Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Распределение радионуклидов в озерных экосистемах 11
1.2 Особенности накопления радионуклидов в тканях рыб 14
1.3 Радиационно-индуцированные генотоксические эффекты 19
1.4 Биологические эффекты радиационного воздействия на рыб 33
ГЛАВА 2.Материалы и методы 41
2.1 Объект исследований 41
2.1.1 Характеристики вида плотва обыкновенная (Rutilus rutilus. L) 41
2.2 Характеристика исследуемых водоемов . 42
2.2.1 Характеристика водоема В-4 44
2.2.2 Характеристика водоема В-10 45
2.2.3 Характеристика водоема В-11 46
2.2.4 Характеристика Буферного водоема 47
2.2.5 Характеристика Шершневского водохранилища 48
2.3 Химический состав воды исследуемых водоемов 49
2.4 Содержание радионуклидов в воде и донных отложениях исследуемых водоемов 51
2.5 Содержание радионуклидов и расчет доз для плотвы из исследуемых водоемов 54
2.6 Методы исследования 58
2.6.1 Сбор ихтиологического материала 58
2.6.2 Определение морфометрических показателей плотвы 58
2.6.3 Определение кормовой базы для плотвы в исследуемых водоемах 60 2.6.4 Определение уровня повреждения и репарации ДНК клеток периферической крови плотвы с помощью метода ДНК-комет 61
2.6.5 Определение частоты эритроцитов с микроядрами в периферической крови плотвы 63
2.6.6 Определение частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями в периферической крови плотвы 64
2.6.7 Статистический анализ 67
ГЛАВА 3. Морфометрические показатели плотвы из исследуемых водоемов 68
3.1 Возрастная структура уловов плотвы из исследуемых водоемов 68
3.2 Размерные показатели плотвы из исследуемых водоемов 69
ГЛАВА 4. Оценка генотоксических эффектов техногенного загрязнения исследуемых водоемов 75
4.1 Оценка повреждения и репарации ядерной ДНК клеток периферической крови плотвы методом ДНК-комет 76
4.2 Оценка частоты эритроцитов с микроядрами в периферической крови плотвы 83
4.3 Оценка частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями ядра в периферической крови плотвы 86
Заключение 102
Выводы 112
Список литературы 113
- Особенности накопления радионуклидов в тканях рыб
- Характеристика исследуемых водоемов
- Содержание радионуклидов в воде и донных отложениях исследуемых водоемов
- Размерные показатели плотвы из исследуемых водоемов
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время в области регулирования безопасности атомной промышленности во всем мире остаются нерешенными или недостаточно проработанными следующие проблемы: проблема обращения с радиоактивными отходами; проблема ядерного наследия; проблема защиты биоты в зоне произошедшего ранее либо текущего радиоактивного загрязнения окружающей среды. Как показывает опыт радиационных инцидентов, произошедших на ПО «Маяк», Чернобыльской АЭС, аварии на атомных станциях в Японии и др., вопрос радиоактивного загрязнения следует рассматривать не только в свете воздействия на здоровье населения, но и в свете реакции объектов окружающей среды, в том числе и гидробиоценозов. Верхним звеном водных экосистем и наиболее чувствительным к действию широкого спектра токсикантов, а значит и самым показательным звеном в биологическом мониторинге являются рыбы [Van D. Oost et al, 2003]. Здесь отдельного внимания заслуживает проблема влияния радиационного воздействия на генетический гомеостаз у рыб, на эффективность репарации ядерной ДНК, на адаптационные возможности клеток, а также проблема реализации повреждений молекулы ДНК на клеточном, тканевом, организменном и популяционном уровнях. Существует ряд работ, описывающих генотоксическое действие на рыб техногенного загрязнения водоемов: было отмечено влияние тяжелых металлов [Ramsdorf W. et al.,2009; Van Dyk J.C. et al.,2007; Matsumoto S.T. et al.,2004] и продуктов нефтегазовой индустрии [Abessa D.M.S. et al.,2008]. Что касается исследований, посвященных действию ионизирующей радиации, то в качестве эффектов были выделены: нарушения репродуктивной системы [Белова Н.В. и др.2009; Рябов И.Н.,1992]; изменения сердца, гемодинамики [Аршаница Н.М. и др.,2007]; механизмов ионного гомеостаза [Котелецев С.В. и др.,1999]; процессов кроветворения и иммунологической реактивности [Шлейфер Г.С. и др.,1980]; изменение размерных показателей и пластических признаков [Пешков С.П. и др.,1978; Абросимов Л.М.,1978]; сроков нереста и популяционных характеристик [Гончаренко Н.И. и др.,2004].
