Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
I. Биологические ритмы клеточного размножения и их регуляция 8
2. Кейлоны и регуляция ритмов размножения клеток 26
3. Заключение по литературному обзору и постановка задач собственных исследований 40
Глава П. Материал и методы исследования 42
I. Объект исследования 42
2. Методы исследования 43
2.1. Получение ядерной и цитоплазматической фракций клеток асцитной опухоли Эрлиха 43
2.2. Получение частично очищенного препарата кейлона
из АОЭ методом спиртовой преципитации 44
2.3. Метод культивирования клеток асцитной опухоли Эрлиха в суспензии 45
2.4. Приготовление гистологических препаратов опухоли и эпителия тонкого кишечника 46
2.5. Авторадиографический метод 46
2.6. Анализ гистоавторадиографических препаратов 47
2.7. Статмокинетический метод 47
2.8. Определение параметров ритмов пролиферации клеток и ритмов кейлонной системы 48
2.9. Определение концентрации белка 49
2.10. Гель-фильтрация кейлонсодержащего спиртового преципитата экстракта клеток АОЭ 49
2.11. Статистическая обработка результатов 50
2.12. Обозначения 50
3. Серии экспериментов 50
Глава Ш. Результаты исследования 55
І. Локализация (jL-нейлона в клетке 55
2. Зависимость действия цитоплазматической и ядерной фракций клеток АОЗ на митотическую активность в ней in vitro от дозы фракций 57
3. Исследование тканевой специфичности действия цито плазматической и ядерной фракций клеток АОЭ на митотическую активность 60
4. Влияние адреналина на митозингибирующую активность цитоплазматической фракции и митозстимулирующую активность ядерной фракции клеток АОЭ 61
5. Влияние различных доз КСП, выделенного из АОЭ методом спиртового фракционирования, на митотическую активность и синтез ДНК в этой опухоли 65
6. Тканевая специфичность действия кейлонсодержащего препарата, выделенного из клеток АОЭ методом спиртового фракционирования, на митотическую активность и синтез ДНК в этой опухоли 73
7. Изучение суточного ритма митотической активности и ритмов функционирования Gp-кейлонной системы 79
8. Изучение суточных колебаний числа ДНК-синтезирующих клеток и закономерностей действия на радиоактивный индекс а..-кейлонной системы 91
9. Изучение суточных колебаний интенсивности мечения ядер клеток АОЭ и закономерностей действия на нее кейлонной системы 106
10. Изучение влияния кейлонсодержащего препарата на продолжительность митоза в АОЭ 120
II. Изучение влияния различных фракций, полученных при гель-фильтрации кейлонсодержащего препарата АОЭ, на митотическую активность и синтез ДНК в
этой опухоли 123
Глава ІУ. Анализ результатов 137
Выводы. 162
Практические рекомендации 163
Литература 164-
- Биологические ритмы клеточного размножения и их регуляция
- Объект исследования
- Зависимость действия цитоплазматической и ядерной фракций клеток АОЗ на митотическую активность в ней in vitro от дозы фракций
Введение к работе
Одной из важнейших задач современной хронобиологии является выяснение механизмов, определяющих периодичность функционирования систем организма и осуществляющих объединение биоритмов в единую систему временной организации (Ю.А. Романов, 1978), одним из компонентов которой являются суточные ритмы пролифера-тивных процессов. Актуальность проблемы регуляции биоритмов репродукции клеток следует из того, что клеточное размножение является важнейшим биологическим процессом, обеспечивающим рост и развитие организмов, передачу наследственной информации, физиологическую и репаративную регенерацию органов и тканей, сохранение и восстановление тканевого гомеостаза (поддержание постоянства клеточного состава).
В последние годы в изучении закономерностей регуляции биологических ритмов пролиферативных процессов, среди которых важнейшими являются суточные ритмы митотическои активности и числа ДНК-синтезирующих клеток, достигнуты определенные успехи.
Показано, что временная организация пролиферативной системы регулируется на различных уровнях. Биологические ритмы, в частности, изменяются под влиянием множества факторов, являющихся по отношению к пролиферативной системе внешними (гормоны, другие биологически активные вещества, свет, температура, давление и т.п.). Но- при этом действие любого экзогенного фактора осуществляется через сложную иерархию регуляторных механизмов, действующих на уровне всего организма, ткани и, наконец, на клеточном уровне через собственные механизмы пролиферативной системы, то есть через внутритканевые регуляторы. На существование внутритканевого уровня регуляции (авторегуляции) пролиферативных процессов указывает прежде всего наличие органной и ткане- вой специфичности ритмов пролиферации (Ю.А. Романов, 1969; віи-menfeld, 1942).
В любой ткани содержится большое количество неспецифических и специфических позитивных (стимулирующих) и негативных (ин-гибирующих) факторов (А. Балаж, И. Блажек, 1982), действующих на пролиферацию. Например, размножение клеток в культуре определяется питательными веществами среды, тканеспецифическими ингибиторами (Houck et al., 1972) и стимуляторами (фактором роста фиб-робластов, митогенным фактором сыворотки и т.д. (Houck et.ai., 1973; Holley, 1975), а деление клеток во взрослом организме регулируется ингибиторами, действующими по механизму отрицательной Обратной СВЯЗИ, И ПОЛОЖИТеЛЬНЫМИ ИНДуКТОраМИ (Bullough, 1967).
В последние годы все большее распространение приобретает представление о том, что авторегуляция размножения клеток осуществляется по принципу отрицательной обратной связи, разработанное Сэтреном (Saetren, 1956), Вейсом И Каванау (Y/eiss,Kavanau, 1957), ИверсенОМ (Iversen, I960), ЦаневыМ И СеНДОВЫМ (Tsanev, Sendov, 1966). При этом с помощью математического аппарата показано, что для контроля пролиферативных процессов нормального эпидермиса необходима и достаточна одна ингибирующая субстанция (iversen, I960). Исходя из тканевой специфичности пролиферативных процессов, действие этого ингибитора должно быть тканеспеци-фичным. Наличие таких ингибиторов в тканях было доказано экспериментально (Bullough, Laurence, I960,а,б; Rytomaa, Kiviniemi, 1964, 1967). Они были названы кейлонами (Bullough, 1962).
Кейлоны, как эндогенные тканеспецифические физиологические регуляторы размножения клеток, могут принимать участие в регуляции ритмических изменений пролиферативных процессов в тканях. Впервые это предположение было высказано Bullough (1969). По его мнению регуляция периодических изменений митотической активности в тканях осуществляется кейлон-адреналиновым комплексом. Суточные колебания адреналина являются главным компонентом в этой системе. Однако эта гипотеза фактически не объясняет значение тканевых факторов в регуляции пролиферации.
Решение вопроса об участии кейлонов в регуляции ритмов про-лиферативных процессов невозможно без изучения состояния кейлонной системы тканей на протяжении суток и его взаимосвязи с ритмами пролиферативной системы. То есть необходим хронобиологичес-кий подход в изучении влияния кейлонов на процессы репродукции клеток. Вместе с тем работы по изучению хронобиологических закономерностей действия кейлонов и их связи с ритмами пролиферации единичны. Фактически охарактеризована лишь ритмическая организация Gp-кейлонной системы в асцитной опухоли Эрлиха и показана ее строгая согласованность с ритмом делящихся клеток (А.И. Антохин, 1979; М.В. Богоева, 1981). Авторы доказали участие о2-кейлонной системы в регуляции ритма митотической активности путем периодического изменения на протяжении суток чувствительности клеток Gp-фазы к действию Gp-кейлона и его продукции (или активности). Такое представление о механизме кейлонной регуляции ритма митотической активности полностью согласуется с идеей о существовании внутрицикловых механизмов формирования суточных ритмов репродукции (Ю.А. Романов, 1969; Clausen et.al., 1979).
Что касается регуляции ритма числа ДНК-синтезирующих клеток и участия в этой регуляции кейлонов, то вопрос этот остается совершенно не изученным, хотя имеются немногочисленные экспериментальные данные, косвенно свидетельствующие о возможности такой регуляции (Bichel et al., 1975; Barfod, 1977; Elgjo et al., 1981). Данное исследование посвящено изучению роли кейлонной системы в регуляции ритмов числа ДНК-синтезирующих и делящихся клеток в асцитной опухоли Эрлиха мышей.
Научная новизна. В работе, проведенной на асцитной опухоли Эрлиха мышей, впервые изучена взаимосвязь между суточными ритмами ДНК-синтетической активности (ритмы числа ДНК-синтезирующих клеток и интенсивности синтеза ДНК) и функционирования а^кейлон-ной системы (ритмы биологической активности в.,-кейлона и чувствительности клеток к его действию). Проведен сравнительный анализ состояния суточных ритмов о2-кейлонной системы и митотической активности. Обнаружено, что активные фазы ритмов биологической активности с2-кейлона и чувствительности клеток АОЭ к нему совпадают во времени суток. Впервые показано, что аналогичная закономерность свойственна фактору, находящемуся в клетках АОЭ и тормозящему синтез ДНК. в них во время s-фазы митотического цикла. Эти данные позволяют объяснить существование в асцитной карциноме Эрлиха суточных ритмов числа митозов и интенсивности синтеза ДНК. В работе установлен ранее неизвестный факт несовпадения во времени суток положения активных, фаз ритмов биологической активности й^кейлона и чувствительности клеток опухоли к нему. Высказывается мнение, что де синхронизация ритмов 0.,-кейлонной системы в опухоли является причиной отсутствия в ней суточного ритма числа ДНК-синтезирующих клеток.
Научное и практическое значение. Результаты работы имеют теоретическое и практическое значение. Их теоретическая значимость связана с тем, что они существенно дополняют имеющиеся представления о функционировании кейлонной системы тканей и ее роли в формировании суточных ритмов пролиферации клеток. В практическом отношении данные, полученные в работе, важны для разработки способов управления размножением клеток с учетом суточных ритмов деятельности пролиферативной и кейлонной систем тканей.
