Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Неокортекс как высший интегративный центр мозга 9 - 10
1.2. Структура неокортекса 10 - 14
1.3. Гистогенез неокортекса у грызунов 14 - 25
1.4. Морфологическое изучение действия белково-энергетической недостаточности на кору головного мозга 25 - 36
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕЩОВАНИЯ
2.1. Объект исследования 37
2.2. Модель создания белково-энергетической недостаточности 37 - 39
2.3. Схема постановки экспериментов 40-42
2.4. Методы исследования 42 - 49
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава III. ИЗУЧЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГИСТОГЕНЕЗА НЕОКОРТЕКСА МЫШЕЙ В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ПРЕНАТАЛЬНОЙ БЕЛКОВО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
3.1. Постановка эксперимента 50 - 52
3.2. Результаты экперимента 52 - 62
3.8. Обсуждение полученных результатов 62 - 75
3.4. Заключение 75 - 77
Глава ІV. ИЗУЧЕНИЕ ГИСТОСТРУКІУРН НЕОКОРТЕКСА МШЕЙ В ПОСТ-НАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД РАЗВИТИЯ В НОРМЕ И ПРИ ДЕЙСТВИИ БЕЛКОВО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
4.1. Постановка эксперимента 78 - 79
4.2. Результаты эксперимента 79 - 91
4.3. Обсуждение полученных результатов 91 - III
4.4. Заключение III - 112
Глава V. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ РЕАБИЛИТАЦИЙ ИЗМЕНЕНИЙ
ГИСТОСТРУКТУРЫ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА МШЕЙ ПОСЛЕ НЕДОСТАТОЧНОГО ПИТАНИЯ В РАННИЙ ПОСТНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД
5.1. Постановка эксперимента ИЗ - 114
5.2. Результаты эксперимента 114 - 124
5.3. Обсуждение полученных результатов 124 - 134
5.4. Заключение 134 - 135
Глава VІ. ДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
НА ГИСТОСТРУКТУРУ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА ВЗРОСЛЫХ МЫШЕЙ
6.1. Постановка эксперимента 136
6.2. Результаты эксперимента 136 - 139
6.3. Обсуждение полученных результатов 139 - 142
6.4. Заключение 142
Глава VII. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 143 - 150
ВЫВОДЫ 151 - 152
ПРИЛОЖЕНИЯ
I. Таблицы 154 - 175
П. Иллюстрации 176 - 208
Ш. Методики 209 - 212
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 213 - 241
- Неокортекс как высший интегративный центр мозга
- Модель создания белково-энергетической недостаточности
- Постановка эксперимента
- Результаты эксперимента
- Обсуждение полученных результатов
Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из важнейших проблем нейробиологии, имеющей непосредственное практическое значение, является проблема влияния факторов внешней среды на реализацию генетической программы морфофункционального развития мозга. Познание характера и механизмов ранних влияний среды может служить научным обоснованием для разработки рекомендаций по направленному воздействию на центральную нервную систему с целью изменения в благоприятную сторону таких жизненно важных процессов, как адаптация к среде, компенсация нарушенных функций, обучение.
Общеизвестно, что головной мозг обладает повышенной чувствительностью к условиям внешней среды. Это связано, в значительной степени, с особенностями формирования клеточных популяций мозга. Так, цитогенез нейронов протекает и завершается в течение короткого периода эмбрионального развития, в дальнейшем популяция нейронов остается статичной . Несмотря на то, что период глиоцитогенеза более растянут во времени, и предшественники глиальных клеток сохраняют способность к пролиферации даже во взрослом организме, основная масса глиоцитов также образуется в результате ранней и активной пролиферации (К.Ю.Резников, 1981 и др.). Клеточные популяции мозга достигают своей окончательной численности быстрее, чем в большинстве других органов. Поэтому повреждающие факторы среды, действующие в период быстрого роста, могут вызывать ряд серьезных, а возможно, и необратимых нарушений в сложных морфогенетических процессах, происходящих в этот период в головном мозге.
Наряду с этим, мозг характеризуется высокой интенсивностью обменных процессов и повышенными энергетическими затратами во все периоды онтогенеза, что определяет его особую уязвимость к действию неблагоприятных факторов среды.
Количественные и качественные нарушения питания являются одними из наиболее широко распространенных и существенных факторов среды, влияющих на развитие мозга. Так, по оценкам ВОЗ число людей, систематически не получающих достаточного количества пищи, достигает в настоящее время I млрд человек ("Продовольственная проблема в современном мире", М., 1983). При этом, наиболее распространенной формой недостаточного питания является белково-энергетическая недостаточность. Более 30$ детей развивающихся стран страдают тяжелыми и средней тяжести формами белково-энергетической недостаточности ( J. Waterlow, 1979; P.Udani, 1979). В развитых странах мира даже при отсутствии продовольственных проблем, нередко отмечаются случаи внутриутробного нарушения питания плода как следствие различных заболеваний матери ( M.winick, 1970).
Интенсивное изучение воздействия недостаточного питания на центральную нервную систему ведется во многих лабораториях разных стран мира. Особое внимание, как объект исследования, привлекает кора головного мозга млекопитающих в связи с ведущей ролью в осуществлении интегративной деятельности мозга. Однако, многие аспекты действия алиментарной недостаточности на развитие структуры неокортекса до сих пор остаются неизученными.
