Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Действие ионизирующих излучений на генетический аппарат клетки 12
1.1.1. Краткая характеристика ионизирующих излучений 12
1.1.2. Образование свободнорадикальных молекул в биологических системах их генотоксическое действие 13
1.1.3. Кинетика химической модификации ДНК при радиационном воздействии 15
1.1.4. Характеристика первичных повреждений ДНК, индуцируемых радиацией и радиомиметиками 16
1.1.5. Повреждения азотистых оснований ДНК 17
1.1.6. Возникновение одно - и двунитевых разрывов сахарофосфатного остова ДНК 17
1.1.7. Сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок 20
1.2. Краткая характеристика антиокислительных механизмов защиты облученной клетки 21
1.3. Репарация повреждений ДНК как общебиологический механизм защиты генома 22
1.3.1. Защита генетического аппарата клетки от повреждений репаративными системами 22
1.3.2. Эксцизионная репарация ДНК как показатель способности клетки к восстановлению индуцированных повреждений 25
1.4. Особенности репаративного синтеза ДНК в клеточных системах 29
1.4.1. Общие принципы оценки генетического риска по эффективности внепланового синтеза ДНК 29
1.4.2. Индукция ВС ДНК ультрафиолетовым облучением 31
1.4.3. ВС ДНК как показатель индивидуальной чувствительности к различным мутагенным факторам окружающей среды 32
1.4.4. Стимуляция эффективности репаративного синтеза ДНК природными антиоксидантами 33
1.5.Рольэксцизионной репарации в формировании адаптивной реакции 35
1.6. Эффективность репаративного синтеза ДНК в клетках крови лиц, подвергшихся внешнему и внутреннему облучению 36
1.7. Репарация ДНК и цитогенетические эффекты при действии ионизирующей радиации 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Формирование групп обследования 44
2.2. Сбор образцов крови и цитогенетический анализ препаратов 50
2.2.1. Получение препаратов метафазных хромосом лимфоцитов 50
2.2.2. Анализ нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови (классический цитогенетический метод) 52
2.3. Определение эффективности репаративного синтеза ДНК в клетках периферической крови профессионалов и в контрольной когорте 53
2.4. Статистическая обработка результатов 55
Результаты и обсуждение 57
Глава 3. Анализ эффективности внепланового синтеза ДНК в клетках профессионалов-атомщиков и в контрольной группе 57
3.1. Оценка средней эффективности внепланового синтеза ДНК в клетках крови профессионалов и в контроле 57
3.2. Зависимость индекса ВС ДНК от возраста доноров 59
3.3. Дозовая зависимость индукции репаративного синтеза ДНК 60
3.4. Анализ зависимости эффективности внепланового синтеза ДНК от курения 65
3.5. Анализ зависимости эффективности внепланового синтеза ДНК от приема витаминов 66
Глава 4. Анализ цитогенетических нарушений в группе профессионалов-атомщиков и в контрольной когорте 70
4.1. Цитогенетический анализ лиц контрольной когорты 70
4.2. Цитогенетическое обследование профессионалов-атомщиков 73
4.3. Зависимость цитогенетических показателей в исследуемых когортах от > курения и витаминотерапии 79
4.3.1. Анализ цитогенетических показателей в контрольной группе 79
4.3.2. Анализ цитогенетических показателей в группе профессионалов 81
Глава 5. Сравнительный анализ индекса репарации ДНК и цитогенетических показателей 82
5.1. Эффективность внепланового синтеза ДНК и цитогенетические нарушения в клетках крови контрольной когорты 82
5.2. Эффективность внепланового синтеза ДНК и цитогенетические нарушения в клетках крови профессионалов 84
Заключение 92
Выводы 96
Приложение 98
Список цитированной литературы
- Действие ионизирующих излучений на генетический аппарат клетки
- Получение препаратов метафазных хромосом лимфоцитов
- Оценка средней эффективности внепланового синтеза ДНК в клетках крови профессионалов и в контроле
- Цитогенетический анализ лиц контрольной когорты
Введение к работе
Бурное развитие ядерной энергетики и продолжение испытания ядерного оружия сопровождаются возрастающим риском поступления в окружающую среду радиоактивных отходов, локального или глобального повышения радиационного фона на Земле, возрастающего риска техногенных аварий. Возрастает число персонала, занятого в высокотехнологичных отраслях атомной промышленности. Значительные группы населения проживают на радиационно-загрязненных территориях. В связи с этим трудно переоценить актуальность исследования потенциальных возможностей организма и популяций в целом противостоять повреждающему действию хронического облучения, а также изучения генетических последствий хронического действия ионизирующего излучения (ИИ) и других ДНК-тропных агентов (Дубинин, 1978, Тимофеев-Ресовский и др., 1968).
