых гидролизатов. Как правило, она предполагает использование дорогостоящих реагентов и препаративных методов (аффинной хроматографии, гель-фильтрации, диализа и т.п.), которые сложно масштабировать в промышленном крупнотоннажном производстве. Таким образом, проблема утилизации отходов пищевой и микробиологической промышленности является актуальной и перспективной, однако, требуется разработка эффективных способов получения и очистки ферментативных гидролизатов на их основе.
Анализ литературных данных показывает, что технологии получения и очистки ферментативных гидролизатов, получаемых из микробного, животного и растительного сырья существенно различаются как стадиями предварительной подготовки сырья, так и используемыми ферментными препаратами и методами очистки гидролизатов. В связи с этим целесообразно разработать общие подходы к получению ферментативных гидролизатов из различных видов сырья, предложить общие пути повышения эффективности процессов ферментативного гидролиза, создать типовые кинетические схемы для количественного описания технологических стадий, что позволит в дальнейшем разработать универсальные алгоритмы управления технологическими процессами.
В условиях рыночной экономики конкурентоспособным может быть только гибкое, динамичное производственное предприятие, способное быстро адаптироваться к изменяющимся условиям рыночной среды и спроса на продукцию. Поэтому представляется целесообразным разработать максимально унифицированную малоотходную технологию получения ферментативных гидролизатов, которая позволила бы предприятию перерабатывать отходы различного происхождения и получать на их основе продукцию требуемого качества и назначения.
Целью работы является разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов промышленности белковой, липидной, углеводной и нуклеотидной природы с использованием технических ФП на основе отходов
пищевой и микробиологической, а также повышение эффективности ферментативных процессов за счет введения в среду гидролиза природных ауторегуляторов -факторов di, обеспечивающих повышение устойчивости и стабильности ферментов. Последнее должно привести к повышению качества гидролизатов при более низких нормах расхода ФП.
Для достижения поставленной цели в работе необходимо было решить следующие задачи:
-
разработать технологические приемы предварительной обработки растительного, животного и микробного сырья, способные обеспечить повышение эффективности последующего ферментативного гидролиза;
-
изучить, используя кинетический метод исследований, количественные закономерности процессов гидролиза в отсутствии и в присутствии интенсифицирующих факторов (АОБ) на модельных системах (высокоочищенных ферментах и субстратах);
-
установить единую для всех субстратов, ферментов и АОБ схему ферментативных превращений, учитывающую влияние АОБ на скорость ферментативной реакции.
-
на основе полученных на модельных системах закономерностей ферментативного гидролиза рекомендовать пути повышения его эффективности для гидролиза микробного, растительного и животного сырья техническими ФП;
-
разработать технологические приемы выделения и очистки ферментативных гидролизатов белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы и дать рекомендации по оптимальным условиям их проведения;
-
провести проверку соответствия физико-химических показателей получаемых препаратов требованиям соответствующих ТУ;
7) провести оценочные технико-экономические расчеты разработанных техно
логий и оценить их эколого-экономическую эффективность;
8) используя физико-химические методы анализа, установить структуры ин-
термедиатов на уровне субстрат - АОБ - фермент, способные научно обос
новать наблюдаемый эффект автокатализа или ингибирования от введения
АОБ в среду гидролиза.
Научная новизна. Впервые с использованием кинетического метода исследований установлены количественные закономерности процесса ферментативного гидролиза биополимеров белковой, липидной, углеводной и нуклеотидной природы техническим препаратами гидролаз.
Впервые показана возможность применения кинетического метода для описания закономерностей ферментативного гидролиза субстратов липидной, белковой и углеводной природы в составе микробного, растительного и животного сырья техническими препаратами гидролаз с участием АОБ.
Установлена единая для всех субстратов, ферментов и АОБ схема ферментативных превращений, учитывающая влияние АОБ на скорость ферментативной реакции. Показано, что ключевыми стадиями, определяющими скорость ферментативного гидролиза в присутствии АОБ, являются образование интермедиатов фермента с АОБ и субстрата с АОБ.