Вопрос о генотоксическом действии ионизирующего излучения на рыб менее изучен. В частности, при исследовании рыб из технологических водоемов ПО «Маяк» было отмечено увеличение частоты эритроцитов с микроядрами и высокая частота хромосомных аберраций в клетках крови [Smagin A.I.,2005; Коломиец И.А. и др.,2010]. Изучение популяций рыб, обитающих в загрязненных в результате аварии на ЧАЭС водоемах, показало повышение уровня хромосомного мутагенеза, частоты микроядер и повышение частоты морфологических аномалий эритроцитов периферической крови [Гудков Д.И. и др.,2005; Помернцева Н.А. и др.,2012; Anbumani S. et al.,2012]. Однако авторы другой работы не отмечали изменений в выходе клеток с хромосомными перестройками у рыб, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации
4 [Печкуренков В.Л.,1991]. Таким образом, в обзоре литературы имеется недостаточно данных, чтобы корректно определить закономерности генотоксического действия радиационного фактора на рыб из естественных популяций. А работ, посвященных оценке репарации ядерной ДНК клеток рыб, длительное время обитающих в водоемах с разным уровнем радиоактивного загрязнения в доступной литературе не обнаружено.
В Челябинской области существуют уникальные водные экосистемы заселенные сообществами организмов, прошедших множество жизненных циклов в условиях аномальной радиационной и химической нагрузки, – это технологические водоемы ПО «Маяк», эксплуатируемые с 50-х годов ХХ в.. В проведенных ранее исследованиях по содержанию радионуклидов в различных видах рыб, обитающих в данных водоемах [Коломиец И.А. и др.,2010], было показано, что наибольшую поглощенную дозу имеет плотва. Поэтому оценка благополучия популяции плотвы может стать индикатором состояния всей ихтиофауны водоемов и состояния биоценоза в целом.
Цель работы: Оценить генотоксические эффекты в клетках периферической крови плотвы из промышленных водоемов ПО «Маяк» с разным уровнем радиоактивного загрязнения.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ физиологического состояния по морфологическим показателям плотвы из водоемов В-11, В-10, В-4 Теченского каскада и водоемов сравнения – Шершневского водохранилища и Буферного водоема.
-
Определить уровень повреждений и репарации ядерной ДНК у плотвы из исследуемых водоемов с помощью метода ДНК-комет.
-
Оценить частоту эритроцитов с микроядрами в периферической крови плотвы исследуемых водоемов.
-
Оценить частоту эритроцитов с морфологическими аномалиями в периферической крови плотвы исследуемых водоемов.
-
Оценить зависимость проявления генотоксических эффектов у плотвы из исследуемых водоемов от уровня радиационного воздействия.
Научная новизна работы
-
Впервые с помощью методов ДНК-комет, микроядерного теста и оценки морфологических аномалий клеточного ядра проведен анализ уровня повреждения ядерной ДНК клеток периферической крови природных популяций плотвы, в течение ряда поколений, обитающей в водоемах с разным уровнем радиоактивного загрязнения.
-
Определена зависимость частоты эритроцитов периферической крови с морфологическими аномалиями ядра у плотвы от мощности дозы радиационного воздействия.
Теоретическая и практическая значимость работы
В работе получены новые теоретические знания о радиобиологических закономерностях повреждения и репарации ядерной ДНК соматических клеток рыб при хроническом радиационном воздействии. Генотоксическое действие ионизирующего излучения на плотву проявляется в повышении частоты эритроцитов с микроядрами, а также в повышении частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями ядра в периферической крови. Полученные знания вносят вклад в развитие теоретических представлений о реакции клеток рыб на радиационное воздействие.