В этих случаях могут быть применены биологические методы регистрации радиационного поражения, позволяющие оценить суммарный эффект действия радиации. Такая информация имеет, несомненно, большое значение для оказания эффективной помощи в случае острого радиационного воздействия, а также для прогностической оценки возможных отдаленных последствий облучения (Бочков, 1971,Hagmaretal, 1994).
Наибольшее распространение получили методы оценки радиационного поражения организма, основанные на анализе частоты радиациопно-индуцированных генетических изменений в соматических клетках - геномных, хромосомных или генных мутаций. Одним из самых разработанных и обоснованных является классический цитогенетический метод, при котором в качестве биологического маркера облучения используются хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови. Материалы многочисленных отечественных и зарубежных цитогенетических исследований послужили основой для выработки рекомендаций ВОЗ, МАГАТЭ, НКДАР ООН по практическому использованию данного метода при определении доз облучения (ICRP, 1974, UNSCEAR, 1982).
Ионизирующие излучения ингибируют систему репарации клеточной ДНК, либо приводят к ошибкам в процессе восстановления повреждений. Оставшиеся нерепарированными повреждения вызывают клеточную гибель, образование хромосомных аберраций, а в отдаленные сроки после облучения могут приводить к хромосомной или генетической нестабильности и снижению продолжительности жизни (Hagmar et al, 1998). При этом радиоустойчивость клетки и всего организма в целом определяется в значительной степени способностью к восстановлению от повреждений ее генетического аппарата, т.е. репарацией ДНК.
Снижение эффективности репарации ДНК в клетках, подвергшихся повреждающему мутагенному воздействию, носит общебиологический характер. Оно проявляется в различных организмах (человек, растения, млекопитающие) и на различных уровнях (молекулярном, клеточном) после действия мутагенных факторов различной природы - химических мутагенов, ионизирующего, УФ -излучений. Показана зависимость между снижением эффективности репарации ДНК и повышенной частотой спонтанных хромосомных аберраций в клетках эукариот и человека (Жестяников, 1979, Ulrich & Davis, 1999). С другой стороны, есть данные о зависимости репарационного статуса от мощности дозы хронического облучения для различных популяций растений (Семов, 1987).
Таким образом, снижение эффективности работы репарационных клеточных систем при длительном хроническом облучении может быть одним из проявлений отдаленных последствий действия радиации, что в дальнейшем может являться причиной радиационно-индуцированного мутагенеза и канцерогенеза, выявляемого через несколько десятков лет после воздействия радиации.
Актуальность проблемы.
Основной задачей радиационно-эпидемиологических исследований является установление взаимосвязи между наблюдаемыми эффектами (например, повышением заболеваемости и/или смертности) и уровнем радиационного воздействия. Однако в профессиональных условиях работы с источниками ионизирующих излучений возможно возникновение таких ситуаций, когда определение поглощенной дозы с помощью физической дозиметрии может быть ограничено или невозможно (неоднородность облучения, несовершенство или
8 отсутствие дозового контроля и др.). Результаты обследования лиц, профессионально связанных с излучением, особенно важны для категории занятых на вредных производствах по нескольку десятков лет, поскольку требования к радиационной безопасности стали ужесточаться лишь с 60-х годов XX века. В этих случаях становятся актуальными биологические методы дозиметрии, позволяющие оценить суммарный эффект от воздействия радиации с учетом индивидуальных особенностей облученного организма. Классический цитогеиетический анализ, позволяющий учитывать частоту нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови, в современных условиях является определяющим при проведении широкомасштабного цитогенетического мониторинга в группах людей, подвергшихся облучению в процессе своей профессиональной деятельности и при аварийных ситуациях. С другой стороны, вопрос оценки репарационного статуса облученных лиц также представляет огромное практическое значение. Результаты комплексного цитогенетического обследования и анализа эффективности репаративных процессов позволяют в достаточной мере оценить степень повреждения и дестабилизации генома в целом, а также могут быть одним из ранних критериев формирования групп повышенного риска возникновения различных заболеваний, в том числе онкологических.
Цель исследования:
Изучить состояние генома клеток крови профессионалов - атомщиков в отдаленные сроки после облучения. Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:
Изучить эффективность УФ-индуцированного репаративного внепланового синтеза ДНК в клетках крови профессионалов-атомщиков, сотрудников РФЯЦ-ВНИИЭФ, подвергавшихся действию хронического фракционированного гамма-нейтронного облучения, а также в контрольной когорте сотрудников ВНИИЭФ.
Оценить уровень нестабильных хромосомных аберраций в клетках крови профессионалов и в контрольной группе.
Изучить зависимость цитогенетических нарушений и эффективности репаративного синтеза ДНК от суммарной поглощенной дозы в когорте профессионалов-атомщиков.