Г Л А Б A I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
I. Биологические ритмы клеточного размножения и их регуляция
В современной биологии хорошо известно, что любая биологическая система имеет не только пространственную, но и временную организацию. Временная организация биологической системы - это совокупность биологических ритмов различных процессов функционирования биосистемы, взаимосвязанных друг с другом и имеющих определенные механизмы регуляции. Выяснение этих механизмов, определяющих периодичность функционирования всех систем организма и осуществляющих объединение биоритмов в единую систему временной организации, является одной из главных задач хронобиологии (Ю.А. Романов, 1976, 1978).
Временная организация присуща и такому важнейшему биологическому процессу, как клеточное размножение. Клеточное размножение в определенной ткани или органе обеспечивает постоянство их клеточного состава или тканевой гомеостаз. Оно осуществляется пролиферирующими или способными к пролиферации клетками, находящимися в резервном состоянии. Временная организация пролифератив-ных процессов выражается в существовании взаимосвязанных их биологических, ритмов, важнейшими из которых являются ритмы митотическои активности, числа ДНК-синтезирующих клеток, длительности различных периодов митотического цикла и т.д.
Большое количество исследований посвящено вопросу о суточном ритме митотическои активности. Существование суточного ритма клеточных делений в настоящее время показано для большинства органов и тканей (И.А. Алов, Н.В. Красильникова, 1962; С.С. Лагучев, 1975;
Ю.А. Романов, 1977 и др.).
Для большинства исследованных нормальных тканей животных показано также существование суточного ритма числа ДНК-синтези-рующих клеток (И.А. Алов, Н.В. Красильникова, 1962; Л.Н. Иванова, 1969; Ю.А. Романов, 1969; С.Г. Мамонтов, 1977; СМ. Кузин, 1980; Scheving, Pauly, 1967; Sigdestad et al., 1969; Pedersson, Hamilton, 1970).
Существуют также многочисленные, хотя и весьма противоречивые данные о ритмических колебаниях на протяжении суток длительности митоза (Ю.А. Романов, В.П. Рыбаков, 1970, 1971; С.Г. Мамонтов, В.В. Синелыцикова, 1977; Kreyberg et.al., 1965; Gyergyay-Malatinsky, Gyergyay, 1967; Clausen et al.» 1979) И S-периода (Ю.А. Романов, Т.В.Савченко, 1979; Twermyr, 1972; Miller et al., 1978; Clausen et al., 1979).
В настоящее время накоплен обширный фактический материал, который свидетельствует о том, что временная организация клеточного размножения характерна для всех уровней биологической организации: растений (В.П. Рыбаков и соавт., 1972; Olszewska, 1977), простейших (Edmunds, 1977), многоклеточных животных (Й.А. Алов, 1975; Ю.А. Романов, 1969, 1977; Scheving et al., 1978). Причем показано, что ритмические изменения процессов репродукции клеток существуют не только in vivo, но и в клеточных системах in Vitro (Е.Н. Никифорова, Г.С. Катинас, 1974; Т.Н. Ивченко, 1977; М.В. Богоева, 1981). Таким образом, из приведенных литературных данных видно, что биологические ритмы в системе размножения клеток, т.е. временная организация этой системы - явление универсальное.
Временная организация размножения клеток имеет сложную многоуровневую регуляцию (Ю.А. Романов, В.П. Рыбаков, 1973). На биологические ритмы размножения клеток, а также на их взаимосвязь, оказывают, влияние как экзогенные, так и эндогенные факторы.
Наиболее важными экзогенными факторами (внешние датчики времени по Ю. Ашофф, 1964), влияющими на временную организацию размножения клеток, являются фотопериод (Ю. Ашофф, 1964; Ю.А. Романов и соавт., 1979а, СМ. Кузин, 1980; G.C. Филиппович, 1980; Aschoff, Pohl, 1978), периодические изменения температуры (Б. Брюс, 1964; Ю.Д. Чугунов, Е.В. Кузнецов, 1974), давления (ф. Браун, 1964), магнитного поля (Brown, Scow, 1978). Для лабораторных животных большое значение имеет режим кормления (Edmands, Adler, 1977; Schulte-Hermann, Dbrffier, 1979). Для человека существенно повышается значение социальной синхронизации биоритмов (Vernikos- Dannelis» Winget, 1979).
Экзогенные факторы осуществляют регуляцию временной организации биоритмов,и в том числе биоритмов размножения клеток, через физиологические системы организма. Многоклеточные организмы представляют собой сложную систему с большим количеством автоколебательных процессов, в которой отдельные подсистемы, в частности нервная и эндокринная, очевидно, могут играть роль согласования ритмов между собой и с внешней средой. Ритмы репродукции находятся в соответствии не только с условиями внешней среды, но также четко скоординированы с функциями всего организма. Такая связь может осуществляться, например, с помощью нервной системы. Так, в литературе существуют данные об участии симпатического и парасимпатического отделов нервной системы в регуляции суточных ритмов пролиферации (С.Г. Мамонтов и соавт., 1980; Tutton, 1975; Klein, 1979). Показана важная роль высших отделов нервной системы (эпифиз, гипоталамус и его супрахиазматические ядра) в регуляции биоритмов (Binkley, 1976; Ibuka, Kawamura, 1976; Alphs, 1978, Swan et al., 1978; Mosko, Moore, 1979). - II -
Большое значение в регуляции временной организации пролифе-ративной системы со стороны организма и, в частности, в ее согласовании с временной организацией всего организма имеет эндокринная система. При этом гормоны могут изменять в течение'суток вероятность перехода клеток из стадии покоя в митотический цикл (О.И. Епифанова, 1976; stoker, 1978), из одной фазы митотическо-го цикла в другую (О.И. Епифанова, 1973; В.П. Михайлов, 1978). Гормоны способны также ускорять прохождение клетками всего мито-тического цикла - эстроген и прогестерон (Н.А. Рослякова, 1970; О.И. Епифанова, 1973; Kimura et.ai., 1976), гормон роста (G.C. Лагучев, 1976), тироксин (В.П. Рыбаков, Ю.А. Романов, 1976), а также тормозить его - глюкокортикоидные гормоны (С.С. Лагучев, 1976), адреналин (С.С. Лагучев, 1975).
Таким образом, временная организация пролиферативных процессов регулируется на различных уровнях, но при этом действие любого экзогенного фактора на организм осуществляется через сложную иерархию регуляторних механизмов, действующих на уровне всего организма, органа, ткани и, наконец, на клеточном уровне. На существование внутритканевого уровня регуляции (авторегуляции) указывает прежде всего наличие органной и тканевой специфичности ритмов пролиферации (Ю.А. Романов, 1969; Blumenfeid, 194-2). Внутритканевая регуляция временной организации пролиферативных процессов является, очевидно, ключевой; именно через нее осуществляется действие всех других регуляторних факторов - организменных и: внешних.
По современным представлениям авторегуляция различных процессов в живых системах, в том числе в пролиферативной системе, осуществляется по принципу отрицательной обратной связи. Идея о регулировании размножения клеток по этому принципу получила тео- ретическую и экспериментальную разработку в работах ряда ученых (Saetren, 1956;;Weiss, Kavanau, 1957; Iversen, 1960; Iversen, Bjerkness, 1963; Tsanev, Sendov, 1966).
Бейс и Каванау (Weiss, Kavanau, 1957) высказали предположение о том, что каждый тип клеток вырабатывает некий стимулятор роста, действующий внутри клеток, и его антагонист, выходящий из клеток в межклеточную среду. Интенсивность клеточного размножения зависит от межклеточной концентрации в ткани антагониста. Взаимодействие стимулятора и его антагониста строго тканевоспеци-фично, так как происходит по типу реакции антиген-антитело.
В работах Иверсена (iversen, I960), Цанева и Сендова (Tsanev» Sendov, 1966) с помощью математического аппарата показано, что для контроля пролиферативных процессов нормального эпидермиса необходима и достаточна одна ингибирующая субстанция, действующая по принципу отрицательной обратной связи.
Буллоу И Лауренс (Bullough, Laurence, 1960а,б) В результате анализа характера ответной митотической реакции в эпидермисе уха мышей при нанесении кожной раны предположили, что нормальные эпи-дермальные клетки выделяют в межклеточную среду некоторое вещество, способное тканеспецифически подавлять деление клеток эпидермиса. Присутствие такого ингибитора было обнаружено в водном экстракте кожи мышей и в опытах in vitro на эпидермисе уха мышей. Подобная система регуляции процессов клеточного размножения была продемонстрирована и для эритроцитов и системы гранулопоэза (ву-tomaa, Kiviniemi, 1964, 1967). В 1962 году Буллоу (Bullough,1962) предложил для обозначения тканеспецифического митозингибирующего вещества термин "кейлон" (chaione) (от греческого XcLXdirt- ослаблять, останавливать). В настоящее время к кейлонам относят также тканеспецифические, ингибирующие синтез ДНК вещества. После - ІЗ - открытия кейлонов тканевой уровень регуляции временной организации пролиферативной системы приобрел реальные очертания.
Приведенные литературные данные дают представление о сложности временной организации пролиферативной системы и многообразии механизмов ее регуляции, действие которых в конце концов замыкается на внутритканевом урогне.
