Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Действие ионизирующих излучений на генетический аппарат клетки 12
1.1.1. Краткая характеристика ионизирующих излучений 12
1.1.2. Образование свободнорадикальных молекул в биологических системах и их генотоксическое действие 13
1.1.3. Кинетика химической модификации ДНК при радиационном воздействии 15
1.1.4. Характеристика первичных повреждений ДНК, индуцируемых радиацией и радиомиметиками 16
1.1.5. Повреждения азотистых оснований ДНК 17
1.1.6. Возникновение одно - и двунитевых разрывов сахарофосфатного остова ДНК 17
1.1.7. Сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок 20
1.2. Краткая характеристика антиокислительных механизмов защиты облученной клетки 21
1.3. Репарация повреждений ДНК как общебиологический механизм защиты генома 22
1.3.1. Защита генетического аппарата клетки от повреждений репаративными системами 22
1.3.2. Эксцизионная репарация ДНК как показатель способности клетки к восстановлению индуцированных повреждений 25
1.4. Особенности репаративного синтеза ДНК в клеточных системах 29
1.4.1. Общие принципы оценки генетического риска по эффективности внепланового синтеза ДНК 29
1.4.2. Индукция ВС ДНК ультрафиолетовым облучением 31
1.4.3. ВС ДНК как показатель индивидуальной чувствительности к различным мутагенным факторам окружающей среды 32
1.4.4. Стимуляция эффективности репаративного синтеза ДНК природными антиоксидантами 33
1.5.Рольэксцизионной репарации в формировании адаптивной реакции 35
1.6. Эффективность репаративного синтеза ДНК в клетках крови лиц, подвергшихся внешнему и внутреннему облучению 36
1.7. Репарация ДНК и цитогенетические эффекты при действии ионизирующей радиации 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Формирование групп обследования 44
2.2. Сбор образцов крови и цитогенетический анализ препаратов 50
2.2.1. Получение препаратов метафазных хромосом лимфоцитов 50
2.2.2. Анализ нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови (классический цитогенетический метод) 52
2.3. Определение эффективности репаративного синтеза ДНК в клетках периферической крови профессионалов и в контрольной когорте 53
2.4. Статистическая обработка результатов 55
Результаты и обсуждение 57
Глава 3. Анализ эффективности внепланового синтеза ДНК в клетках профессионалов-атомщиков и в контрольной группе 57
3.1. Оценка средней эффективности внепланового синтеза ДНК в клетках крови профессионалов и в контроле 57
3.2. Зависимость индекса ВС ДНК от возраста доноров 59
3.3. Дозовая зависимость индукции репаративного синтеза ДНК 60
3.4. Анализ зависимости эффективности внепланового синтеза ДНК от курения 65
3.5. Анализ зависимости эффективности внепланового синтеза ДНК от приема витаминов 66
Глава 4. Анализ цитогенетических нарушений в группе профессионалов-атомщиков и в контрольной когорте 70
4.1. Цитогенетический анализ лиц контрольной когорты 70
4.2. Цитогенетическое обследование профессионалов-атомщиков 73
4.3. Зависимость цитогенетических показателей в исследуемых когортах от курения и витаминотерапии 79
4.3.1. Анализ цитогенетических показателей в контрольной группе 79
4.3.2. Анализ цитогенетических показателей в группе профессионалов 81
Глава 5. Сравнительный анализ индекса репарации ДНК и цитогенетических показателей 82
5.1. Эффективность внепланового синтеза ДНК и цитогенетические нарушения в клетках крови контрольной когорты 82
5.2. Эффективность внепланового синтеза ДНК и цитогенетические нарушения в клетках крови профессионалов 84
Заключение 92
Выводы 96
Приложение 98
Список цитированной литературы 100
- Краткая характеристика антиокислительных механизмов защиты облученной клетки
- Сбор образцов крови и цитогенетический анализ препаратов
- Зависимость индекса ВС ДНК от возраста доноров
- Цитогенетическое обследование профессионалов-атомщиков
Краткая характеристика антиокислительных механизмов защиты облученной клетки
На разных этапах развития лучевого поражения - начиная от момента облучения до конечной стадии процесса - в облученной клетке подключаются разнообразные средства внутриклеточной антиоксидантной защиты. Удаление избыточного количества АФК в клетке происходит при ферментном контроле: участии «ловушек АФК» - цитохрома С, супероксиддисмутазы, каталазы, системы пероксидаз, а также митохондриальной цитохромоксидазы.