Проанализировать возможные зависимости цитогенетических нарушений и эффективности внепланового синтеза ДНК от возраста и образа жизни в когорте профессионалов и в контрольной когорте.
Изучить возможную взаимосвязь эффективности репаративного синтеза ДНК и цитогенетических нарушений в клетках крови профессионалов и в контрольной группе.
Научная новизна исследования
В рамках одного исследования проведено комплексное цитогенетическое обследование и выполнен анализ репарационного статуса представительной когорты профессионалов - атомщиков спустя 30-40 лет после начала работы во вредных условиях труда, а также соответствующей контрольной группы.
Показана эффективность низкоинтенсивного хронического фракционированного облучения в отношении индукции цитогенетических повреждений в соматических клетках человека. На основании полученных экспериментальных данных в исследуемой группе профессионалов обнаружены повышенный уровень хромосомных аберраций и сниженная эффективность репарации ДНК. Выявлено превышение уровня цитогенетических повреждений и снижение репарационных возможностей клеточных систем при остром аварийном облучении по сравнению с длительным фракционированным в отдаленные сроки.
Впервые выявлена взаимосвязь между нестабильными хромосомными аберрациями в циркулирующих клетках крови и интегральной эффективностью репаративных клеточных систем в группе профессионалов-атомщиков. Таким образом, на клеточном уровне показано сохранение последствий влияния внешнего гамма-нейтронного облучения на репарационные процессы спустя несколько десятилетий после воздействия.
В рамках одного исследования установлены зависимости эффективности репаративного синтеза ДНК и маркеров радиационного поражения (дицентриков и
10 центрических колец) от дозы ионизирующего излучения в отсутствие влияния других внешних факторов.
Практическая значимость исследования
Полученные результаты свидетельствуют об информативности и важности анализа нестабильных хромосомных аберраций для регистрации радиационного поражения в отдаленные сроки. Вместе с оценкой репарационного статуса облученных лиц оба показателя могут служить прогностически важными критериями при оценке риска возникновения онкозаболеваний.
Положения, выносимые на защиту
Снижение эффективности репаративного (внепланового) синтеза ДНК в клетках крови профессионалов-атомщиков по сравнению с соответствующим контролем.
Сохранение цитогенетических нарушений в циркулирующих клетках крови спустя 30-40 лет после начала работы в условиях хронического фракционированного низкоинтенсивного гамма-нейтронного излучения.
Зависимость интегрального показателя репаративного синтеза ДНК и частоты хромосомных аберраций в клетках крови профессионалов-атомщиков от величины суммарной накопленной дозы при отсутствии влияющих на репарацию дополнительных внешних факторов.
Существование отрицательной корреляционной зависимости между уровнем цитогенетических нарушений и эффективностью репаративного синтеза ДНК в клетках крови профессионалов и в контрольной группе.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара «Проблемы генетической безопасности» Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Основные положения диссертации доложены на международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков» (Москва, 2000), международном семинаре МНТЦ (Новосибирск, 2001); международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» (Москва, 2002), межотраслевой научно-технической конференции «Охрана природы и экологическая безопасность на предприятиях Минатома» (Саров, 2002), международной конференции «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Феодосия, 2003), международном совещании «Человек и электромагнитные поля», (Саров, 2003), молодежной школе-семинаре «Промышленная безопасность и экология» (Саров, 2004), межотраслевом совещании «Разработки методов и аппаратуры для медицины, выполняемые сотрудниками ВНИИЭФ, ИПФ РАН, ННМА и ННГУ» (Саров, 2005).
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 20 публикациях: 8 статьях и 12 тезисах докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и литературного обзора, описания материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, выводов, заключения, приложения и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, в число которых входит 19 таблиц, 25 рисунков и 7 формул. Список цитированной литературы включает 187 источников, из них 87 иностранных.
Благодарность
Автор выражает глубокую благодарность коллективам лабораторий, без помощи и всесторонней поддержки которых выполнение исследований по теме диссертации было бы невозможным: - радиобиологической лаборатории РФЯЦ-ВНИИЭФ (г. Саров) под руководством к.б.н. Т.И. Хаймович; - цитогенетической лаборатории РНЦ Рентгенорадиологии МЗ РФ (г. Москва) под руководством к.б.н. Г.П. Снигиревой;
В.А. Шевченко - лаборатории радиационной генетики Института общей генетики РАН (г. Москва) под руководством д.б.н., профессора
Автор глубоко признателен за оказанные помощь и поддержку лично профессору
В.А.Шевченко
Г.П. Снигиревой, Т.И. Хаймович, Т.В. Елисовой,
Г.Д. Засухиной, Е.П. Лобкаевой и В.И. Викторову.