Данные литературы свидетельствуют о том, что временная организация характерна и для опухолей, что еще раз подчеркивает универсальность этого явления. Показано, что в опухолевых тканях существуют суточные ритмы митотической активности и числа ДНК-син- тезирующих клеток (СМ. Коломина, 1966; Т.П. Свиногеева, 1969;
М.В. БерезкинТ А.И. Антохин, 1979; Ю.А. Романов, В.А. Степаненко,
1980; Llanos, Nash, 1970; Nash, Llanos, 1971). Сходны основные закономерности регуляции суточной ритмичности процессов клеточной репродукции в норме и при опухолевом росте (В.И. Васильева, 1970; й.Н. Волков, 1977; Pohie et ai., 1961). По литературным данным характер ритмичности процессов клеточной репродукции в опухолевых тканях так же, как и в нормальных, зависит от фоторежиыа (СМ. Коломина, 1966; Peters et-ai., 1964) и гормонального баланса организма (СМ. Коломина, 1966; Simpson-Herron, Griswold, 1970). Показано, что в опухолевых системах действует и кейлонный механизм регуляции пролиферативных процессов (Bullough, Laurence, 1968; Rytomaa, Kivlniemi, 1968a; Pamela et al., 1973; Deschamps, Verly» 1575; Barfod, 1977). Все выше приведенные факты опровергают представление об автономном, нерегулируемом росте опухолей (Blumenfeld, 1943).
Таким образом, вопрос о временной организации процесса клеточного размножения тесно связан с проблемой функционирования пролиферативной системы тканей и движением клеток в митотическом цикле.
Митотический цикл представляет собой "упорядоченную во времени последовательность физиологических событий, которые в совокупности составляют полный набор процессов, происходящих между двумя митозами" (Б. Гудвин, 1979).
Митотический цикл подразделяется на четыре периода: G^npe-синтетический, s-синтетический, а2-постсинтетический или преми-тотический и М-митоз. Это стало очевидным в результате работ А. Говарда и С. Пелка (Howard, Peic, 1953), которые показали авто-радиографическим методом, что включение Р-^ в ДНК клеток корня конского боба происходит только в интерфазе, заканчиваясь за несколько часов до начала митоза и начинаясь через несколько часов после него.
Для понимания регуляции миготического цикла большое значение имеют моменты перехода клеток из одной его фазы в другую. Это нашло отражение в концепции о критических периодах митотического цикла, предшествующих синтезу ДНК и митозу (О.И. Епифанова,1965).
Б последние годы показано, что в клетках, движущихся по ми-тотическому циклу, происходит смена биохимических процессов, образующих строго определенную последовательность, что, как полагают, и обуславливает движение клеток по циклу (О.И. Епифанова, 1973; И.А. Алов, 1975; Baserga, 1968, 1978). Эти данные косвенно подтверждают концепцию генной регуляции событий митотического цикла путем последовательных транскрипций генома и трансляции генетической информации (О.И. Епифанова, 1973; Baserga, 1968; Mitchison, 1971), что находит отражение в "ступенчатом" типе синтеза ферментов на протяжении митотического цикла. По представлению Mitchison (1971) этот тип регуляции основан на отрицательной обратной связи и проявляется в периодическом синтезе ключевых для митотического цикла ферментов и согласованности во времени этих синтезов.
Таким образом, митотический цикл представляет собой строго согласованную во времени последовательность сложных процессов, включая механизмы их регуляции, среди которых важнейшая роль принадлежит регуляции в самом цикле. Последнее может выражаться, в частности, во взаимодействии между клетками различных фаз митотического цикла (Ю.А. Романов, 1981). О характере этих взаимодействий можно судить исходя из опытов по гибридизации клеток, взятых из различных фаз митотического цикла (Rao, Johnson, 1970, 1972; Matsui et ai., 1977; Rao, Smith, 1981). Как оказалось, эти взаимодействия могут носить положительный либо отрицательный характер, либо не наблюдаться вообще. На взаимодействие между клетками в митотическом цикле указывают и другие литературные данные. Например, результаты, полученные Дэви и соавт. (Dewey et:ai., 1973), о стимулирующем эффекте культуральной среды от клеток, находящихся в s-фазе, на прохождение клетками G^-фази и вступление в s-фазу. Очевидно, во время движения по митотическому циклу клетки могут выделять в межклеточную среду факторы, способные влиять на кинетику клеток в других фазах митотического цикла. О возможности взаимодействия клеточных популяций внутри митотического цикла свидетельствуют и данные Гиакомони и франкешини (Gia- comoni, Pranceschini, 1968) Об укорочении продолжительности Gp- фазы в клетках культуры Hela после торможения в них синтеза ДНК.
К образованию суточного ритма митотической и ДНК-синтетической активности в клетках могут приводить: а) изменения длительности s-периода или длительности митоза (Тт) на протяжении суток: максимум радиоактивного индекса (ЕЙ) и митотического индекса (МИ) наблюдается тогда, когда длительность этих периодов наибольшая, минимум - наименьшая; б) изменения количества клеток, проходящих, через s- и М-фазы.
Некоторые авторы считают, что суточный ритм митозов обуслов--лен изменениями длительности М-фазы, так как показали увеличение Тм на максимуме митотического индекса (Kreyberg et al., 1965; Gyergyay-Malatinsky, Gyergyay, 1967). Однако в работах других исследователей установлено, что изменения длительности митоза в течение суток существуют, но наибольшее время митоза, как правило, приходится на период минимальной митотической активности и наоборот (И.В. Маркелова, 1976; С.Г. Мамонтов, В.В. Синельщико-ва, 1977; Twermyr, 1969). В настоящее время можно считать доказанным, что суточный ритм МИ определяется колебаниями количества клеток, входящих в митоз, а не изменениями длительности митоза (Ю.А. Романов, В.П. Рыбаков, 1970, 1971; С.Г. Мамонтов, Л.Н. Иванова, 1971; Clausen et al., 1979).
Длительность s-периода также может изменяться в течение суток ДОВОЛЬНО значительно (иногда В 3 раза) (Twermyr, 1972; Clausen et al., 1979), но так же, как и в случае митотической активности, в период максимальной ДНК-синтетической активности наблюдается наименьшая длительность s-периода и наоборот (Ю.А. Романов, Т.Е. Савченко, 1979; Burns, Scheving, 1975).
Очень интересны данные, касающиеся, изменений скорости движения клеток по циклу в регенерирующих органах. Например, по данным А.В. Димента (1969, 1970) в мезотелии париетальной брюшины после ее ранения митотический индекс и индекс ДНК-синтезирующих клеток возрастают в 8 и 14- раз соответственно, пролиферативный пул увеличивается с 22-26% в норме до 66%, в то время как длительность S- и Gp-периодов изменяется незначительно (с 12,5 час до 10 час и 2,5 час до I час, соответственно). Для регенерирующего эпителия хрусталика мышей показано, что в условиях его регенерации параметры штотического цикла не изменяются вообще (Rafferty, Smith, 1976).
Таким образом, очевидно, что значимые колебания уровня пролиферации как в норме, так и при регенерации могут достигаться только за счет увеличения количества клеток в митотическом цикле, а не вследствие изменения скорости их движения в нем.
Б настоящее время представления о митотическом цикле значительно расширены и дополнены. Оказалось, что часть клеток может выходить из митотического цикла на неопределенно длительное время, сохраняя при этом способность к пролиферации независимо от степени своей функциональной нагрузки (О.И. Епифанова, 1979). Эти клетки составляют резервную часть пролиферативной системы. Лайта обнаружил выход клеток из о^периода митотического цикла (Lajtha, 1963, 1964-),. Он предложил обозначать период, в котором клетки находятся вне митотического цикла, но потенциально способны войти в него, как Gq-пєриод. Эти клетки, по его мнению, имеют неограниченные способности к пролиферации, способность возмещать в случае необходимости потери клеток (т.е. поддерживать тканевой гомеостаз) и поставлять дифференцированные клетки. Гельфант (Gei-fant, 1963, 1977) показал, что часть клеток может покидать мито-тический цикл и в а2-периоде. О.И. Епифанова и В.Б. Терских (1968) предложили схему клеточного цикла, состоящего из митотического цикла и двух периодов покоя, которые они предложили обозначать щ ^-резервный период) и R2 ^-резервный период).
Соотношение размеров R и r2 клеточных популяций в разных тканях и в различные периоды может быть неодинаковым, но по литературным данным (Geifant, 1977) объем Rp-популяции значительно меньше, чем R1-популяции клеток. Наличие резервных клеток Б R^ и R2 - важнейшая биологическая закономерность: они обнаружены во многих тканях животных и растений как in vivo, так и в системе in vitro, а также у прокариот (Ю.А. Романов и соавт., 1972; В.В. Терских, 1973; О.И. Епифанова, 1979; Geifant, 1977).
Помимо того, что клетки из состояния покоя могут переходить к пролиферации (причем этот переход является случайным и не зависит от времени пребывания в периоде покоя), они могут выполнять специфические тканевые функции (В.В. Терских, 1973), так же как и необратимо дифференцированные клетки, которые не относятся к пролиферативной системе. Очевидно, что выход клеток в резервные популяции и возвращение их в митогический цикл представляет собой такое явление, которое способно изменять количество клеток, движущихся по циклу и вступающих в ту или иную его фазу, в том числе в s- и М-периоды. Причем такие изменения могут формировать суточные ритмы пролиферативных процессов (В.П. Рыбаков и соавт., 1979, 1981).
Однако количество клеток, движущихся по митотическому циклу, может изменяться, и довольно значительно, и в результате выхода клеток в необратимо дифференцированное состояние, которое ведет в конце концов к гибели клеток. Именно эти клетки определяют, главным образом, уровень клеточных потерь в ткани, а значит, существенным образом влияют на такую функцию пролиферативной системы, как сохранение и восстановление клеточного гомеостаза тканей.
Взаимоотношения между пролиферирующими и необратимо дифференцированными клеточными популяциями ткани, не способными к пролиферации, были рассмотрены уже в модели Weiss и Kavanau (1957), которая упоминалась выше. В соответствии с этой моделью генеративные (пролиферирующие) клетки содержат специфические вещества - матри- цы, стимулирующие рост ткани. Дифференцированные клетки вырабатывают антиматрицы, которые, соединяясь с матрицами по принципу комплементарное ти, нейтрализуют их и таким образом замедляют рост ткани. Регуляция роста ткани осуществляется путем взаимодействия дифференцированных и пролиферирующих клеток по механизму отрицательной обратной связи.