При усилении цепных процессов окисления в облученной клетке запускаются антиокислительные процессы, сдерживающие образование избытка оксирадиотоксинов (Кудряшов, 2004). Наиболее важный из этих процессов-активация защитной системой клетки большого количества низкомолекулярных веществ - т.н. «антиокислительного буфера», способных перехватывать или инактивировать АФК, а также восстанавливать продукты перекисного окисления липидов. Перечень наиболее активных из них, способных существенно снижать уровень и токсическое действие оксирадиотоксинов в водной и липидной фазах клетки, приведен в таблице 3.
Репарация ДНК - это процесс поддержания стабильности молекулы ДНК путем удаления ошибок в последовательности оснований, возникающих в результате воздействия различных мутагенных факторов (ионизирующее. УФ-излучение, электромагнитное излучение, химические агенты), либо во время репликации. Стабильность молекулы ДНК в ряду поколений абсолютно необходима для поддержания вида и сохранения генетической информации. В противном случае ошибки, накапливающиеся в быстро делящихся клетках в геометрической прогрессии, угрожали бы сохранению вида, а жизнедеятельность покоящихся без деления в течение нескольких лет клеток (например, клеток мозга или печени) была бы невозможна.
За одну минуту в клетке прокариот образуется около 130 повреждений ДНК, подавляющее количество которых - однонитевые разрывы ДНК - репариругатся в течение нескольких минут. Доказано, что клеткам эукариот присуща такая же скорость накопления ошибок, и они также имеют механизм репарации ошибок в кодирующей системе генов (Жимулев, 2002). Доказана и гетерогенность репарации радиоиндуцированных ОР ДНК: наибольшая скорость элиминации ОР наблюдается в транскрибируемой области ДНК, наименьшая - в наименее «активной» сателлитной, промежуточная скорость репарации наблюдается в тотальной ДНК (Жестяников и Игушева, 1997).
Главным проявлением геномной нестабильности считают фиксирование в потомстве клеток повреждений в первичной структуре ДНК, не устраненных системами репарации (Мазурик и Михайлов, 2001). Структурные изменения в ответственных за репарацию генах служат основой патологических процессов при таких наследственных заболеваниях, как пигментная ксеродерма, атаксия-телеангиоэктазия, синдром Блюма, анемия Фанкони и др., для которых характерен аномальный ответ на повреждение ДНК; нарушение контроля программируемой клеточной гибели (апоптоза); повышенная вероятность опухолевой трансформации клеток (Hemminki etal, 1994, Cline & Hanavalt, 2003). При этом многие репарационно-дефектные наследственные болезни характеризуются повышенным риском онкозаболеваний (Jeggo et.al., 1998, Sancar, 1996). На сегодняшний день известно более 70 ответственных за процесс репарации генов. В таблице 4 приведены примеры генов, ответственных за различные системы репарации, нарушение функции которых приводит к возникновению различных онкозаболеваний (приводится по Chen, 2000).
Таким образом, изменения в репарационном статусе организма могут служить критерием при выявлении групп повышенного риска по онкологическим заболеваниям (UNSCEAR, 1995). Снижение репарационной активности клеток крови выявлено при различных формах рака кишечника, кожи, легких и др. (Pero et al, 1983). Недавние исследования ВОЗ выявили положительную корреляцию между риском онкозаболеваний и спонтанной частотой хромосомных аберраций в лимфоцитах человека (Hagmar et al, 1998).