Полученные данные могут быть использованы для целей нормирования
допустимого радиационного воздействия на гидробиоценозы. Результаты исследования
внедрены в систему производственного экологического мониторинга специальных
промышленных водоемов ПО «Маяк»; используются в учебном процессе на курсах
«экотоксикология», «гидробиология» на кафедре биоэкологии Челябинского
государственного университета, на курсе «радиоэкология» кафедры радиобиологии Челябинского государственного университета, на курсе «экология» кафедры анатомии, физиологии человека и животных Челябинского государственного педагогического университета. Материалы данной работы были использованы при разработке методических рекомендаций «Оценка генотоксических свойств природных вод методом ДНК-комет с использованием клеток крови рыб» (2012).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Радиационное воздействие на рыб, длительное время обитающих в радиоактивно-загрязненных водоемах приводит к повышению уровня повреждения ядерной ДНК клеток периферической крови плотвы.
-
Радиационное воздействие на рыб, длительное время обитающих в радиоактивно-загрязненных водоемах приводит к повышению интенсивности репарации ядерной ДНК клеток периферической крови плотвы.
-
Метод определения частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями ядра является хорошим инструментом для оценки генотоксического действия среды на рыб и может быть использован в биологическом мониторинге радиоактивно-загрязненных водных экосистем.
Апробация материалов работы. Материалы диссертации были представлены на III Всероссийской научно-практической конференции «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования» (Нижний Тагил, 2010); V Международной научно-практической конференции «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения» (Северск-Томск, 2010); Международной конференции EPRBioDose 2010 (Италия, Неаполь, 2010); VI Съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010); IV Международной конференции «Хроническое радиационное воздействие:
6
эффекты малых доз» (Челябинск, 2010); III Международной научно-практической
конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным
факторам среды» (Челябинск, 2010); IV Всероссийской конференции по водной
экотоксикологии «Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы» (Борок,
2011); V Международной научно-практической конференции «Адаптация
биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2012); Ежегодной конференции Health Physics Society 2013 (США, Висконсин, 2013).
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 5 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, в т.ч. обзора литературы, главы, описывающей материалы и методы исследований, двух глав, посвященных результатам собственных исследований; заключения, включающего обсуждение полученных результатов; списка литературы, содержащего 246 источника; изложена на 140 страницах машинописного текста и включает 17 таблиц, 25 рисунка.
Особенности накопления радионуклидов в тканях рыб
Вопросы миграции радионуклидов по пищевым цепям и способы их поступления в организм гидробионтов отражены в большом количестве работ [Нилов В.И. и др., 1978; Марчюленене Д.П. и др., 1979; Нилов В.И., 1980; Нилов В.И., 1983; Паньков И.В. и др., 1993; Мешалкина Н.Г., 2005]. Рыбы являются той группой обитателей водоемов, которой в радиоэкологических исследованиях уделяется повышенное внимание [Куликов Н.В. и др., 1975; Радиоактивные изотопы, 1981; Радиоэкологические исследования, 1988; Поликарпов Г.Г. и др., 1995], что, безусловно, связано с ролью рыбы в жизни человека как продукте питания и объекте спортивной рыбной ловли.
Для взрослых особей рыб критерием, определяющим поступление радионуклидов в организм, является характер питания и образ жизни. Так, наиболее критической группой признаются придонные виды рыб, а среди них наибольшее содержание радионуклидов отмечается в хищниках [Рябов И.Н., 1992; Рябов И.Н., 2004; Полякова Н.И., 2001; Полякова Н.И., 2002; Sundbom M. et al, 2003; Uzunova E. et al, 2000; Saxen R. et al, 2002]. В исследовании по определению накопления 137Cs рыбами в водоеме-охладителе ЧАЭС было показано, что относительно небольшие и более стабильные коэффициенты накопления данного радионуклида присущи видам бентофагам, а также части фитофагов и планктофагов. Для рыб-ихтиофагов коэффициенты накопления 137Cs в несколько раз выше и характеризуются значительной нестабильностью, что, вероятно, объясняется характером типа питания, строением и особенностями функционирования их пищеварительной системы. Для рыб-полифагов обнаружены видовые особенности динамики коэффициентов накопления 137Cs. Так, у сома обыкновенного (S. Glanis L.) с 1987 г по 2002 г. коэффициент накопления 137Сs в мышцах повысился с 1140 до 6500, в то время как у схожего с ним по анатомическим признакам и типу питания канального сома (I. Punctatus) в этот период он оставался на относительно стабильном уровне [Зарубин О.Л, 2004; Зарубин О.Л. и др., 2009].