Как уже отмечалось, концепция регуляции тканевого гомеоста-за по механизму отрицательной обратной связи получила экспериментальное подтверждение после открытия кейлонов - тканеспецифичес-ких ингибиторов размножения клеток. Рассматривая механизмы такой регуляции, Builough и Rytomaa (1965) выделяют в ткани 4- группы клеток: размножающиеся, незрелые, зрелые и необратимо дифференцированные. Незрелые и зрелые клетки сохраняют способность к пролиферации, т.е. их можно отнести к резервной части пролифератив-ной системы. Кейлоны, регулирующие тканевой гомеостаз по механизму отрицательной обратной связи, вырабатываются зрелыми и дифференцированными клетками и действуют на размножающиеся клетки. Таким образом, фактически в этой модели выделяются 3 различных группы клеток: пролиферирующие, непролиферирующие, но сохранившие способность к пролиферации, и необратимо дифференцированные клетки.
В последние годы широкое распространение получили вероятностные модели клеточных систем. Впервые трехкомпонентная вероятностная модель клеточной системы предложена в 1968 году В.И. Прилуц-ким и Ю.А. Романовым. Согласно этой модели в каждой клеточной системе можно выделить три компоненты: пролиферативный пул - клетки, находящиеся в митотическом цикле, фиксированный пул - клетки, потерявшие способность к пролиферации, баллотирующийся пул - клетки, которые могут переходить или в пролиферативный пул с вероятностью
Р или фиксированный пул с вероятностью 1-Р."С точки зрения авторов параметр Р играет основную роль в регуляции размножения клеток, так как он определяет соотношение между числом клеток, идущих из баллотирующегося пула (резервной части пролиферативной системы) в два других пула клеточной системы. При различных значениях Р и величинах клеточных потерь модель предсказывает возможные состояния клеточных систем - рост, гомеостаз, вырождение. По мнению Ю.А. Романова и А.И. Антохина (1983) в регуляции пролиферации важная роль принадлежит также продолжительности пребывания клеток в баллотирующемся пуле (время баллотирования - Тб), которая, наряду с Р, определяет его объем. Уровень пролиферации может быть неодинаковым при одном и том же значении Р, но разном времени баллотирования клеток, в том числе и в случае гомеостаза, когда существует равновесие между потерей и новообразованием клеток иР близко к 0,5. При этом разные пролиферирующие ткани будут отличаться интенсивностью пролиферации и соотношением объемов указанных трех пулов.
Различные уровни функционирования пролиферативной системы, исходя из трехкомпонентной модели, могут быть связаны с изменениями Тб и Pj которые, в свою очередь, происходят под влиянием тех или иных факторов, инициирующих пролиферацию или дифференцировку клеток. Среди этих факторов важную роль играют кейлоны, действие которых может быть направлено как на клетки пролиферативного пула, так и баллотирующегося ^резервная часть) (Ю.А. Романов, А.И. Анто-хин, 1983).
Среди других вероятностных моделей клеточной пролиферации, получивших широкое распространение, наиболее известными являются модели, предложенные Бернеом и Тэнноком (Burns, Tannock, 1970) и Смитом и Мартином (Smith, Martin, 1973).
Согласно модели Смита и Мартина, основывающейся на данных изучения кинетики клеток в растущих клеточных популяциях in vitro, клеточный цикл состоит из А-фазы с неопределенной длительностью, в которую клетки поступают через некоторое время после митоза, и В-фазы с определенной длительностью, в которую клетки входят из А-фазы. В-фаза включает в себя часть й^фазы, предшествующую ь-периоду, S-, G„- и М-фазы митотического цикла (по терминологии Бернса и Тэннока (Burns, Tannock, 1970) А-фаза называется G, а В-фаза - С). Переход клеток из А в В является случайным и происходит с вероятностью Р. Изменение вероятности перехода является основным регуляторним механизмом кинетики клеток. Величина Р, как полагают авторы, характеризует тип клеточной системы и может определяться концентрацией какого-то одного фактора, инициирующего синтез ДНК, контролируемого по механизму отрицательной обратной связи.
Двухкомпонентные вероятностные модели были предложены и другими авторами (De Maertelaer, Galand, 1975; Shields, 1977), НО все они не рассматривают пул дифференцированных, неспособных к делению клеток, анализируя фактически только пролиферативную систему, тогда как в клеточных системах in vivo наличие таких клеток обязательно. Поэтому эти модели могут рассматриваться как частный случай трехкомпонентной модели, предложенной Б.И. Прилуцким и Ю.А. Романовым (1968), при вероятности перехода Р, близкой к I, и неопределенном времени баллотирования клеток Tg. Идея трехкомпонентной структуры тканей и ее роль в регуляции и сохранении клеточного гомеостаза поддерживается многими авторами .(В.Г. Тяже-лова, И.Г. Акоев, 1976; Fukuda et ai., 1978).
Итак, в ткани, очевидно, существует три группы клеток - собственно пролиферирующие клетки (пролифератизный пул), резервные клеточные популяции R1 и R2 (баллотирующийся пул) и необратимо дифференцированные клетки (фиксированный пул). При рассмотрении регуляции функционирования пролиферативной системы необходимо учитывать структуру клеточной системы ткани в целом и все возможные взаимоотношения между частями этой структуры. Регуляция пролиферации клеточной системы осуществляется в основном через резервные популяции (баллотирующийся пул). При этом важную роль играет механизм отрицательной обратной связи, осуществляющийся через тканеспецифические ингибиторы размножения клеток - кейло-ны (Ю.А. Романов, А.И. Антохин, 1983). Помимо кейлонов в тканях, очевидно, существуют и другие факторы, вызывающие переход клеток из резервного состояния либо к пролиферации, либо к необратимой дифференцировке, как стимуляторы, так и ингибиторы. Причем переход клеточной системы в другое состояние может регулироваться либо путем изменения концентрации (или активности) соответствующих факторов дифференцировки или пролиферации, либо путем изменения чувствительности клеток к ним, что в конце концов может привести к формированию биологических ритмов процессов клеточной репродукции, совокупность которых образует временную организацию пролиферативной системы. Среди этих ритмов важное место занимают ритмы числа ДНК-синтезирующих и делящихся клеток.
Как отмечалось, ритмические изменения количества клеток, проходящих через ту или иную фазу митотического цикла, могут наблюдаться либо в результате изменения длительности соответствующих фаз, либо путем колебания общего числа клеток в этой фазе. Как следует из литературных данных, описанных выше, периодические изменения скорости движения клеток в s- и М-фазах име% место, и исключить их нельзя, но все же главная роль, очевидно, принадлежит механизмам,--обеспечивающим синхронное вступление клеток в йа- зы цикла, т.е. ритмы формируются за счет истинного изменения количества клеток в той или иной фазе митотического цикла. При этом возможно существование двух принципиально различных механизмов, обеспечивающих такие ритмические изменения количества клеток в фазах митотического цикла: ритмический выход клеток из резервной части пролифера-тивной системы в цикл; синхронизация движения клеток по митотическому циклу (внутрицикловые механизмы).
Предположение о возможности формирования суточных ритмов пролиферации клетками &0-фазы было высказано Бернсом и Тэнноком (Bums, Tannock, 1970). Они считают, что на протяжении суток происходят ритмические изменения величины вероятности перехода клеток из а0-фазы в митотический цикл, что приводит к образованию синхронной волны клеток, движущихся по митотическому циклу. Экспериментальное подтверждение такой возможности получено сравнительно недавно (В.П. Рыбаков и соавт., 1977; В.П. Рыбаков и со-авт., 1979, 1981). Авторы показали, что ритмическое повышение числа делящихся клеток в эпителии пищевода мышей могут образовывать клетки как участвовавшие, так и не участвовавшие в предшествующие сушки в таком подъеме. В печени повышение числа митозов целиком обеспечивается клетками, не участвовавшими в предшествующие сутки в митотическом цикле. То есть, как в быстро-, так и в медленнообновляющихся тканях в формировании подъема митотической активности суточного ритма принимают участие клетки резервной части пролиферативной системы. Ритмический выход этих клеток в пролиферацию регулируется различными факторами, среди которых могут быть и кейлоны.