Действие ионизирующих излучений на генетический аппарат клетки
Все ионизирующие излучения можно подразделить на непосредственно ионизирующие и косвенно ионизирующие. В случае косвенно ионизирующего излучения, т.е. потока незаряженных частиц (нейтроны, гамма-кванты) в среде образуются заряженные частицы (протоны и ядра отдачи, высокоэнергетические электроны), способные вызвать вторичную ионизацию и возбуждение атомов среды.
Ионизирующая способность вторичных электронов и других заряженных частиц зависит от их энергии (скорости) и количественно характеризуется плотностью ионизации на единицу пути или линейной передачей энергии (ЛПЭ). В зависимости от величины ЛПЭ различают плотно- и редкоионизирующие излучения. Как правило, редкоионизирующими являются р - и у - излучения, а плотноионизирующими - а - излучение, нейтронное или потоки ускоренных ядер.
Значение ЛПЭ - важнейшая биофизическая характеристика излучения, от которой зависит показатель его биологической эффективности или «качества». Однако и при одинаковой ЛПЭ различные типы излучений могут иметь не равные значения биологической эффективности (ICRP, 1974, Ильин и др., 1999). Количественной оценкой эффективности различных видов ионизирующих излучений для конкретных биологических систем является коэффициент ОБЭ (относительной биологической эффективности). Он определяется из соотношения: поглощенная доза, необходимая для получения данного биологического эффекта при воздействии рентгеновского излучения 200 кэВ (в Гр) ОБЭ= поглощенная доза исследуемого излучения, необходимая для получения того же биоэффекта (в Гр)
Определяя ОБЭ в каждом конкретном случае, необходимо учитывать, что её значение может меняться в зависимости от того однократно, дробно или хронически поглощались дозы излучения объектом, а так же от мощности дозы. В радиационной безопасности используют усреднённые величины ОБЭ, полученные экспериментально на различных системах (Москалев, 1989).
Энергия заряженных частиц или образующихся вторичных электронов обычно много больше энергии любых химических связей, поэтому эффективность воздействия заряженных частиц зависит только от электронной плотности объекта, а характер химической связи роли не играет. Именно поэтому ионизирующее излучение принято называть неспецифическим агентом. Любая молекула в клетке (в том числе и ДНК) при облучении может быть ионизирована. Хотя первоначальный акт поглощения энергии может происходить с одинаковой вероятностью в любом месте макромолекулы, существует возможность миграции поглощённой энергии и её локализации в определённом «слабом звене», которое и будет претерпевать дальнейшее химическое превращение. Факт миграции энергии чётко показан для белков, он справедлив и для ДНК. В случае миграции энергии с ДНК на белок молекула белка может оказывать радиозащитное действие для ДНК при прямом действии радиации в отличие от классического радиопротекторного эффекта, связанного с перехватом свободных радикалов, обуславливающих косвенное действие облучения (UNSCEAR, 1993).
В последние десятилетия изучение биологической роли свободнорадикальных процессов и их значения в формировании различных патологий приобрело приоритетное значение. Большое внимание привлекает исследование свободнорадикальных (радикалов активных форм кислорода и оксида азота) механизмов повреждающего действия различных видов мутагенов. Можно считать твердо установленным, что в развитии таких болезней, как рак, ишемия, гипертензия, болезни пожилого возраста, иммунные расстройства, диабет и др., свободные радикалы играют главную роль (Владимиров, 2004). Термин «активные формы кислорода» (АФК) объединяет собственно свободные радикалы кислорода и их органические производные (см. таблицу 1), приводится по Дурневу и Середенину (1998).
При действии ИИ активные свободные радикалы образуются на сахарофосфатной цепи ДНК, а также на пуриновых и пиримидиновых основаниях. Реакции разнообразных свободных радикалов приводят к образованию около 30 различных продуктов модифицированной ДНК, которые обнаружены в живых клетках и модельных системах. В клетках эукариот ДНК преимущественно находится в составе ядер; основные компоненты клеточного ядра - это гистоновые и негистоновые белки (их общая концентрация составляет около 20%); различные виды РНК (концентрация около 0,5-1,5%); ядерная ДНК (около 1%); а также несколько процентов составляют липиды матрикса и клеточных мембран (Тарасов, 1982).
При взаимодействии ДНК со свободными радикалами типа перекисей (Н20+) в актах ионизации образуются нейтральные радикалы 2-дезокирибозила по механизму косвенного действия ИИ: ОН + HR = Н20 + R К основным типам повреждений сахарного фрагмента ДНК относят образование однонитевых разрывов (ОР), щелочно-лабильных сайтов (ЩЛС) в сахарофосфатпом остове ДНК, появление среди продуктов радиолиза полимеров свободных азотистых оснований, а также изменение свободной конформациионной структуры 2-дезоксирибозила. Под действием повышенной температуры в молекуле ДНК могут образовываться апуриновые либо апиримидиновые сайты (АП-сайты), т.е. участки ДНК, где сохраняется углеводно-фосфатный остов ДНК, но отсутствуют пуриновые либо пиримидиновые основания.