Формирование дозовой нагрузки в первую очередь зависит от видовой принадлежности рыбы. Так, в исследовании [Рябов И.Н., 2002] при оценке содержания 137Cs у промысловых рыб р. Тобол и р. Иртыш было показано, что наиболее низкие показатели содержания 137Cs среди исследованных видов рыб были отмечены у наиболее ценной осетровой рыбы – сибирской стерляди (Acipenser ruthenus L.). Причиной этого является большое содержание жира в мышцах стерляди по сравнению с представителями костистых рыб. Известно, что в жире меньше накапливается 137Cs, чем в мышцах рыб.
Ильин Д.И. и Москалев Ю.И. [Ильин Д.И. и др., 1961] изучали распределение 90Sr, 137Cs и 32Р в органах рыб – плотвы (Rutilus rutilus L.) и окуня (Perca fluviatilis L.), находившихся в течение 2 лет в экспериментальном водоеме, активность которого по 90Sr была 0,37 кБк/л, 137Cs – 0,27 кБк/л и 32Р – 0,09 кБк/л, и в ходе исследования оставалась на неизменном уровне. Результаты показали, что 90Sr избирательно откладывается в чешуе, плавниках, костях; 137Cs сравнительно равномерно распределяется по органам, наибольшие его концентрации обнаруживаются в жабрах, мышцах, селезенке, почках, кишечнике и сердце; 32Р обнаруживается в тканях примерно в одинаковых количествах. В исследовании [Каглян А.Н. и др., 2009], проведенного на рыбах из водоема зоны отчуждения ЧАЭС, было также показано, что основными органами и тканями, в которых аккумулируется 90Sr, являются чешуя, кости, плавники и голова. На эти органы и ткани, которые составляют не более 40% от всего веса тела рыб, приходится до 97% от общего содержания 90Sr в организме.
В исследовании Смагина А.И. была проведена оценка дозовых нагрузок от внешнего облучения и инкорпорированных радионуклидов для рыб в водоёме-охладителе реакторного производства ПО «Маяк» – озере Кызыл-Таш и в Водоеме В-10 – хранилище жидких радиоактивных отходов [Смагин А.И., 2006]. Удельная активность радионуклидов в биологических объектах водоемов и в воде была выше на три порядка по сравнению с водоёмами, расположенными на границе ВУРСа, при этом наибольшее значение для формирования дозовых нагрузок имеют инкорпорированные -излучающие радионуклиды. В ряду убывания доз источники излучения располагаются следующим образом: инкорпорированные -излучатели внешние -излучатели инкорпорированные -излучатели или внешние – излучатели. Основным дозообразующим радионуклидом является 90Y – дочерний продукт 90Sr, находящийся с ним в равновесии. Поскольку 90Sr является аналогом кальция, наибольший уровень дозового воздействия приходится на кости и участки внутренних органов, расположенные близко к костям, в первую очередь, органы, принимающие участие в кроветворении [Смагин А.И., 2006].
Характеристика исследуемых водоемов
Накоплен достаточно большой фактический материал о влиянии ионизирующего излучения на ихтиофауну. Отмечается, что у рыб реки Тетерев и Киевского водохранилища через 20 лет после аварии на ЧАЭС присутствует широкий спектр морфофункциональных нарушений репродуктивной системы, особенно выраженный у щуки (Esox lucius) и золотого карася (Carassius carassius). Среди них наиболее значительными оказались массовая деструкция фолликулярных и половых клеток разных стадий развития, асимметрия и аномальное развитие гонад, гермафродитизм и стерилизация [Белова Н.В. и др., 2009]. При обследовании воспроизводительной системы рыб Киевского водохранилища [Полякова Н.И., 2008] у большинства самок щуки (Esox lucius) были также выявлены следующие типы нарушений строения половых желез: асимметрия гонад, тотальная резорбция икры и оводнение гонад. Среди других видов рыб было отмечено изменения в половой структуре нерестовой части популяции: наблюдалось снижение доли самцов. С другой стороны, изучение популяции белого толстолобика (Hypophthalmichthys molitrix) водоема-охладителя ЧАЭС в период до аварии показало отсутствие снижения воспроизводительной способности половозрелых особей при хроническом облучении рыб в течение трех лет в общей дозе 8-9 Гр [Рябов И.Н., 1992].