В 1963 году Пилгрим и соавт. (Pilgrim et al., 1963) в ряде тканей мышей обнаружили взаимосвязь суточных ритмов ДНК-синтези-рующих и делящихся клеток и высказали предположение о том, что эти ритмы хотя бы частично обусловлены синхронизацией клеток перед s-фазой и синхронным прохождением ими последовательно s-, g2-и М-фаз митотического цикла. Согласованность ритмов РИ и МИ обнаружена и в других клеточных системах ( Ю.А. Романов и соавт., 1970; Б.П. Рыбаков и соавт., 1979; Sigdestad et al., 1969; Sig-destad, besher, 1971). Исходя из этих данных, сложилось представление о синхронизации клеток в^- (или GQ) периоде и о "волне пролиферации", более или менее синхронно проходящей по митотиче-скому циклу и формирующей максимум ДНК-синтетической и митотиче-ской активности (В.А. Гущин, 1977; Б.П. Рыбаков и соавт., 1979; Izquirdo, Gibbs, 1972, 1974). Однако ряд данных свидетельствует о лабильности взаимосвязи ритмов ДНК-синтезирующих и делящихся клеток. Так, в тканях может иметь место суточный ритм митозов при отсутствии ритмических изменений числа ДНК-синтезирующих клеток (Ю.А. Романов, В.А. Степаненко, 1980; А.И. Антохин, Ю.А. Романов, 1982; Nash, Llanos, 1971), два подъема индекса ДНК-синте-зирующих клеток (двуфазный ритм) и один подъем митотического индекса (монофазный ритм) (Ю.А. Романов и соавт., 1972; Н.Г, .Быст-_ ренина,„1976; В.И. Демский, 1976; А.Г. Мустафин, 1977), монофазный ритм числа ДНК-синтезирующих клеток и двуфазный ритм митозов' (С.Г. Мамонтов, Л.Н. Иванова, 1976). Кроме того, не наблюдается полной идентичности суточных кривых митотического и радиоактивного индексов (С.С. Лагучев, А.И. Пивоварова, 1968; Ю.А. Романов, 1969). По данным С.С. Лагучева (1975) во всех исследованных органах подъемы МИ были более резкими, чем подъемы РИ. Длительность повышенной митотической активности была значительно короче, чем периода повышенного РИ. Эти данные указывают на относительную не- зависимость формирования ритмов ДНК-синтезирующих и делящихся клеток (Ю.А. Романов и соавт., 1972; С.С. Лагучев, 1975). Ю.А. Романов (1969) высказал предположение о существовании механизмов синхронизации движения клеток по митотическому циклу, действующих перед митозом и перед s-фазой и функционирующих относительно независимо друг от друга. По мнению С.С. Лагучева (1975) более строгая синхронизация вступления клеток в митоз по сравнению с синхронизацией вступления клеток в синтез ДНК, вероятно, свидетельствует о том, что по окончании периода синтеза ДНК какой-то фактор определенное время тормозит вступление клеток в митоз и своим.действием вызывает дополнительную синхронизацию митозов во многих клетках ткани. Гельфант (Geifant, 1977) считает, что суточные ритмы Рй и МИ являются следствием периодических блоков в G.J- и о2-фазах и последующего освобождения клеток от них. Такими блокаторами, обеспечивающими синхронизацию кинетики клеток в G.-и Gp-фазах митотического цикла, очевидно, могут быть кейлоны.
Таким образом, ритмы пролиферации и, в частности, ритмы числа ДНК-синтезирующих клеток (РИ) и делящихся клеток (МИ) формируются, очевидно, в результате действия как внутрицикловых, так и клеточнопопуляционных механизмов, контролирующих взаимосвязь между функционирующей и резервной частями пролиферативной системы.
Ритмы пролиферативной системы, как уже отмечалось вые, изменяются под влиянием множества факторов, являющихся по отношению к этой системе внешними (гормоны, другие биологические активные вещества, свет, температура, давление и т.д.) и обеспечивающих согласованность временной организации пролиферативной системы с ритмическими изменениями в организме и во внешней среде. Но, очевидно, действие всех этих факторов реализуется через собственные механизмы пролиферативной системы, среди которых важную роль иг- рают кейлоны.
2. Кейлоны и регуляция ритмов размножения клеток
Со времени экспериментального подтверждения наличия в тканях кейлонного механизма регуляции процессов пролиферации, действующего по принципу отрицательной обратной связи (Buiiough, Laurence, 1960а, б; Buiiough, 1962; Rytomaa, Kiviniemi, 1964-, 1967), изучены многие вопросы, касающиеся закономерностей функционирования кейлонов, их биологических и физико-химических свойств.
Основные достижения в области изучения кейлонов проанализированы в ряде литературных обзоров (С.А. Кетлинский, 1980; В.Б. Окулов, 1981; Buiiough, Rytomaa, 1965; Buiiough, 1969; Elgjo, 1972; Houck, 1975; 1979; Iversen, 1975; Thomley, Laurence, 1975; Attalah, 1976; Thomley, 1976; Allen, Smith, 1979; Rytomaa, Toivonen, 1979), исходя из которых основными биологическими свойствами кейлонов являются следующие:
1) кейлоны вырабатываются и присутствуют только в тех тка нях, на которые они действуют;
2) действие кейлонов тканеспецифично, но не видоспецифично; 5) кейлоны действуют на Gp-фазу и/или на G^-фаву клеточного цикла, предотвращая вхождение клеток соответственно в митоз или фазу синтеза ДНК, что послужило основанием для выделения G.,- и G -кейлонов;
4-) действие кейлонов кратковременно и обратимо; кейлоны не повреждают клетки или клеточные мембраны; кейлоны вызывают ингибирование процессов клеточного деления как in vivo, так и in vitro; кратковременность действия кейлонов может быть связана с существованием их антагонистов - "антикейлонов"; кейлоны могут действовать местно, путем диффузии через ткани, либо через системы циркуляции; действие кейлонов определенным образом зависит от стресс-гормонов (адреналин, гидрокортизон);
10) кейлоны водорастворимы.
В настоящее время тканеспецифические ингибиторы размножения клеток обнаружены во всех тканях, где они изучались (С.А. Кетлинский, 1980; А. Балаж, И. Блажек, 1982).
Кейлонный механизм регуляции пролиферативных процессов установлен также во многих опухолях. Впервые это показано для плоскоклеточного рака кожи VX2, трансплантируемого кроликам (Bullough, Laurence,19686). Авторы получили, что водный экстракт этой опухоли снижает митотическую активность эпидермоцитов мышей in vitro. Кроме того, у кроликов с опухолью VX2,достигшей больших размеров, существенно снижена митотическая активность эпидермоцитов, в то время как другие клетки делятся с нормальной скоростью.
К настоящему времени показано, что большинство исследованных опухолей продуцирует биологически активные кейлоны, сохраняющие все основные характеристики кейлонов нормальных тканей, из которых происходят все опухоли (А.И. Антохин и соавт., 1977; В.Б. Захаров, 1980; Bullough, Laurence, 1968а,б; Laurence, Elgjo, 1971; Bichel, 1972; Papageorgion et al., 1974; Seiji et al., I974-; Guigon et al., 1976; Aardal et al., 1977; Boll et al., 1979).
В.Б. Окулов и А.А. Колобов (1983) провели сравнительный биохимический анализ эпидермального &2-кейлона, выделенного из кожи интактных крыс и из плоскоклеточных раков кожи, индуцированных аппликациями ДМБА. Они установили идентичность изоэлектрических точек, электрофоретической подвижности, молекулярных масс, а так- же иммунохимических характеристик кейлонов нормальной и опухолевой ткани.
Для выделения и очистки кейлонов в настоящее время применяются все основные методы препаративной биохимии. Все частично или полностью очищенные кейлоны представляют собой полипептиды, белки или гликопротеиды, поэтому для их выделения используются методы белковой химии. Какой-либо общей схемы, применяемой для всех типов клеток, не существует. Более того, процесс очистки кейлона даже из одного источника сильно варьирует в зависимости от теоретических предпосылок. В связи с тем, что кейлоны водорастворимы, первым этапом их выделения является водная экстракция из тканевых гомогенатов. Кейлоны в растворенном виде не теряют ингибирующей активности при хранении на холоду (0-4С) в течение нескольких дней. Однако многие исследователи подвергают водные экстракты лиофилизации. В таком виде срок хранения кейлонов значительно увеличивается, по меньшей мере до 0,5 года (Buiiough et. al., 1964).
Нужно отметить, что многие исследователи применяют малоочи-щенные препараты кейлонов при изучении биологических закономерностей их действия (Elgjo, 1974; Irons, Clermont, 1979; Puzas et.. al., 1981; Eigjo, Clausen, 1983). Это связано прежде всего с тем, что кейлоны содержатся в тканях в небольших концентрациях (А. Ба-лаж, И. Блажек, 1982; Allen, Smith, 1979), а значит, требуются большие объемы исходного тканевого экстракта для получения нужного количества ингибитора. В то же время для изучения биологических свойств необходимо гораздо больше активного материала, чем для исследования физико-химических, характеристик. По мнению Allen, Smith (1979) сообщения о получении гомогенных препаратов с активностью in vitro, выражаемой в мг/мл (Kiger et al., 1972), должны оцениваться с осторожностью, так как метод, используемый для оценки гомогенности, может быть недостаточно чувствительным. Действительно, при электрофорезе типичное окрашивание гелей может выявить не менее 1-2 мкг белка, в то время как кейлон может присутствовать и проявлять биологическую активность в "гормональных" концентрациях, (на уровне 10 нг). Затрудняет работу по очистке кеилонов и их способность образовывать комплексы с анионными полиэлектролитами (Houck, 1979), а также, в некоторых случаях, потеря активности по мере очистки. Таким образом, проблема получения гомогенных препаратов весьма сложна, но на пути ее реализации уже достигнуты определенные результаты.
В исследованиях по кейлонной тематике довольно широко используется метод спиртового фракционирования водных экстрактов. Впервые он был применен для выделения эпидермального о2-кейлона из кожи мышей (Buliough et al., 1964). Метод не позволяет получить кейлонный препарат высокой степени гомогенности. По данным Маррса и Вурхиса (Marrs, Voorhees, I97X) 70-80% этанольный экстракт кожи новорожденных мышей дает 8 отдельных белковых зон при диск-электрофорезе. Вместе с тем, метод позволяет избавиться от многих неспецифических примесей, содержащихся в водном экстракте. Так, Кигер и соавт. (Kiger et al., 1972) проводили последовательное насыщение водного экстракта тимуса теленка этанолом до 25, 50 и 15%. Авторы установили, что основная кейлонная активность была сосредоточена в последнем супернатанате, при этом первые две фракции содержали лишь незначительное количество кейлона. Достаточная эффективность, доступность и простота данного метода обусловили широкое его применение при исследованиях биологических характеристик кеилонов, а также в качестве начального этапа при выделении высокоочищенных препаратов кеилонов (С.А. Кетлинский и - зо - соавт., 1978; М.В. Богоева, 1981; М.В. Семенова, 1981; В.Б. Окулов; А.А. Колобов, 1983; Э.М. Тарарак и соавт., 1983; Hondius-Boi-dingh, Laurence, 1968; Chopra et al., 1974; Thornley,Laurence,1976).
