Введение к работе
Актуальность проблемы. При использовании различных методов амплификации ДНК часто возникает проблема появления неспецифических продуктов, особенно, если в реакции используется сложная матрица (геномная ДНК или ДНК, способная формировать вторичные структуры) и/или очень низкое количество матричной ДНК. Одним из источников образования неспецифических продуктов во многих случаях может быть способность ДНК-полимераз синтезировать ДНК в присутствии только dNTP. Впервые синтез ДНК термофильными ДНК-полимеразами в отсутствие матричной ДНК и праймера был убедительно продемонстрирован в работах Огата и Миура (Ogata and Miura, 1997; 1998). Авторы назвали наблюдаемый синтез синтезом ДНК аЪ initio. Продуктами синтеза аЪ initio были высокомолекулярные ДНК длиной от 0.1 до 50 т.п.о., состоящие из повторов длиной 8-10 п.о., состав которых зависел от условий реакции. На основании того, что подобные последовательности широко распространены как в сателлитнои ДНК, так и в кодирующих участках генома эукариотов, Огата и Миура выдвинули предположение, что такие тандемные повторы были синтезированы ДНК-полимеразой на определенной стадии эволюции генома и что генетическая информация потенциально может создаваться непосредственно белком. Скорость синтеза ДНК аЪ initio значительно увеличивается при добавлении эндонуклеаз рестрикции (Liang et al, 2004). ДНК, синтезируемая в этом случае, состоит из палиндромных повторов, содержащих один или два сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, участвующей в реакции. Несмотря на то, что в работах, в которых изучается синтез ДНК аЪ initio, реагенты, участвующие в реакции, подвергаются тщательной очистке, тем не менее, это не исключает полностью присутствия следовых количеств ДНК, связанной с ферментами. В связи с этим, в англоязычной литературе этот синтез также называют синтезом, независимым от матрицы и праймера (template/primer-independent DNA synthesis).
Нами обнаружено, что синтез ДНК аЪ initio эффективно стимулируется никующими эндонуклеазами. Никующие эндонуклеазы узнают в двухцепочечной ДНК короткую специфическую последовательность и вносят разрыв (nick) только в одну, предопределенную цепь ДНК в фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Несмотря на то, что никующие эндонуклеазы открыты сравнительно недавно (Абдурашитое и др., 1996), они уже нашли применение в разработке различных методов, в том числе методов, предназначенных для медицинской диагностики. Среди последних методов - изотермическая амплификация олигонуклеотидов
{Van Ness et al, 2003), амплификация случайных последовательностей геномной ЩЇЩСпап S-h., et al, 2004), реакция экспоненциальной амплификации ДНК {Tan Е., et al, 2007), картирование ДНК {Xiao М., et al., 2007), мечение уникальной последовательности в ДНК {Kuhn И., et al, 2008).
Однако использование никующих эндонуклеаз в сочетании с ДНК-полимеразами, как показано в данной работе, приводит к синтезу неспецифических продуктов, с которым столкнулись и другие исследователи. В связи с этим в настоящее время остро стоит проблема избавления от продуктов неспецифического синтеза ДНК в присутствии никующих эндонуклеаз. Изучение возможности ингибирования неспецифического синтеза ДНК аЪ initio проведено в данной работе.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении синтеза ДНК аЪ initio ДНК-полимеразой Bst, стимулируемого никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I.
В ходе исследования решались следующие задачи:
изучить влияние различных никующих эндонуклеаз на синтез ДНК аЪ initio;
изучить зависимость синтеза ДНК аЪ initio от времени и количества никующей эндонуклеазы;
установить структуру ДНК, синтезируемой в присутствии Nt.BspD6I;
определить нуклеотидную последовательность продуктов синтеза ДНК аЪ initio;
изучить влияние белков, связывающихся с оцДНК (белки SSB - single-stranded DNA binding,) на синтез ДНК аЪ initio.
Научная новизна и практическая ценность работы:
Обнаружено, что синтез ДНК аЪ initio ДНК-полимеразой Bst стимулируется различными никующими эндонуклеазами.
Установлено, что ДНК, синтезированная в присутствии Nt.BspD6I, имеет необычную макромолекулярную структуру, которая представлена двухцепочечной ДНК, содержащей разветвленные участки.
Нуклеотидная последовательность ДНК, синтезированной в присутствии Nt.BspD6I, состоит из непалиндромных тандемных повторов сайта узнавания никазы в прямой или обратной ориентации с одним дополнительным dA или dT. Эта последовательность отличается от последовательностей, синтезируемых в присутствии только ДНК-полимеразы {Ogata and Miura, 1997) или полимеразы и эндонуклеаз рестрикции {Liang et al.,2004).
Предложен механизм синтеза ДНК аЪ initio в присутствии никующих эндонуклеаз.
Предложен ингибитор неспецифического синтеза ДНК ab initio -белок gp32 бактериофага Т4.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), 40th Anniversary of the Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences International Conference on "Protein Biosynthesis, Structure and Function" (Pushchino, 2007), 10-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных (Пущино, 2006), ХШ-ой международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ-2006» (Москва, 2006).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 48 рисунков. Список литературы содержит 138 ссылок.