Показана возможность применения выбранного подхода к отличным от гидролаз комплексным ферментным препаратам на примере ферментных систем клеток печени, осуществляющих трансформацию серосодержащих аминокислот (цистеина и цистина) в таурин.
Разработано количественное описание стадий ионного обмена и осаждения продуктов ферментативного гидролиза из водных и водно-спиртовых растворов.
Предложенные кинетические схемы позволят в дальнейшем разработать единый алгоритм управления технологическими процессами получения ферментативных гидролизатов на основе сырья различного происхождения.
Впервые с использованием квантово-химических и термодинамических расчет-тов, подтвержденных физико-химическими методами (УФ-, ИК-спектроскопия) показано, что образование интермедиата АОБ с ферментом происходит за счет образования водородных связей между ОН-группами АОБ и амино- и гидроксогруп-пами аминокислот фермента, расположенными вблизи активного центра, а также гидрофобных взаимодействий. Установлено, что образование интермедиата между АОБ и субстратом также связано с образованием водородных связей.
Практическая значимость. Проведенные исследования явились основой для подбора технологических режимов, обеспечивающих повышение эффективности ферментативного гидролиза биополимеров в составе отходов микробиологической и пищевой промышленности:, а именно: экстракции белковых веществ из биомассы дрожжей и бактерий на примере Saccharomyces cerevisiae и Brevibacterium glu-tamicum техническим ферментным препаратом (ФП) протосубтилином ГЗх, переработки кератинсодержащего сырья в таурин с использованием технических ферментных препаратов протосубтилина ГЗх, ферментных систем поджелудочной железы крупного рогатого скота (ФС ПЖ КРС) и печени быка (ФС КП); получения углеводной фракции из пивной дробины путем ее гидролиза техническим ФП цел-ловиридином ГЗх, грибной глюкоамилазы Aspergillus awamori и панкреатической а-амилазы; получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК и гидролиза жиросодержащих отходов панкреатической липазой.
На основе разработанных кинетических схем подобраны режимы ведения вышеперечисленных процессов ферментативного гидролиза, обеспечивающих степень конверсии субстрата в присутствии АОБ не менее 90%, что позволяет сократить норму расхода ФП и время ведения процесса в 2 - 9 раз.
Разработаны технологические схемы переработки гидролизатов белковой, липидной, нуклеотидной и углеводной природы в конкурентоспособную продукцию медицинского, пищевого и кормового назначения. Используя кинетический метод исследований, обоснованы оптимальные режимы ведения стадий выделения и очистки продуктов гидролиза, основанные на применении методов ультрафильтрации, ионного обмена и осаждения из водных и водно-спиртовых растворов.
Проведена технико-экономическая оценка разработанных технологий, которая показала, что применение АОБ для интенсификации ферментативных процессов приводит к снижению себестоимости продукции в 2- 4 раза за счет снижения затрат на ФП, сокращения длительности технологического цикла и повышения вследствие этого эффективности работы оборудования. На основе эколого-экономической оценки разработанных технологий показано, что предложенные способы переработки отходов позволяют снизить экологический ущерб на 0,5 - 1,5 млн. руб/год.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в разработке направления исследований, получении экспериментальных результатов и их обобщении.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены на Международных и Всероссийских научно-технических конференциях, в том
числе: Международной конференции «Химия и технология лекарственных средств» (Санкт-Петербург, 1994 г), 3 -5-ой и 12-ой Международных конференциях «Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес, экологическое образование» (Самара - Астрахань - Самара, 1998, 1999, 2000, 2007 гг), Заочной научно-практической конференции «Биотехнология в ФЦП «Интеграция» (Санкт-Петербург, 1999 г), Международной конференции «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (Москва, 2000 г), Международной конференции «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология БАВ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Москва -Тверь, 2001 г), 1 - 5 Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2009 гг), Научно-технической конференции «Технологии живых систем» (Москва, 2003 г), XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2003 г), Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006 г), 4 - 5-ой Российских конференциях «Нейроиммунопатология» (Москва, 2006, 2007 г).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано более 60 работ, в том числе 11 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, получено 6 патентов РФ на изобретения. Результаты исследования нашли отражение в 4-х учебных пособиях и монографии, написанной с участием автора.