Получение препаратов метафазных хромосом лимфоцитов
Оценку внепланового синтеза ДНК (ВС ДНК) в клетках крови проводили непрямым методом с использованием тестирующего УФ - облучения по модифицированной методике (Madden et al, 1986, Семов, 1995).
Внеплановый синтез ДНК оценивали по степени включения меченного тритием тимидина в клетки крови при кратковременной инкубации с питательной средой. Для разделения внепланового синтеза ДНК и остаточного репликативного синтеза ДНК использовали гидроксимочевииу. Известно, что гидроксимочевина не влияет на репаративные системы клетки, но является специфическим ингибитором репликативного синтеза ДНК (Досон и Джонс, 1991). Тимидин, не включенный в цепь ДНК при внеплановом синтезе, осаждали промыванием в трихлоруксусной кислоте на стеклянноволокнистых фильтрах. Количество радиоактивности в кислотонерастворимой фракции на фильтрах является показателем эффективности репаративного синтеза, поскольку оно покажет относительное количество встроившегося при репарации тимидина. Методика определения эффективности репаративного синтеза ДНК:
1. Образцы цельной крови в количестве 25 мкл помещали в лунки плоскодонных иммунологических плашек в двух вариантах - для необлученного контроля и УФ - облучения - и выдерживали 20 мин при 2-4С для образования клеточного монослоя толщиной 1 мм.
2. Для определения резервной способности системы репарации клеток крови человека проводили тестирующее УФ - облучение проб крови (Х=254 нм) на г расстоянии 15 см в течение беек. Для УФ-облучения клеток крови использовали лампу «Филипс», Голландия (паспортная мощность 15 Дж/м с) и специально разработанное в РФЯЦ-ВНИИЭФ устройство с таймером УТ23РІС «Овен», позволяющим регулировать длительность облучения. Схема таймерного устройства приведена в Приложении. Общая доза облучения составляла 60 Дж/м . Эта доза находится в области плато кривой графической зависимости «доза УФ -интенсивность ВС ДНК», что указывает на насыщение включения 3 Н - тимидина (Спитковский, 1994). Каждую пробу анализировали в трех повторностях. 3. Непосредственно после облучения в лунки добавляли по 150 мкл культуральной среды, содержащей 5 мМ гидроксимочевины (ICN, США), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РАА Laboratories, Австрия), питательную среду RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) и 3Н-тимидин (Россия) (удельная активность 40МБк/мл) в конечной концентрации 10 мкКи/мл.
4. Инкубацию крови в плашках проводили в течение 3 час при 37С. Репаративный синтез останавливали замораживанием плашек с пробами при -20С.
5. После размораживания пробы трижды промывали 5%-ной холодной трихлоруксусной кислотой (Россия) при рН=1,2 и дважды - холодным 95%-ным этанолом (Россия) на стеклянноволокнистых фильтрах «Whatman».
6. Подсчет радиоактивности (числа распадов в минуту), включенной в кислотоперастворимую фракцию ДНК, осуществляли в толуольном сцинтилляторс на автоматическом жидкостном сцинтилляционном счетчике "Guardian 1414" (Финляндия). Толуольный сцинтиллятор включал по 0,25 г 1,4-бис-фенилоксазол-2-"УЪ-бензена (РОРОР) и 2,5 г 2,5-дифенилоксазола (РРО) - оба производства ICN, США - на 1000 мл толуола (Россия).
7. Счет бета-активности проб проводили в течение двух лет с использованием различных партий третированного тимидина, поэтому для повышения точности измерений использовали компьютерное обеспечение сцинтилляционного счетчика "Guardian 1414". Оно позволило при измерениях делать поправку на дату производства 3Н-тимидина, на температуру воздуха в рабочем помещении, а также соблюдать заданную погрешность счета (± 2,5%).
8. В качестве меры способности клеток каждого донора к репарации ДНК использовали коэффициент внепланового синтеза ДНК (Куф), рассчитанный с учетом средней величины для трёх повторностей по формуле: Куф = dpmyo / dpiriKOHTP, (1) где dpmyo - среднее число распадов за 1 мин, вариант с УФ - облучением; dpmK0HTP - среднее число распадов за 1 мин, вариант без облучения.