Проведенные исследования ихтиофауны из водоемов-охладителей Калининской АЭС показали, что у рыб всех водоемов наблюдались однотипные патологические изменения, характерные для хронического токсикоза. Наиболее типичными проявлениями токсикоза были нарушения гемодинамики, повышенная гиперемия, отеки, кровоизлияния. Также отмечены дегенеративные изменения в сердце, печени и почке [Аршаница Н.М. и др., 2007]. При исследовании карпа (Cyprinus carpio) и белого толстолобика [Котелецев С.В. и др., 1999] из водоема-охладителя Чернобыльской АЭС было продемонстрировано, что в эритроцитах рыб имеются нарушения ионного гомеостаза и механизмов его гормональной регуляции. Такие же изменения отмечены и у карпа и леща из загрязненных районов Рыбинского водохранилища.
Действие ионизирующей радиации на систему крови и иммунитет у рыб в экспериментальных условиях изучали Шлейфер Г.С. и Шеханова И.А. [Шлейфер Г.С. и др., 1980]. Исследования проводили на примере карпа обыкновенного. Были отмечены изменения в соотношении отдельных клеток белой крови и общего количества лейкоцитов у рыб, обитавших в растворах с концентрацией 90Sr 1,85 кБк/л и 37 кБк/л в течение 180 и 270 суток. Фагоцитарная активность лейкоцитов оказалась наиболее чувствительной к действию облучения. Было показано, что при хроническом облучении с низкой мощностью дозы изменения процессов кроветворения у рыб и иммунологической реактивности носят фазовый характер и зависят от мощности дозы и суммарной поглощённой дозы.
В работе [Соломатина В.Д. и др., 2000] установлено, что хроническое радиационное воздействие на рыб снижает интенсивность энергетических процессов в организме, о чем свидетельствуют данные о содержании липидов, гликогена, макроэргических фосфорных соединений. В печени этих рыб на повышенном уровне происходят процессы распада и синтеза белковых соединений. Однако если в абсолютных величинах содержания основных пластических веществ и адениновых нуклеотидов отмечены определенные отклонения от исходных показателей, то энергетический заряд аденилатной системы и отношение РНК/ДНК остаются стабильными, что указывает на наличие компенсаторных механизмов, которые обеспечивают поддержание гомеостаза рыб в условиях радиоактивного воздействия. К таким механизмам следует отнести в первую очередь усиление гликолитических процессов в печени и использование в энергетических целях белков, о чем свидетельствуют данные о содержании гликогена, лактата и аммиака в печени [Соломатина В.Д. и др., 2000]. Кроме того было зарегистрировано статистически достоверное увеличение интенсивности дыхания, интенсивности малатдегидрогеназы, содержания общего белка и альбуминов при воздействии 0,075 и 0,12 мГр/год. [Жукинский В.Н. и др., 1993].
Изменение физиологических процессов, происходящих в организме рыб, подвергшихся радиационному воздействию, влекут за собой изменение восприимчивости особей к инфекционным и неинфекционным заболеваниям. В 1988 г. через год после аварии на Чернобыльской АЭС была доказана зависимость от мощности дозы хронического облучения рыб частоты возникновения двух заболеваний молоди карпа: ботриоцефалеза (возбудитель – цестода (Bothriocephalus acheilognathi)) и воспаления плавательного пузыря, что может, вероятно, указывать на их радиационную обусловленность [Слуквин А.М. и др., 2001]. Однако в том же исследовании не было установлено корреляционной зависимости частот возникновения восьми других изучаемых заболеваний от мощности поглощенной дозы облучения молоди карпа [Слуквин А.М. и др., 2001].