Сбор образцов крови и цитогенетический анализ препаратов
Забор крови для цитогенетического анализа осуществляли из локтевой вены в стерильные моноветы с гепарином (конечная концентрация гепарина составила 16 Ед/мл крови). Забор крови для определения эффективности внепланового синтеза ДНК проводили в стерильные моноветы с К2 - ЭДТА в конечной концентрации 2 мг/мл крови. 2.2.1. Получение препаратов метафазных хромосом лимфоцитов Цитогенетический анализ лимфоцитов периферической крови включал следующие этапы: - получение препаратов метафазных хромосом лимфоцитов; - анализ нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови (классический цитогенетический метод). Для получения препаратов метафазных хромосом применяли стандартную методику культивирования клеток крови, подробно описанную в методических рекомендациях по анализу цитогенетических нарушений в целях биологической дозиметрии (Снигирева с соавт., 2003). 1. В пластиковые одноразовые флаконы с 4,5 мл культуральной среды (80% питательной среды RPMI-1640 (Gibco, Великобритания), 20% эмбриональной телячьей сыворотки (РАА Laboratories, Австрия), ЮОМЕ/мл пенициллина и 0,1 мкг/мл стрептомицина) вносили 0,5 мл гепаринизированной (16Ед/мл) крови, добавляли 2-2,5% фитогеммаглютинина (Gibco, Великобритания) и 5-бромо-2 -дезоксиуридин (ICN, США) в конечной концентрации 3-6 мкг/мл культуральной среды. 2. Культивирование клеток крови проводили в термостате при 37С в течение 48 -50 часов. 3. За 2,5 часа до окончания культивирования в культуру добавляли колхицин в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и тщательно перемешивали. 4. Культуры центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин для осаждения клеток. Проводили гипотоническую обработку клеточных суспензий 0,56%-ным раствором хлористого калия в течение 15 минут при 37С. При этом время гипотонизации входило в общее время культивирования лимфоцитов. 5. После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости клеточные суспензии 3-4 раза фиксировали в охлажденной до 0С смеси метанол : ледяная уксусная кислота (в соотношении 3:1). Первую фиксацию клеток выдерживали в фиксаторе в течение 15 -20 мин, затем клетки центрифугировали при 1500 об/мин. Последующие серии фиксаций проводили без выдержки в фиксаторе. В последней серии фиксатор становился прозрачным, без мутных взвесей. Полученные суспензии в фиксаторе переносили в микропробирки, маркировали и хранили при -20С. 6. Для анализа метафазных пластинок фиксированную клеточную суспензию наносили на холодные влажные предметные стекла и высушивали на термоплате при 42С. Стекла маркировали и оставляли в темноте при комнатной температуре для подготовки к последующему окрашиванию. Анализ нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови (классический цитогенетический метод) Препараты метафазных хромосом, предназначенные для анализа нестабильных хромосомных аберраций, перед окрашиванием выдерживали «для состаривапия» в течение 3-5 дней. Для окрашивания препаратов использовали метод «флюоресценция плюс краситель Гимза» (FPG - метод), позволяющий определить долю клеток, находящихся на стадии второго митотического деления (Moorhead et al, 1960, IAEA, 2001). 1. Предметные стекла помещали на 15 мин в раствор красителя Hoechst 33258 (Sigma, США) в PBS - фосфатном буфере (конечная концентрация красителя составила 0,25 мкг/мл, рН = 6,8) в защищенной от света кювете. 2. Сохраняя слой того же раствора, кювету со стеклами помещали на термоплату при 56С под бактерицидную ультрафиолетовую лампу (Х,=254 нм) на 30-40 мин. 3. После промывания в дистиллированной воде стекла окрашивали 5%-ным раствором красителя Гимза (ACROS Organics, Бельгия) в Weiss-фосфатном буфере (рН = 6,8) в течение 5-8 мин и высушивали на воздухе. 4. При классическом цитогенетическом анализе использовали световой микроскоп Hund 600 с объективом хЮО для масляной иммерсии. Для каждого обследованного пациента анализировали в среднем 1000 метафаз. В метафазах первого деления, содержащих 46 ± 1 хромосом, учитывали все типы хромосомных аберраций:
Зависимость индекса ВС ДНК от возраста доноров
Для более детального анализа ДНК-репарационной активности была изучена зависимость эффективности ВС ДНК от возраста доноров в контроле.
В контрольной когорте не выявлено достоверной корреляционной связи между возрастом донора и репарационной эффективностью клеточных систем, что можно объяснить относительной однородностью по возрасту лиц контрольной когорты сотрудников ВНИИЭФ (51-72 гг). Однако по нашему мнению, в когорте показана тенденция к снижению КУф с возрастом (г = -0,20; р = 0,18). Этот факт согласуется с данными литературы по исследованию ВС ДНК в группах здоровых доноров (Горин, 1989, Семов с соавт., 1997, Knudsen et al, 1992) и может быть объяснен как общим снижением ферментативной активности, так и меньшей активностью ферментов, ответственных за эксцизионную репарацию, у лиц пожилого возраста: ERCC3, PCNA, RPA, ХРА, р53 (Goukassian et al, 2000). Распределение величины индекса репарации КУФ в контрольной когорте сотрудников ВНИИЭФ в зависимости от возраста представлено на рисунке 9.