Данный показатель является относительным, он не зависит от индивидуальной концентрации лимфоцитов в крови и не требует выделения лимфоцитов и подсчета числа клеток. Использование повторностей (внутренний контроль) позволяет уменьшить погрешность при определении среднего значения величины DPM. Таким образом оценивали интегральную резервную способность системы репарации в клетках крови профессионалов основной когорты (108 человек) и в клетках крови контрольной группы (30 человек).
Статистическая обработка результатов.
Для оценки достоверности различий цитогенетических показателей и величины индекса репарации Куф в различных выборочных группах использовали параметрический и непараметрический критерии сравнения. Выбор критерия осуществляли на основании соответствия параметров распределения данного показателя и значения индекса репарации Куф нормальному закону (Гланц, 1999, Лапач и др., 2000, Плохинский, 1970).
Критерий X (лямбда) Смирнова-Колмогорова применяли для определения достоверности расхождений между распределениями в основной и контрольной группах. Критерий А, рассчитывали по формуле: Я = max Ii , 2 2 п\ т Іп] + п2 (2) где р р -значения конкретного показателя в выборочных группах (или 1 2 количество человек в возрастных когортах); пь п2 - объемы выборочных групп.
При соответствии распределения исследуемого показателя в обеих выборочных группах нормальному закону использовали t-критерий (Стыодента) с учетом числа степеней свободы; при несоответствии - двухвыборочный критерий Уилкоксона W. Для сравнения достоверности различий сравниваемых групп по цитогенетическим показателям (т.е. при сравнении частот редких событий) использовали F-статистику Фишера: - распределение Фишера ассиметрично; F-критерий определяется значениями дисперсий с учетом числа степеней свободы. Оценку F-критерия проводили согласно методическим рекомендациям (Снигирева с соавт., 2003). Для множественных сравнений использовали параметрический критерий Стыодента с поправкой Боиферрони к, учитывающей многократность сравнения (Гланц, 1999):
Оценка средней эффективности внепланового синтеза ДНК в клетках крови профессионалов и в контроле
Распределения относительного показателя репаративного синтеза ДНК (Куф) в основной и контрольной когортах носили нормальный характер и достоверно различались по критерию X Колмогорова - Смирнова (к = 1,42, р 0,05, см. рис. 7).
Индивидуальная вариабельность показателя эффективности УФ -индуцированного ВС ДНК в широких пределах (от 0,85 до 2,47 в группе профессионалов и от 0,9 до 2,50 в контрольной группе) обусловлена, по-видимому, генотипическими особенностями организма. Доля профессионалов, у которых индуцированный репаративный синтез отсутствовал (Куф 1), составила 6,5% (8 человек, из них один «аварийщик»). В контрольной группе выявлено отсутствие репаративного синтеза ДНК у двух человек. Результаты оценки интенсивности
УФ-индуцированного ВС ДНК в клетках периферической крови профессионалов -атомщиков и контрольной группы (г. Саров) представлены в табл. 9 и на рис. 8. Для сравнения приведены данные по индукции ВС ДНК в группе здоровых доноров среднего возраста (г. Москва), опубликованные в литературе (Семов, 1995).
Показано, что исследуемая группа профессионалов - атомщиков достоверно отличается по усредненному индексу УФ - индуцированного ВС ДНК от обеих контрольных групп. При этом различие по величине индекса ВС ДНК более выражено при сравнении профессионалов с «молодым» контролем. Полученные данные в целом указывают на ингибирование системы репарации в клетках крови профессионалов в отдаленные сроки после облучения, что является прогностически неблагоприятным признаком.
При этом эффективность ВС ДНК была максимально снижена либо отсутствовала у лиц, проживающих в наиболее радиационно-загрязненных районах, расположенных географически ближе к полигону. Однако в исследовании была также отмечена закономерность: индекс репарации снижался лишь до определенного предела, т.е. также существовал выход на плато.
Противоречивая картина наблюдается при анализе ВС ДНК в клетках крови лиц, занятых в химически вредных производствах. Снижение индекса репарации зарегистрировано у занятых на производстве этилена и пропилена аппаратчиках органического синтеза (Pero et al, 1982), при этом была показана достоверная отрицательная корреляционная зависимость индекса репарации от стажа работы. Однако при обследовании профессионалов, длительное время работавших во вредных условиях никелевого производства, не найдена какая-либо зависимость индекса репарации от стажа работы и от накопленной концентрации никеля в организме (Перминова с соавт., 2001). В демографическом исследовании Knudsen et al (1999) также не найдена какая-либо зависимость величины индекса химически индуцированного ВС ДНК от стажа и интенсивности работы во вредных условиях у водителей автобусов и почтовых работников Копенгагена.
Таким образом, показано, что спустя несколько десятков лет после облучения сохраняется тенденция к снижению индекса ВС ДНК с выходом на плато при росте поглощенной дозы.