На различных этапах выделения и очистки кейлонов широко применяется метод гель-фильтрации (ЮЛ. Бала, А.П. Калашникова, 1983; Verly, 1973^Verly, 1976; Paukovits, Hinterberger, 1978; Poa et al, 1979; Privat de Garilhe et al., 1980; Lenfant et al., 1981; Maschler, Maurer, 1981; McMahon et al., 1982; Guigon et al.,I982; Maschier et al., 1983). С помощью хроматографии на сефадексе g-200 Бругал и Пелмонт (Brugai, Peimont, 1975) разделили а - и а -кейлонные активности, содержащиеся в водном экстракте кишечника тритонов. Гонзалес и Верли (Gonzales, Verly, 1978), применяя последовательную хроматографию водного экстракта молочной железы коровы на различных носителях, получили гомогенный по данным электрофореза G.-кейлонный препарат. Вместе с тем, некоторые авторы отмечают определенные трудности очистки кейлонов данным методом, связанные прежде всего с хроматографированием активного материала широким фронтом (Laurence, 1973; Thornley, Laurence, 1975). Однако думается, что при подборе оптимального разделяющего геля и условий элюирования препарата с колонки этот недостаток может быть устранен, что доказывается успешным применением данного метода в работах последних лет.
В.Б. Окулов и соавт. (В.Б. Окулов, С.А. Кетлинский, 1975, 1977; В.Б. Окулов и соавт., 1978) получили высокоочищенный кей-лонный препарат из водного экстракта кожи крыс, применив иммуно-химические методы. Им удалось установить, что в этанольном экстракте кожи крыс, содержавшем G^ и &2-кейлоны, присутствует по крайней мере 7 белков, иммунологически идентичных сывороточным белкам крыс. Эти белки были удалены из активного экстракта путем - ЗІ - иммуноадсорбции на соответствующих полимеризованных антителах. Непрореагировавшие компоненты спиртового экстракта белковой природы обладали тканеспецифической ингибирующей активностью на вступление в митоз и синтез ДНК эпидермоцитов наружного уха мышей. Методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе эти компоненты, обладающие свойствами G.,- и б2-кейлонов, были разделены и затем определена их молекулярная масса (21000 и 35000).
В настоящее время получены такие выеокоочищенные препараты гранулоцитарНОГО КейЛОНЭ (Paukovits, Hinterberger, 1978; Pauko-vits et.al., 1980). Он представляет собой высокополярный пептид с молекулярной массой 570-590, состоящий из пироглютаминового, двух аспарагиновых, цистинового, лизинового и глицинового аминокислотных остатков. Аналогичные результаты сообщены недавно и другой исследовательской группой (Foa et.al., 1983). По данным фоа и соавт. гранулоцитарный кейлон представляет собой пентапеп-тид, состоящий из пироглютаминового, глютаминового, аспарагиново-го, цистинового и лизинового аминокислотных остатков. Они получили также синтетический аналог природного гранулоцитарного кейло-на. Однако оказалось, что синтетический препарат проявил свое действие в гораздо больших дозах по сравнению с препаратом, выделенным из гранулоцитов. Причем действие его осуществлялось только в системе in vitro. По мнению авторов это связано либо с ошибкой в определении последовательности аминокислот в природном кейлоне, либо с присутствием в нативном препарате неопределяемых примесей, усиливающих его активность.
Большие успехи достигнуты также .при очистке и характеристике лимфоцитарных кейлонов (Lenfant et-аі., 1976, 1981, 1982).
Анализируя данные по биохимии кейлонов, можно придти к выводу об их немногочисленности и противоречивости. Аллен и Смит про- демонстрировали это в своей обзорной статье (Allen, Smith, 1979) на примере значений молекулярной массы лимфоцитарного кейлона, полученных различными исследовательскими группами, которая колеблется от 1400 до 50000-70000. В последнее время для объяснения таких значительных колебаний в величине молекулярной массы используется, во-первых, гипотеза о случайной агрегации молекулы кейлона с тканевыми компонентами (Maioio et ai., 1975; Allen, Smith, 1979) и, во-вторых, предположение об субъединичной структуре кейлонов. Согласно этому мнению, высказываемому многими авторами, низкомолекулярный активный ингибитор образует комплекс с более крупной молекулой-носителем, обеспечивающей тканевую специфичность действия (Paukovits, 1976; Houck, 1978; benfant et al., 1978; Maschler, Maurer, 1979; Iversen, 1980) И иммунологическую активность кейлона (В.Б. Окулов, І98І6).
Итак, кейлоны по совокупности свойств имеют протеиновую, гликопротеиновую и/или пептидную и гликопептидную химическую природу, обладая различной чувствительностью к протеолитическим и температурным воздействиям. В организме, возможно, существует в комплексе с высокомолекулярным носителем.
Препараты кейлонов обычно выделяют из целых клеток, поэтому они, как правило, загрязнены неспецифическими факторами, например, лизосомальными ферментами, что может привести к их разрушению. Вопрос о локализации кейлонов в клетке до настоящего времени практически не изучен. Имеются лишь весьма немногочисленные и противоречивые данные. В связи с этим, очевидно, новые возможности открывает применение зонального центрифугирования для разделения субклеточных фракций. Этот метод был применен при выделении кейлона лимфоидных клеток (Grundbroeck-Jusko, 1974). Автор обнаружил кеилонную активность во фракции микросом после разделения в градиенте CsGi, представляющих собой, как известно, замкнутые пузырьки, образовавшиеся из мембран эндоплазматической сети в процессе гомогенизации ткани. Локализация кейлона на мембранах и, в частности, на наружной клеточной мембране показана прямо или косвенно и другими исследователями (А.Г. Маленков, 1981; В.И. Рыкова и соавт., 1981; В.П. Ямскова, 1981). Вместе с тем, по данным Г.Д. Туманишвили и Л.А. Гогсадзе (1981) кейлоны содержатся в ядерной фракции клеток печени и почек кур. Таким образом, вопрос о локализации кейлонов в клетке требует дальнейшего исследования. Кейлоны - тканеспецифические ингибиторы клеточного размножения. Поэтому их биологическая активность оценивается прежде всего по действию на пролиферативные процессы в нормальных, стимулированных, опухолевых и трансплантированных системах in vivo и в клеточных системах in vitro. Чтобы судить об эффективности воздействия кейлонов, необходимо использовать количественные параметры. Такими параметрами, измерение которых может служить критерием для оценки пролиферативных процессов и которые изучаются при биологическом тестировании кейлонов, являются радиоактивный индекс (РИ, индекс числа меченых ядер), митотический индекс (МИ), интенсивность синтеза ДНК (ИМЯ, интенсивность мечения ядер), размер и вес органа, подсчет числа клеток (время удвоения клеточной популяции), в том числе изменение числа и/или размера колоний клеток и т.д. При этом важно измерять наиболее информативные па-' раметры в соответствующие промежутки времени, в противном случае можно получить неадекватные результаты (Biazsek et ai. , 1976; Clermont» Mauger, 1974). To есть, чтобы получить полное представление о характере действия кейлонов на ту или иную тест-систему, необходимо знать кинетические параметры их действия: латентный период, продолжительность и обратимость эффекта. А это, в свою очередь, возможно лишь при достаточно длительном сроке исследования через небольшие промежутки времени. Только такое всестороннее исследование дает возможность выяснить закономерности действия кейлонов на пролиферацию клеток и их участие в формировании биологических ритмов размножения клеток.
Как уже отмечалось выше, кейлоны могут принимать участие в контроле над ритмическими изменениями пролиферативных процессов в тканях. Впервые предположение об участии кейлонов в формировании суточного ритма митотической активности было высказано Буллоу (Buiiough, 1969). По его мнению этот ритм зависит от концентрации кейлон-адреналинового комплекса. Причем ритмические колебания на протяжении суток претерпевает концентрация адреналина, а содержание кейлона, по мнению Буллоу, при этом не изменяется. Гипотеза Буллоу в таком виде не нашла экспериментального подтверждения.
Кейлоны могут принимать участие в регуляции ритмических изменений размножения клеток по крайней мере двумя путями: на протяжении суток может изменяться количество клеток ткани, чувствительных к действию кейлона; в течение суток могут происходить ритмические изменения продукции или активности кейлонов в тканях.
В настоящее время существование как одного, так и другого пути доказано экспериментально. Суточный ритм чувствительности популяции клеток к действию кейлонов показан для асцитной опухоли Эрлиха (А.И. Антохин и соавт., 1976; А.її. Антохин, 1979; А.И. Антохин и соавт., 1981; М.В. Богоева, 1981; А.ЇЇ. Антохин, Ю.А. Романов, 1982) и эпидермиса кожи (Eigjo et al., 1981).
В экспериментах, проведенных А.її. Антохиным и соавторами, введение кейлонсодержащего препарата, выделенного методом спиртового фракционирования из 5-дневной асцитной опухоли Эрлиха, про- изводилось в разное время суток мышам с опухолью на 5 день ее развития. Митотический индекс определялся через 4, 8 и 12 часов после каждого введения. Оказалось, что клетки опухоли реагируют на введение Gp-кейлона ингибированием МИ через 4 часа неодинаковым образом при его введении в разное время суток. Наибольшая чувствительность к действию Gp-кейлона наблюдается в то время суток, когда происходит уменьшение митотического индекса, а наименьшая - во время минимума и возрастания числа делящихся клеток в суточном ритме. То есть в опухоли существуют суточные колебания чувствительности клеток к действию Gp-кейлона, выделенного из этой опухоли (А.И. Антохин, Ю.А. Романов, 1982).
Аналогичные данные получены также для эпидермального кейлон-содержащего экстракта (Eigjo et al., 1981; Eigjo, Clausen, 1983). Авторы обнаружили взаимосвязь между митозингибирующим эффектом кейлона и суточным ритмом размножения клеток эпидермиса: при введении нейлона на максимуме митотической активности в ритме инги-биция митозов составляла 42%, а при введении препарата во время минимума митотической активности в ритме - 74%.