Содержание радионуклидов в воде и донных отложениях исследуемых водоемов
Сбор ихтиологического материала производился в летний период 2009 г. Отбор рыбы на исследованных водоемах (водоемы В-4, В-10, В-11 ТКВ, Буферный водоем, Шершневское водохранилище) осуществляли с использованием ставных сетей с размером ячеи 30 мм, 40 мм и 50 мм. Рыбу взвешивали на весах с точностью до 2 г. Для определения возраста особи отбирали чешую с середины туловища на 2-3 ряда выше боковой линии. Полученный материал приклеивали к блокнотному листу бумаги (чешуйная книжка), на котором записывали системный номер рыбы, вид, водоем и дату отбора проб. Далее рыбу фотографировали, после этого из хвостовой вены у 10 особей плотвы из каждого улова на исследуемых водоемах отбирали кровь для оценки уровня повреждения и репарации ядерной ДНК с помощью метода ДНК комет. Для этого 50 мкл крови помещали в эппендорфовские пробирки с гепарином.
У всех живых особей плотвы из улова отбирали кровь из хвостовой вены и готовили мазки для определения частоты эритроцитов с микроядрами и определения частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями.
Определение морфометрических показателей плотвы Для определения морфометрических показателей анализировали результаты взвешивания плотвы. Длину тела рыб определяли на основе анализа изображений (фотографий) с помощью программного пакета TpsDig2 с точностью до 1 мм (рисунок 7) [Правдин П.Ф., 1966].
Рассчитывали следующие морфометрические показатели плотвы: масса, длина тела и возраст. Для определения степени упитанности рыб определяли функцию зависимости массы тела особей от длины тела для всех уловов. При построении графиков использовали пакет Prism
Массу тела и длину тела рыб определяли для всех особей плотвы из уловов, произведенных в июле – августе 2009-2010 гг. При этом выборка из Шершневского водохранилища составила 117 особей; из Буферного водоема – 12 особей, из водоема В-11 – 75 особей, из водоема В-10 – 164 особей и из водоема В-4 – 185 рыб. Рисунок 7. – Схема измерения тела рыбы: точка а – вершина рыла, точка d – основания средних лучей хвостового плавника; аd – длина тела особи
Рисунок 8. – Чешуя плотвы (Rutilus rutilus L.), возраст 5+ Возраст рыбы определяли по чешуе. Из чешуйной книжки извлекали соответствующий материал и отмывали в слабом растворе нашатырного спирта. С помощью стереоскопического микроскопа МБС-9 подсчитывали «годовые кольца». Принцип определения возраста рыбы основан на том, что рыба растет в течение всей жизни, однако в течение года рост ее неравномерен, что сказывается на росте всех костных частей тела, в частности на чешуе и жаберных крышках, на которых и образуются так называемые «годовые кольца» [Правдин П.Ф., 1966; Чугунова Н.И., 1959; Klemm D.J. et al, 1993].
При обозначении возраста рыбы цифра показывает число прожитых ею лет, а знак «+» – прирост нового года. Рыбная молодь, родившаяся в текущем году, называется сеголетками (0) (все склериты равномерно расположены от центра к краю чешуи), весной следующего года – годовиками (1) (на краю чешуи склериты сужаются, и образуется зона суженых склеритов), осенью – двухлетками (1+) (после зоны суженных склеритов наблюдаются на краю чешуи 2-3 и более широких склерита), следующей весной – двухгодовиками (2) и т.д. [Правдин П.Ф., 1966; Чугунова Н.И., 1959; Klemm D.J. et al, 1993].
Возрастную структуру уловов плотвы из исследованных водоемов оценивали по данным 2009 г. При этом выборка из Шершневского водохранилища составила 117 особей; из Буферного водоема – 12 особей, из водоема В-11 – 75 особей, из водоема В-10 – 134 особей и из водоема В-4 – 115 рыб.
Для корректного использования в анализе морфометрических параметров рыб следует определить кормовую базу данного вида рыб, рассчитанную для каждого из исследуемых водоемов. Согласно рекомендациям [Биологическая продуктивность, 1969] значения кормовой базы для рыб складывается из значений биомассы организмов, используемых данным видом в пищу.