При обследовании профессионалов-атомщиков важно выяснить, существует ли корреляционная зависимость между уровнем репарационной способности клеток крови и величиной поглощенной дозы в отдаленные сроки после облучения. Следует отметить, что данные физической дозиметрии, используемые при всех последующих расчетах, были подтверждены при определении биологической дозы облучения для выборочной группы профессионалов - атомщиков основной когорты (использовали FISH-метод) (Snigiryova et al, 2002). Распределение эффективности индукции ВС ДНК в клетках крови профессионалов-атомщиков от величины суммарной поглощенной дозы представлено на рисунке 10.
При анализе дозовой зависимости Куф в целом на группу профессионалов не выявлена корреляционная связь между величиной индивидуальной поглощенной дозы и эффективностью УФ-индуцированного ВС ДНК (г = -0,116, р 0,05).
При делении на дозовые когорты (примерно по 15-20 человек в каждой) отрицательная корреляционная связь между величиной средней поглощенной дозы на когорту и величиной Куф отличалась большей достоверностью: г = -0,167, р 0,05 (см. рис. 11).
Показано, что величина Куф в клетках крови профессионалов в дозовой когорте с наименьшей поглощенной дозой (0-9 сЗв) несколько выше контрольных значений (различия недостоверны). С увеличением поглощенной дозы (по данным физической дозиметрии) эффективность УФ-индуцированного репаративного синтеза ДНК снижается и выходит на плато при поглощенных дозах более 20 сЗв.
В литературе имеется очень мало данных по исследованию дозовой зависимости ВС ДНК от стажа и интенсивности работы во вредных условиях труда. Описано снижение индекса УФ-индуцированного ВС ДНК с предполагаемой дозой облучения у жителей районов Алтайского края. подвергшихся радиоактивному загрязнению со стороны Семипалатинского полигона, причем они касаются случаев хронического внешнего и внутреннего облучения (Шевченко с соавт., 1994).
При этом эффективность ВС ДНК была максимально снижена либо отсутствовала у лиц, проживающих в наиболее радиационно-загрязненных районах, расположенных географически ближе к полигону. Однако в исследовании была также отмечена закономерность: индекс репарации снижался лишь до определенного предела, т.е. также существовал выход на плато.
Противоречивая картина наблюдается при анализе ВС ДНК в клетках крови лиц, занятых в химически вредных производствах. Снижение индекса репарации зарегистрировано у занятых на производстве этилена и пропилена аппаратчиках органического синтеза (Pero et al, 1982), при этом была показана достоверная отрицательная корреляционная зависимость индекса репарации от стажа работы. Однако при обследовании профессионалов, длительное время работавших во вредных условиях никелевого производства, не найдена какая-либо зависимость индекса репарации от стажа работы и от накопленной концентрации никеля в организме (Перминова с соавт., 2001). В демографическом исследовании Knudsen et al (1999) также не найдена какая-либо зависимость величины индекса химически индуцированного ВС ДНК от стажа и интенсивности работы во вредных условиях у водителей автобусов и почтовых работников Копенгагена.
Таким образом, показано, что спустя несколько десятков лет после облучения сохраняется тенденция к снижению индекса ВС ДНК с выходом на плато при росте поглощенной дозы.
Для анализа возможного влияния аварийных ситуаций на эффективность ВС ДНК в группе профессионалов, подвергшихся острому аварийному облучению, изучали зависимость индекса репарации от величины суммарной поглощенной дозы (при этом вклад дозы аварийного облучения был максимальным) - см. рисунок 12. В целом в этой выборочной группе не было выявлено дозовой корреляции индекса репарации (г = -0,09; р 0,05). Для более подробного анализа в группе профессионалов (108 человек) были сформированы две однородные группы, имеющие значения Куф выше и ниже крайних квартилей («верхняя» и «нижняя» группы) - см. раздел «Статистическая обработка данных». Каждая из этих групп включала одинаковое количество человек - 27 (четвертая часть всей когорты) и имела соответственно максимальное или минимальное усредненное значение Куф. В «верхней» и «нижней» группах были выделены т.н. «аварийщики» - лица, в ходе своей профессиональной деятельности подвергшиеся аварийному острому облучению (см. таблицу 10).