Для анализа возможного влияния аварийных ситуаций на эффективность ВС ДНК в группе профессионалов, подвергшихся острому аварийному облучению, изучали зависимость индекса репарации от величины суммарной поглощенной дозы (при этом вклад дозы аварийного облучения был максимальным) - см. рисунок 12. В целом в этой выборочной группе не было выявлено дозовой корреляции индекса репарации (г = -0,09; р 0,05). Для более подробного анализа в группе профессионалов (108 человек) были сформированы две однородные группы, имеющие значения Куф выше и ниже крайних квартилей («верхняя» и «нижняя» группы) - см. раздел «Статистическая обработка данных». Каждая из этих групп включала одинаковое количество человек - 27 (четвертая часть всей когорты) и имела соответственно максимальное или минимальное усредненное значение Куф. В «верхней» и «нижней» группах были выделены т.н. «аварийщики» - лица, в ходе своей профессиональной деятельности подвергшиеся аварийному острому облучению (см. таблицу 10).
1 Средняя суммарная поглощенная доза в двух группах достоверно не отличалась, но при этом величина Куф в «верхней» группе в 1,68 раза с высокой степенью достоверности превышала величину Куф в «нижней» группе (р 0,001).
Среднее значение Куф в «верхней» группе превышало среднее значение Куф в контрольной группе (г. Саров). Оказалось, что количество "аварийщиков" в нижней группе достоверно превысило число «аварийщиков» в верхней группе (р 0,05). Таким образом, достоверно большее количество людей, подвергшихся аварийным ситуациям, попали в группу сравнения, где КУф был максимально снижен. Этот факт можно объяснить большей степенью неполноценности систем репарации после острого аварийного облучения по сравнению с хроническим фракционированным облучением спустя несколько десятков лет после воздействия. Опубликованные данные подтверждают полученные нами результаты: Окладникова с соавт. (2005) анализировали отдаленные цитогенетические эффекты в клетках крови профессионалов, перенесших острую » (ОЛБ) и хроническую (ХЛБ) формы лучевой болезни с сопоставимыми дозами и сроками работы и выявили более выраженные цитогенетические нарушения в случаях ОЛБ по сравнению с ХЛБ. Авторы полагают, что по сравнению с острым аварийным облучением длительное фракционированное внешнее гамма-облучение приводит к протяженному во времени повреждению генетических структур в условиях: а) их адаптации к повреждающему фактору и б) более благоприятных условиях репарации возникающих повреждений ДНК. т Котеров (2000) в обзоре, посвященном эффектам малых доз (до 50 сГр), анализируя работы различных авторов, также сделал вывод о большей эффективности острого облучения в истощении емкости репаративных систем по сравнению с хроническим облучением.
Цитогенетический анализ лиц контрольной когорты
Анализ спонтанного уровня хромосомных аберраций проводили в группе здоровых доноров, проживающих в тех же социально-экологических условиях, что и профессионалы - атомщики. Это позволило учесть влияние на спонтанный уровень хромосомных аберраций таких факторов, как особенности питания, образ жизни, а также возможное загрязнение окружающей среды.
В таблице 11 представлены средние значения хромосомных аберраций в обследуемой контрольной группе (г. Саров). Были зарегистрированы все типы хромосомных и хроматидных аберраций. Общая частота хромосомных аберраций составила 0,92 ±0,04 на 100 проанализированных клеток. 44% от выявленных хромосомных аберраций составили аберрации хромосомного типа - дицентрики, центрические кольца, парные фрагменты и транслокации. 56% от общего количества аберраций составили аберрации хроматидного типа - одиночные фрагменты и обмены. Средняя частота зарегистрированных дицентриков и центрических колец составила 0,07 ± 0,01 на 100 клеток. Доля вторых митозов при культивировании лимфоцитов крови в течение 48-50 часов составила 2-5%.
Сведения о спонтанном уровне хромосомных аберраций чрезвычайно важны для выявления эффектов действия ионизирующих излучений на клеточном уровне, поскольку полученные одинаковые результаты могут быть по-разному описаны из-за межлабораторных различий. В работе Семенова (2003) приведены данные о спонтанном уровне нестабильных хромосомных обменов в контрольных популяциях людей для различных лабораторий. Исследователи анализировали значительное количество метафаз (до 108 тысяч). Однако уровень дицентриков и колец варьировал у разных исследователей от 0,01 ± 0,01 (Севанькаев и др., 1987) до 0,26 ± 0,03 (Awa et al, 1978) и 0,31 ± 0,05 (Ganguly et al, 1993). Для сравнения данных нашего исследования в таблице 11 приведены сведения о частоте хромосомных аберраций, полученные в РНЦ РР при обследовании контрольной группы лиц, проживающих в г. Москве (Снигирева и др., 2000). Показано, что две контрольные группы значительно (почти в 4 раза) отличаются друг от друга по сумме дицентриков и центрических колец.