Поскольку плотва в разные этапы онтогенеза кормится преимущественно зоопланктонными и зообентосными организмами [Сабанеев Л.П., 2008], для оценки кормовой базы были использованы эти два компонента гидробиоценоза. Показатели кормовой базы для исследуемых водоемов определяли на основе показателей численности и биомассы зоопланктона и зообентоса [Пряхин Е.А. и др., 2011]. Учитывали в качестве доступного корма биомассу крупных зоопланктонных организмов: ветвистоусых рачков (Cladocera) и веслоногих рачков (Capepoda), биомассу зообентосных организмов: личинок комаров-хирономид (Chironomidae), малощетинковых червей (Oligochaeta), и 30% биомассы моллюсков (Gastropoda, Bivalvia) на 1 м2. Оценку численности и биомассы зоопланктона и зообентоса осуществляли специалисты экспериментального отдела УНПЦРМ.
Определение уровня повреждения и репарации ДНК клеток периферической крови плотвы с помощью метода ДНК-комет Метод ДНК-комет является быстрым и чувствительным методом регистрации повреждений ДНК на уровне одиночных клеток, в настоящее время широко используется в исследованиях по оценке генотоксичности агентов разнообразной природы и стал неотъемлемой частью программ биологического мониторинга. Принцип метода заключается в том, что в постоянном электрическом поле фрагменты поврежденной ДНК одиночных лизированных клеток вытягиваются по направлению к аноду, формируя след, имеющий вид кометы. Количество ДНК, мигрировавшее к аноду, т.е. сформировавшее «хвост кометы», используется в качестве параметра характеризующего степень поврежденности ДНК [Сорочинская У.Б. и др., 2008].
Размерные показатели плотвы из исследуемых водоемов
При проведении регрессионного анализа было показано, что зависимость возникновения всех рассмотренных морфологических аномалий эритроцитов от мощности дозы облучения в равной степени описывается как линейной
На рисунке 24 А и Б представлены линейная и логарифмическая зависимости частоты возникновения эритроцитов со всеми выявленными морфологическими аномалиями ядра в периферической крови плотвы от мощности дозы. Рисунок 24А. –Линейная зависимость частоты эритроцитов со всеми морфологическими аномалиями ядра в периферической крови плотвы Логарифмическая зависимость частоты эритроцитов со всеми морфологическими аномалиями ядра в периферической крови плотвы от мощности дозы Для суммарной частоты эритроцитов со всеми морфологическими аномалиями ядра в нашем исследовании был проведен многофакторный анализ признаков сопряженности с использованием обобщенной линейной модели. В качестве признаков мы принимали радиационный фактор, химические показатели воды исследуемых водоемов, а также морфометрические параметры рыб. Анализ показал, что на изменение суммарной частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями ядра наибольшее влияние оказывает радиационный фактор (мощность дозы) (статистика Вальда = 51; р 0,001) и в меньшей степени химический фактор (концентрация сульфатов в воде водоема) (статистика Вальда = 9; р = 0,003). Полученная модель (2 = 41; р 0,001) имеет следующий вид: СЧЭАЯ = 39 + 4 P + 0,1 S (13) Где: CЧЭАЯ – суммарная частота эритроцитов с аномалиями ядра, ; Р – мощность дозы, мГр/сут.; S – концентрация сульфатов в воде водоема, мг/л.
Таким образом, проведенный анализ показал, что в периферической крови у плотвы из водоемов В-11, В-10 и В-4 ТКВ наблюдается повышение частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями, и, согласно показателю критерия Вальда, определяющим фактором в этом играет мощность дозы облучения.
В нашем исследовании был проведен анализ соотношения между собой различных выявленных морфологических аномалий эритроцитов периферической крови плотвы, а также частоты эритроцитов с микроядрами. В таблице 17 представлены коэффициенты корреляции Пирсона для исследованных аномалий.