Эти данные свидетельствуют о том, что суточный ритм митотической активности может быть обусловлен суточными колебаниями чувствительности клеток к действию кейлона: в то время, когда клетки менее чувствительны к действию митозингибирующего ткане-специфического фактора, наблюдается максимум митотической активности в суточном ритме и наоборот.
Другой путь влияния кейлонов на уровень пролиферации клеток в течение суток - ритмическое изменение их продукции или активности в ткани. Первые экспериментальные доказательства возможности существования такого механизмы были получены Канелла (Caneiia, 1977). Он показал, что кейлонеодержащий препарат, выделенный из печени крыс, обладает различным митозингибирующим эффектом на клетки печени куриных эмбрионов через 5 часов после введения, в зависимости от времени выделения этого препарата. Препарат, выделенный в 21 час суток, обладал вдвое большим митозингибирующим эффектом по сравнению с препаратом, выделенным в 9 часов суток. Аналогичные данные получены С.С. Филиппович и В.Б. Захаровым (1978). Они изучали митозингибирующий эффект кейлонсодержащего препарата, выделенного из асцитной опухоли Эрлиха, А- раза в сутки (в II, 17, 23 и 5 час). Все препараты тестировали путем введения животным-опухоленосителям в одно и то же время - в II часов суток, на минимуме митотической активности в ритме, когда наблюдается максимальная чувствительность клеток опухоли к действию кейлона (А.И. Антохин и соавт., 1976). Оказалось, что препараты, выделенные из АОЭ в II и 5 час суток, подавляли деление клеток в этой опухоли через 4- часа после введения соответственно на 38 и 55%. В то же время препараты, выделенные в 17 и 23 часа суток в тех же дозах, не оказывали достоверного митозингибирующего эффекта. Эти экспериментальные данные свидетельствуют о существовании суточного ритма продукции (или активности) о2-кейлона в асцитной опухоли Эрлиха.
В дальнейших экспериментах по изучению участия а2-кейлонной системы в регуляции ритма митотической активности (А.И. Антохин, 1979; А.й. Антохин, Ю.А. Романов, 1982) исследовалась чувствительность популяции клеток АОЭ в разные часы суток к действию кейлонсодержащих препаратов, выделенных из опухоли в это же время. Оказалось, что величина ингибирования деления клеток ,в опухоли под влиянием кейлонсодержащего препарата зависит: I) от времени выделения этого препарата; 2) от времени введения на протяжении суток. Причем величина ингибирования коррелирует определенным образом с суточным ритмом митотической активности. Оказалось, что максимумы в ритмах активности кейлонсодержащего препарата и чувствительности клеток к нему совпадают и приходятся на время снижения и минимума митотической активности в ритме.
Аналогичные результаты получены М.Б. Богоевой (1981), которая изучала биологическую активность препаратов, выделяемых в разное время суток из клеток АОЭ,по их действию на митотический индекс в культуре клеток этой опухоли. При этом ритм чувствительности клеток к а2-кейлону исследовался путем введения одного и того же кейлонсодержащего препарата в те же часы суток, в которые производилось выделение Gp-кейлона для тестирования на ритм продукции (или активности).
Приведенные результаты свидетельствуют о строгой согласованности во времени ритмов, характеризующих состояние кейлонной системы в асцитной опухоли Эрлиха (ритм чувствительности клеток к кейлону и ритм продукции и/или активности кейлона) с ритмом митотической активности в этой опухоли.
Ритмические изменения концентрации эпидермального Gp-кейлона в эпителии пищевода установлены В.Б. Окуловым (1981) методом количественной иммунодиффузии, что косвенно указывает на существование суточного ритма продукции Gp-кейлона. Причем максимум в ритме концентрации кейлона совпадал с минимумом в суточном ритме митозов в этой ткани.
И.Г. Торшина и А.С. Симбирцев (1983) определили концентрацию эпидермального є2-кейлона в эпителии пищевода крыс непрямым методом Кунса и методом количественной иммуноморфологии. Они показали, что максимум в ритме концентрации Gp-кейлона наступает за несколько часов до минимума в ритме митотической активности, что согласуется с данными о суточном ритме продукции (активности) G?- кейлона и его соотношении с ритмом митотической активности в ас-цитной опухоли Эрлиха.
На основании полученных данных Ю.А. Романовым и соавт. (1983) предложена модель, объясняющая механизм формирования суточного ' ритма митозов ритмическим функционированием о2-кейлонной системы. На протяжении суток существует, интервал времени, когда популяция а2-клеток наиболее чувствительна к действию а2-кейлона, в это же время продуцируется максимальное его количество. В результате в это время наибольшее число клеток задерживается в а2-фазе, что приводит к уменьшению числа митозов, т.е. к минимуму митотической активности в ритме. После снятия кейлонного блока (во время минимума в ритмах функционирования кейлонной системы) клетки синхронно вступают в митоз и формируют максимум в суточном ритме деления клеток.
Такое представление о механизме кейлонной регуляции ритма митотической активности полностью согласуется с идеей о существовании механизмов синхронизации движения клеток по митотическо-му циклу, действующих перед митозом и перед s-фазой и функционирующих относительно независимо друг от друга (Ю.А. Романов,1969), т.е. о существовании внутрицикловых механизмов формирования суточных ритмов (см. выше).. Таким образом, функционирование описанного выше а2-кейлонного механизма формирования ритма митозов относится к клеткам, находящимся в митотическом цикле.
Существование подобного механизма формирования суточного ритма числа ДНК-синтезирующих клеток с помощью в..-кейлонной системы в настоящее время не доказано. Хотя имеются некоторые экспериментальные данные, дающие возможность предположить его возможность. Так, ЭЛДЖЬО И соавт. (Elgjo et.al., 1981; Elg^o, Clausen, 1983) обнаружили, что эпидермальный кейлонсодержащий препа- рат при введении в вечерние часы подавляет вступление клеток в s-фазу цикла через 4 часа после введения на 76%, а при введении утром - на 60%. Это говорит о том, что в эпидермисе существует принципиальная возможность суточных колебаний чувствительности клеток Q^-фази к действию G.-кейлона. В других работах показана способность G.-кейлона эпидермиса (Eigjo, 1974) и Gv-кейлона ас-цитной плазмоцитомы JB-1 (Bichei et al., 1975; Barfod, 1977) оказывать синхронизирующее действие на вступление клеток в^фазы в фазу синтеза ДНК. Приведенные факты указывают на возможность существования а..-кейлонного механизма формирования суточного ритма числа ДНК-синтезирующих клеток, но вопрос этот требует экспериментальной разработки.
Итак, мы рассмотрели вопрос о возможном участии кейлонов в формировании суточных ритмов делящихся и ДНК-синтезирующих клеток путем воздействия их на клетки,непосредственно движущиеся по митотическому циклу, т.е. кейлоны действуют в данном случае как один из участников системы внутрицикловой регуляции суточных ритмов пролиферативных процессов.
Как уже отмечалось в I разделе литературного обзора, суточные ритмы пролиферативных процессов могут формироваться за счет ритмического выхода клеток резервной части пролиферативной системы в митотический цикл (клеточно-популяционный механизм формирования суточных ритмов). Среди факторов, которые могут обеспечивать такие ритмические выходы, могут быть и кейлоны. Причем это может обеспечиваться за счет изменений на протяжении суток продукции кейлонов, носящих характер суточного ритма. При снижении конц ентрации кейлона в ткани повышается вероятность перехода клеток из резервного пула в пролиферацию. Такая возможность доказывается некоторыми экспериментальными данными. Бичел (Bichei,
1976) объясняет повышение митотической активности в асцитных опухолях после удаления их части выходом клеток из покоящегося состояния вследствие уменьшения концентрации "кейлона. С.А. Кетлинский (Ї98І) показал, что кейлоны оказывают ингибирующее действие на переход клеток из покоящегося состояния в митотический цикл в регенерирующем эпидермисе, печени и в эпителии влагалища, стимулированном к пролиферации эстрадиолом.
Таким образом, анализируя выше приведенные литературные данные, можно сказать, что кейлоны, очевидно, участвуют в регуляции пролиферативной системы путем действия, с одной стороны, на движение клеток в митотическом цикле и, с другой стороны, на переходы клеток из резервного состояния в митотический цикл. Вопрос этот изучен, в основном, по отношению к й2-кейлонной системе. Вопрос о роли й^кейлона в механизмах формирования суточного ритма ДНК-синтезирующих клеток требует дальнейшей экспериментальной разработки. Это, в свою очередь, будет способствовать более глубокому пониманию механизмов, регуляции пролиферативных процессов в организме и повышению эффективности использования кейлонов для управления этими процессами как в норме, так и при различных нарушениях пролиферации.
3. Заключение по литературному обзору и постановка задач собственных исследований
Анализ литературных данных по регуляции ритмов пролиферативных процессов позволяет придти к выводу о многоуровневом ее характере. При этом ключевую роль играют внутритканевые механизмы, через которые осуществляется действие всех внешних и организ-менных факторов.
Среди внутритканевых регуляторов размножения клеток в по- следние годы активно исследуются тканеспецифические ингибиторы клеточной пролиферации или кейлоны.
Как физиологические эндогенные тканеспецифические регуляторы размножения клеток, кейлоны могут принимать участие в регуляции ритмических изменений пролиферативных процессов. Действительно, в последние годы установлено (А.И. Антохин, 1979,* М.В. Богое-ва, 1981), что в формировании ритма митотической активности в ас-цитной опухоли Эрлиха непосредственное участие принимает Gp-кей-лонная система путем ритмических изменений ее состояния на протяжении суток (ритм продукции Gp-кейлона и чувствительности клеток АОЭ к нему).