Для более полного представления о спонтанном уровне хромосомных аберраций, в том числе нестабильных хромосомных аберраций (дицентриков и центрических колец), был проведен анализ корреляционной зависимости исследуемых цитогенетических показателей от возраста доноров - сотрудников РФЯЦ - ВНИИЭФ. Корреляционный анализ не выявил зависимости спонтанного уровня хромосомных аберраций от возраста в контроле (см. табл. 12 и рис. 16). Скорее всего, это объясняется относительной однородностью по возрасту лиц контрольной когорты.
Для всех профессионалов-атомщиков, включенных в группу обследования, был проведен рутинный цитогенетический анализ, позволивший выявить уровень нестабильных хромосомных аберраций, в том числе дицентриков и центрических колец - маркеров радиационного воздействия. В общей сложности было проанализировано 104536 метафаз, обнаружено 1898 хромосомных аберраций, из которых 12% (223 аберрации) составили дицентрики и центрические кольца, 34% (638 аберраций) - парные фрагменты, 50% (958 аберраций) аберрации хроматидного типа и 4% (76 аберраций) составили атипичные моноцентрики. Следует отметить, что большинство наблюдаемых аберраций хроматидного типа были хроматидными фрагментами. В среднем для каждого обследуемого пациента было проанализировано 968 метафаз. Распределение суммарной частоты аберраций, частоты дицентриков и колец, парных фрагментов и хроматидных аберраций в группе профессионалов-атомщиков и в контрольной группе представлено на рисунках 17 - 20. Различия между распределением частот аберраций в группах сравнения достоверны по критерию X Колмогорова -Смирнова (р 0,001).Статистический анализ полученных данных позволил выявить достоверные различия по всем цито генетическим показателям. Средняя общая частота хромосомных аберраций в группе профессионалов составила 1,82 на 100 клеток, что в 2 раза выше аналогичного показателя в контрольной группе. Частота парных фрагментов и аберраций хроматидного типа также достоверно превышает контрольные значения в 2 раза. Что касается маркеров радиационного воздействия - дицентриков и колец,- то их частота в группе профессионалов почти в 3 раза превышает частоту в контрольной группе. Доля кольцевых хромосом среди аберраций обменного типа в контрольной группе составила 12%, в группе профессионалов 7%. Полученные данные хорошо согласуются с данными литературы о соотношении центрических колец к дицентрикам при хроническом облучении лимфоцитов в малых дозах in vitro: доля колец обычно составляет 5 10% (Salomaa et.al., 1997). Высокое соотношение колец к дицентрикам в контрольной группе связано, по-видимому, с общим высоким спонтанным уровнем ХА и с пожилым возрастом доноров.
Была проанализирована зависимость частоты хромосомных аберраций от суммарной поглощенной дозы (т.е. от дозы, накопленной на момент обследования). Статистический анализ не выявил достоверных корреляционных связей между общей частотой хромосомных аберраций и суммарной дозой облучения профессионалов-атомщиков. Коэффициент корреляции для общей частоты хромосомных аберраций составил г = 0,132 (р 0,05). Для частоты дицентриков и центрических колец этот коэффициент был выше - 0,253 (р 0,01). Дозовая зависимость частоты дицентриков и центрических колец в группе профессионалов - атомщиков представлена на рисунке 21. Однако достоверность данной корреляционной зависимости оказалась обусловлена единственной точкой - 0,71 на 100 проанализированных метафаз при поглощенной дозе 510 сЗв. При изъятии этой точки дозовая зависимость становится статистически незначимой.
Окладникова с соавт. (2005) не выявили корреляции частоты ХА с накопленной дозой при длительном фракционированном гамма - облучении работников ядерных предприятий (дозы составили 3-8,5 Зв, стаж работы - до 40 лет). В ряде исследований генетических эффектов у ликвидаторов Чернобыльской аварии (где проводилась точная физическая дозиметрия) также не обнаружена взаимосвязь между данными дозиметрии и частотой нестабильных хромосомных аберраций в отдаленные сроки (6-8 лет) после участия в ликвидации последствий аварии (Lazutka & Dedonite, 1995, Sevan kaev, 1995, Богомазова, 2000).
Таким образом, проведенный цитогенетический анализ позволил выявить среди циркулирующих лимфоцитов периферической крови профессионалов-атомщиков клетки с хромосомными аберрациями - дицентриками и центрическими кольцами, индуцированными облучением в отдаленные сроки (30-40 лет).
В группе профессионалов 26 человек перенесли острое аварийное облучение (см. раздел «формирование групп обследования»).