Цитогенетическое обследование профессионалов-атомщиков
Для всех профессионалов-атомщиков, включенных в группу обследования, был проведен рутинный цитогенетический анализ, позволивший выявить уровень нестабильных хромосомных аберраций, в том числе дицентриков и центрических колец - маркеров радиационного воздействия. В общей сложности было проанализировано 104536 метафаз, обнаружено 1898 хромосомных аберраций, из которых 12% (223 аберрации) составили дицентрики и центрические кольца, 34% (638 аберраций) - парные фрагменты, 50% (958 аберраций) аберрации хроматидного типа и 4% (76 аберраций) составили атипичные моноцентрики. Следует отметить, что большинство наблюдаемых аберраций хроматидного типа были хроматидными фрагментами. В среднем для каждого обследуемого пациента было проанализировано 968 метафаз. Распределение суммарной частоты аберраций, частоты дицентриков и колец, парных фрагментов и хроматидных аберраций в группе профессионалов-атомщиков и в контрольной группе представлено на рисунках 17 - 20. Различия между распределением частот аберраций в группах сравнения достоверны по критерию X Колмогорова -Смирнова (р 0,001).
Статистический анализ полученных данных позволил выявить достоверные различия по всем цито генетическим показателям. Средняя общая частота хромосомных аберраций в группе профессионалов составила 1,82 на 100 клеток, что в 2 раза выше аналогичного показателя в контрольной группе. Частота парных фрагментов и аберраций хроматидного типа также достоверно превышает контрольные значения в 2 раза. Что касается маркеров радиационного воздействия - дицентриков и колец,- то их частота в группе профессионалов почти в 3 раза превышает частоту в контрольной группе. Доля кольцевых хромосом среди аберраций обменного типа в контрольной группе составила 12%, в группе профессионалов 7%. Полученные данные хорошо согласуются с данными литературы о соотношении центрических колец к дицентрикам при хроническом облучении лимфоцитов в малых дозах in vitro: доля колец обычно составляет 5 10% (Salomaa et.al., 1997). Высокое соотношение колец к дицентрикам в контрольной группе связано, по-видимому, с общим высоким спонтанным уровнем ХА и с пожилым возрастом доноров.
Была проанализирована зависимость частоты хромосомных аберраций от суммарной поглощенной дозы (т.е. от дозы, накопленной на момент обследования). Статистический анализ не выявил достоверных корреляционных связей между общей частотой хромосомных аберраций и суммарной дозой облучения профессионалов-атомщиков. Коэффициент корреляции для общей частоты хромосомных аберраций составил г = 0,132 (р 0,05). Для частоты дицентриков и центрических колец этот коэффициент был выше - 0,253 (р 0,01). Дозовая зависимость частоты дицентриков и центрических колец в группе профессионалов - атомщиков представлена на рисунке 21. Однако достоверность данной корреляционной зависимости оказалась обусловлена единственной точкой - 0,71 на 100 проанализированных метафаз при поглощенной дозе 510 сЗв. При изъятии этой точки дозовая зависимость становится статистически незначимой.
Окладникова с соавт. (2005) не выявили корреляции частоты ХА с накопленной дозой при длительном фракционированном гамма - облучении работников ядерных предприятий (дозы составили 3-8,5 Зв, стаж работы - до 40 лет). В ряде исследований генетических эффектов у ликвидаторов Чернобыльской аварии (где проводилась точная физическая дозиметрия) также не обнаружена взаимосвязь между данными дозиметрии и частотой нестабильных хромосомных аберраций в отдаленные сроки (6-8 лет) после участия в ликвидации последствий аварии (Lazutka & Dedonite, 1995, Sevan kaev, 1995, Богомазова, 2000).
Таким образом, проведенный цитогенетический анализ позволил выявить среди циркулирующих лимфоцитов периферической крови профессионалов-атомщиков клетки с хромосомными аберрациями - дицентриками и центрическими кольцами, индуцированными облучением в отдаленные сроки (30-40 лет).
В группе профессионалов 26 человек перенесли острое аварийное облучение (см. раздел «формирование групп обследования»). В связи с этим представляется интересным анализ цитогенетических нарушений в лимфоцитах «аварийщиков» при сравнении с цитогенетическими нарушениями в лимфоцитах профессионалов без аварийных ситуаций. Результаты сравнения представлены в таблице 14.
Цитогенетический анализ в выборочных группах профессионалов показал достоверное превышение частоты маркеров радиационного воздействия дицентриков и колец - лишь в группе «ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС» по сравнению с группой профессионалов, не подвергавшихся аварийному облучению. У одного профессионала, подвергшегося аварийному облучению в дозе 5,1 Зв, частота дицентриков и колец превысила соответствующее значение по сравнению с группой «без аварий» в 2,38 раза. В остальных группах (с меньшими аварийными дозами) достоверных различий выявлено не было.