В то же время литературные данные об участии G.-кейлонов в регуляции ритмов пролиферативной системы отсутствуют совершенно. Хотя способность в.|-кейлона эпидермиса (Eigjo, 1974) и^-кейлона асцитной плазмоцитомы (Bichel et.ai., 1975) оказывать синхронизирующее действие на вступление клеток G.-фазы в s-фазу, а также различный ингибирующий эффект эпидермального кейлона на вступление клеток bs -фазу в зависимости от времени его введения (утреннего или вечернего), указывают на возможность участия й^кейлонов в формировании как минимум ритма числа ДНК-синтезирующих клеток.
В связи с этим конкретными задачами данного исследования являлись: выделить из экстракта асцитной опухоли Эрлиха Gt- и G„-кейлоны и охарактеризовать некоторые их свойства; изучить ритмическую организацию G..- и Gg-кейлонных систем в асцитной опухоли Эрлиха (ритмы биологической активности G..- и Gp-кейлонов и чувствительности клеток к ним); изучить зависимость суточных ритмов пролиферативных процессов в АОЭ от состояния на протяжении суток в^- и Gp-кейлонных систем этой опухоли. гесудд рстзсг::],*^ j сое | кгади 2. ІІ, .;;::,;,:
Биологические ритмы клеточного размножения и их регуляция
В современной биологии хорошо известно, что любая биологическая система имеет не только пространственную, но и временную организацию. Временная организация биологической системы - это совокупность биологических ритмов различных процессов функционирования биосистемы, взаимосвязанных друг с другом и имеющих определенные механизмы регуляции. Выяснение этих механизмов, определяющих периодичность функционирования всех систем организма и осуществляющих объединение биоритмов в единую систему временной организации, является одной из главных задач хронобиологии (Ю.А. Романов, 1976, 1978).
Временная организация присуща и такому важнейшему биологическому процессу, как клеточное размножение. Клеточное размножение в определенной ткани или органе обеспечивает постоянство их клеточного состава или тканевой гомеостаз. Оно осуществляется пролиферирующими или способными к пролиферации клетками, находящимися в резервном состоянии. Временная организация пролифератив-ных процессов выражается в существовании взаимосвязанных их биологических, ритмов, важнейшими из которых являются ритмы митотическои активности, числа ДНК-синтезирующих клеток, длительности различных периодов митотического цикла и т.д.
Большое количество исследований посвящено вопросу о суточном ритме митотическои активности. Существование суточного ритма клеточных делений в настоящее время показано для большинства органов и тканей (И.А. Алов, Н.В. Красильникова, 1962; С.С. Лагучев, 1975; Ю.А. Романов, 1977 и др.).
Для большинства исследованных нормальных тканей животных показано также существование суточного ритма числа ДНК-синтези-рующих клеток (И.А. Алов, Н.В. Красильникова, 1962; Л.Н. Иванова, 1969; Ю.А. Романов, 1969; С.Г. Мамонтов, 1977; СМ. Кузин, 1980; Scheving, Pauly, 1967; Sigdestad et al., 1969; Pedersson, Hamilton, 1970).
Существуют также многочисленные, хотя и весьма противоречивые данные о ритмических колебаниях на протяжении суток длительности митоза (Ю.А. Романов, В.П. Рыбаков, 1970, 1971; С.Г. Мамонтов, В.В. Синелыцикова, 1977; Kreyberg et.al., 1965; Gyergyay-Malatinsky, Gyergyay, 1967; Clausen et al.» 1979) И S-периода (Ю.А. Романов, Т.В.Савченко, 1979; Twermyr, 1972; Miller et al., 1978; Clausen et al., 1979).
В настоящее время накоплен обширный фактический материал, который свидетельствует о том, что временная организация клеточного размножения характерна для всех уровней биологической организации: растений (В.П. Рыбаков и соавт., 1972; Olszewska, 1977), простейших (Edmunds, 1977), многоклеточных животных (Й.А. Алов, 1975; Ю.А. Романов, 1969, 1977; Scheving et al., 1978). Причем показано, что ритмические изменения процессов репродукции клеток существуют не только in vivo, но и в клеточных системах in Vitro (Е.Н. Никифорова, Г.С. Катинас, 1974; Т.Н. Ивченко, 1977; М.В. Богоева, 1981). Таким образом, из приведенных литературных данных видно, что биологические ритмы в системе размножения клеток, т.е. временная организация этой системы - явление универсальное.
Временная организация размножения клеток имеет сложную многоуровневую регуляцию (Ю.А. Романов, В.П. Рыбаков, 1973). На биологические ритмы размножения клеток, а также на их взаимосвязь, оказывают, влияние как экзогенные, так и эндогенные факторы.
Наиболее важными экзогенными факторами (внешние датчики времени по Ю. Ашофф, 1964), влияющими на временную организацию размножения клеток, являются фотопериод (Ю. Ашофф, 1964; Ю.А. Романов и соавт., 1979а, СМ. Кузин, 1980; G.C. Филиппович, 1980; Aschoff, Pohl, 1978), периодические изменения температуры (Б. Брюс, 1964; Ю.Д. Чугунов, Е.В. Кузнецов, 1974), давления (ф. Браун, 1964), магнитного поля (Brown, Scow, 1978). Для лабораторных животных большое значение имеет режим кормления (Edmands, Adler, 1977; Schulte-Hermann, Dbrffier, 1979). Для человека существенно повышается значение социальной синхронизации биоритмов (Vernikos Dannelis» Winget, 1979).
Объект исследования
Настоящее исследование выполнено на 850 белых беспородных мышах-самцах одного возраста (1,5-2 месяца), массой 18-20 г. До начала эксперимента животных в течение двух недель адаптировали к условиям светового режима (С:Т = 12:12, свет с б до 18 час суток) и содержания (температура 23С, пищевой режим ad libitum). Этот режим соблюдался на протяжении всех экспериментов.
Объектом изучения служил диплоидный штамм асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ). Опухоль получали в Институте экспериментальной и клинической Онкологии АМН СССР и поддерживали путем внутрибрюшин-ных инъекций через каждые 7 суток 1,5-2,0 10 опухолевых клеток в 0,5 мл асцитической жидкости, разведенной средой 199. При таком количестве клеток, введенных внутрибрюшинно, наблюдалась 100$ перевиваемость опухоли. Штамм был адаптирован к условиям культивирования in vivo и in vitro. Часть исследований была проведена на суспензионной кратковременной культуре клеток АОЭ. В экспериментах in vivo и in vitro использовали опухоль на 5-6 день ее развития (экспоненциальная фаза роста), кейлонсодержащий препарат получали от животных либо с 13-дневной опухолью (фаза плато), либо с 5-дневной опухолью.
Выбор АОЭ для исследования определялся прежде всего изученностью основных параметров кинетики роста опухоли и возможностью получения из данного штамма кейлонсодержащего препарата. Как отмечалось в литературном обзоре, для АОЭ известно участие кейлон-ного механизма в формировании суточного ритма митотической активности (А.И. Антохин, 1979; М.В. Богоева, 1981). В то же время ритм числа ДНК-синтезирующих клеток в этой опухоли отсутствует (А.й. Антохин, 1979). Учитывая данные о существовании в этой опухоли в.-кейлона и вышеизложенные факты, данная модель является весьма перспективной в смысле выяснения роли G.J- и о2-кейлонных систем в формировании ритма числа ДНК-синтезирующих и делящихся клеток.
С целью проверки тканевой специфичности действия экстракта асцитной опухоли Эрлиха использовали асцитную гепатому Новикова 22А. Штамм получали в Институте экспериментальной и клинической Онкологии АМН СССР и перевивали аналогичным образом мышам линии СЗНА.
Зависимость действия цитоплазматической и ядерной фракций клеток АОЗ на митотическую активность в ней in vitro от дозы фракций
Из представленных данных видно, что через І час после введения в культуру клеток АОЭ все дозы цитоплазматической фракции клеток АОЭ достоверно снижают митотический индекс: доза 0,5 мл -на 37% , 0,1 мл - на 19%, 0,1 мл в разведении І/ІО - на 12%. При этом существует прямая зависимость эффекта от дозы, хотя при действии двух последних доз эта разница недостоверна (Р=0,2).
Через 2 часа после введения всех доз цитоплазматической фракции митотическая активность в суспензионной культуре клеток АОЭ превышает значения в контроле. Это повышение МИ также совершенно определенным образом зависит от дозы. Доза 0,5 мл, вызвавшая через I час наибольшую ингибицию митозов, через 2 часа привела к значительному повышению МЫ (на 50%); 0,1 мл - на 32%, 0,і мл в разведении 1/10 - всего лишь на 3%.
Через 3 часа после начала опыта доза 0,5 мл цитоплазматической фракции вызвала повторную ингибицию митотическои активности на 20% (Рк/0,001). После действия двух других доз МИ оставался повышенным (на 23% и 10%), причем разница с контролем статистически достоверна. К 4 часу опыта значения МИ после действия различных доз цитоплазматической фракции начинают возвращаться к контрольному уровню, хотя не сравниваются с ним.
Ядерная фракция клеток АОЭ приводит к резкой стимуляции ми-тотической активности, которая наблюдается уже через I час после введения доз 0,5 и 0,1 мл (Рк = 0,02 и 0,05 соответственно) и достигает максимального значения через 2 часа после начала опыта. При этом МИ увеличивается на 93%, 48% и 25% при введении различных доз (0,5 мл, 0,1 мл и 0,1 мл в разведении 1/10 соответственно). К- 3-4 часу опыта митотическая активность начинает возвращаться к контрольному уровню. Таким образом, цитоплазматическая фракция клеток АОЭ содержит ингибитор митотической активности, эффект которого зависит от дозы; ядерная фракция - стимулятор деления клеток, действие которого также доззависимо.