Корреляционный анализ показал положительные связи некоторых морфологических аномалий. Так амитоз положительно коррелирует с инвагинацией ядра ( = 0,36; р 0,001). Известно, что в процессе амитоза клетки происходит неравноценное деление ядра и цитоплазмы, которые морфологически проявляются в виде гантелеобразной формы ядра и инвагинаций цитоплазмы [Житенева Л.Д. и др., 1989; Иванова Н.Т., 1983]. В нашем исследовании мы определяли амитоз по наличию обоих этих признаков одновременно. Возможно, что обнаруженная положительная корреляция указывает на единство патологии, а инвагинация ядра – это проявление процесса, конечным этапом которого является аномальное деление клетки. Отмечаются корреляционные связи между пойкилоцитозом с пикнозом ( = 0,58; р 0,001), смещением ядра ( = 0,60; р 0,001) и инвагинацией ядра ( = 0,38; р 0,001). Слабая связь ( = 0,24; р = 0,02) прослеживается между такими морфологическими аномалиями как пикноз и смещение ядра. Смещение ядра коррелирует с инвагинацией ядра ( = 0,37;
Примечание: - значимая корреляция, р 0,05 Обращает на себя внимание положительная корреляция частоты блеббинга ядра с каждой из исследуемых морфологических аномалий эритроцитов периферической крови. Коэффициенты корреляции Пирсона при этом имеют значение от 0,22 – корреляция частоты блеббинга с пуфовидными выпячиваниями и смещением ядра – до 0,57 – с пойкилоцитозом. Корреляционных связей между частотами морфологических аномалий эритроцитов и частотой эритроцитов с микроядрами не обнаружено.
Одной из идей нашего исследования было выявить оптимальный инструмент для оценки генотоксического эффекта на ихтиофауну в радиоактивно-загрязненных водных экосистемах. Для этого был проведен регрессионный анализ зависимости частоты эритроцитов с микроядрами и частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями ядра от мощности дозы в диапазоне от 0,8 до 19,3 мГр/сут. Анализ показал, что в данном диапазоне доз, который соответствует уровням радиационного воздействия на рыб в водоемах В-11, В-10, В-4 Теченского каскада, отсутствует линейная дозовая зависимость частоты эритроцитов с микроядрами (F = 0,13; R2 = 0,001; р = 0,72); тогда как зависимость частоты эритроцитов с морфологическими аномалиями ядра описывается линейной функцией (F = 11; R2 = 0,16; р = 0,002). Уравнение функции при этом имеет вид: СЧЭАЯ=72+2,6 Р (14) Где: СЧЭАЯ – суммарная частота эритроцитов с аномалиями ядра, ; Р – мощность дозы, мГр/сут.
Как было показано выше, среди всех морфологических аномалий эритроцитов наиболее статистически значимые линейные модели в диапазоне мощности радиационного воздействия от 0,00009 мГр/сут. до 19,3 мГр/сут. характерны для двух морфологических аномалий ядра: пикноз ядра (F = 24; R2 = 0,21; р 0,001) и блеббинг ядра (F = 21; R2 = 0,19; р 0,001). Для суммарной частоты эритроцитов с этими двумя аномалиями был построен график функции зависимости от мощности дозы. На рисунке 25 представлена линейная зависимость частоты возникновения эритроцитов с пикнозом + блеббингом ядра в периферической крови плотвы от мощности дозы облучения. Уравнение функции линейной зависимости имеет вид (F = 38; R2 = 0,30; р 0,001): с пикнозом + блеббингом ядра в периферической крови плотвы от мощности дозы.
Как и для частоты эритроцитов с микроядрами была построена линейная зависимость частоты эритроцитов с пикнозом + блеббингом ядра от мощности дозы воздействия в диапазоне 0,8-19,3 мГр/сут. Регрессионный анализ показал, что суммарная частота данных морфологических аномалий ядра описывается линейной функцией (F = 11; R2 = 0,16; р = 0,002), которая является в той же степени статистически значимой, что и зависимость суммарной частоты всех морфологических аномалий ядра в этом диапазоне радиационного воздействия.
Похожие диссертации на Генотоксическте эффекты в клетках крови плотвы (Rutilus Rutilus L.) из водоемов с разным уровнем радиоактивного загрязнения