Настоящая работа является частью научного направления по изучению влияния белково-энергетической недостаточности на развитие мозга млекопитающих, которое включено в коорди- национный план научно-исследовательских работ отделения общей биологии АН СССР на І98І-Ї985 гг. по проблеме "Закономерности индивидуального развития животных и человека" (тема 2.33.4.5.II), в комплексную программу научных исследований АН CGCP и АМН СССР "Фундаментальные науки - медицине" (тема 07.07.05) и в координационный план НИР Секции здравоохранения НТС М/инвуза СССР на І98І-І985 гг. (темы І.І.5 и І.І.7). Цель и задачи исследования. Основной целью работы явилось изучение формирования гистоструктуры коры головного мозга мышей в норме и в условиях воздействия на организм белково-энергетической недостаточности. Исходя из этой общей цели, в работе были поставлены следующие задачи: изучение закономерностей гистогенеза коры головного мозга мышей в эмбриональном и раннем постнатальном периоде развития; изучение особенностей гистогенеза неокортекса мышей в условиях пренатальной алиментарной недостаточности; изучение особенностей формирования гистоструктуры коры головного мозга мышей при недостаточном питании в постнатальный период развития;
Оценка степени обратимости и возможности фармакологической коррекции нарушений развития коры головного мозга, возникающих под влиянием малобелкового питания;
Изучение гистоструктуры коры головного мозга взрослых мышей, подвергнутых действию белково-энергетической недостаточности.
Научная новизна. В работе впервые получены данные о гистологическом строении, параметрах щшиферативной активности и гибели клеток в зачатке конечного мозга 17-дневных эмбрионов мыши и установлено, что в условиях пренатальной алиментарной недостаточности процессы гистогенеза неокортек-са замедляются. Отмечено, что основным механизмом регуляции величины клеточной продукции в вентрикулярной герминативной зоне мозга в период активного нейроногенеза является изменение скорости клеточной пролиферации. Изучены процессы клеточной пролиферации в субэпендимной зоне головного мозга 20-дневных мышей и обнаружено, что в период постнатального глиоцитогенеза уровень клеточной продукции в субэпендимной герминативной зоне зависит от величины постмитотической гибели клеток. Показано, что малобелковое питание ингибирует глиоцитогенез, приводит к нарушению процессов дифференциров-ки олигодендроглии и к уменьшению числа олигодендроцитов в коре головного мозга мышей. Новым в работе является также количественная оценка реактивных изменений нейронов и нейро-но-глиальных соотношений в неокортексе интактных и недоедавших мышей. Одновременно с этим, определены возможности реабилитации изменений гистоструктуры неокортекса, возникающих под действием недостаточного питания, и выявлен положительный эффект применения препарата карнитин в сочетании с полноценным питанием для восстановления нормальной гистоструктуры коры головного мозга. Впервые получены данные о действии белково-энергетической недостаточности на гистоструктуру коры головного мозга у взрослых животных.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявленные в данном исследовании закономерности нормального гистогенеза неокортекса и особенности формирования гистоструктуры коры головного мозга мышей в условиях белково-энергетической недостаточности вносят вклад в разработку теоретических проблем биологии развития, и в частности, изучения влияния факторов внешней среды на реализацию генети- ческой программы развития мозга.
Кроме того, проведенное в работе экспериментальное исследование механизмов действия белково-энергетической недостаточности может представлять интерес для решения ряда практических задач медицины. Так, полученные в работе данные по пищевой реабилитации и пищевой реабилитации в сочетании с карнитином должны быть учтены в комплексных программах лечения детей, перенесших белково-энергетическую недостаточность.
Внедрение. Материалы диссертации вошли в отчет, выполненный по заданию Государственного Комитета Совета Министров СССР по науке и технике "Разработка рекомендаций по фармакологической коррекции нарушений развития мозга при белково-энергетической недостаточности" (Постановление ГКНТ СССР от 31 июля 1979 года № 338).
Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на заседании секции цитологии, гистологии и эмбриологии Московского общества испытателей природы (Москва, 1980); на УІ Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981); на Ш Всесоюзном симпозиуме "Физиологические и клинические проблемы адаптации к гипоксии, гиподинамии и гипертермии" (Москва, 1981); на научных конференциях Центральной научно-исследовательской лаборатории медицинского факультета Университета дружбы народов имени П.Лумумбы (1981, 1983).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Диссертация выполнена в отделе световой и элетронной микроскопии Центральной научно-исследовательской лаборатории медицинского факультета Университета дружбы народов имени Патриса Лумумбы.
Неокортекс как высший интегративный центр мозга
Неокортекс, часть головного мозга, развившаяся на поздних этапах эволюции животного мира, играет исключительно важную роль в осуществлении высшей нервной деятельности.
Благодаря двусторонним связям с нижележащими отделами нервной системы, кора может участвовать в регуляции и координации всех функций организма, обеспечивая наиболее адекватное индивидуальное приспособление к меняющимся условиям среды (О.С.Адрианов, 1978; П.К.Анохин, 1968; А.С.Батуев, 1981). На корковые нейроны возможна конвергенция импульсов от различных органов чувств. Подобная конвергенция разнородных возбуждений - нейрофизиологический механизм интегратив-ной деятельности головного мозга. Кора больших полушарий способна производить синтез многочисленных и различных по функциональному качеству афферентных воздействий и после этого формировать приспособительный поведенческий акт, соответствующий данной ситуации (П.К.Анохин, 1968).
Корковые структуры играют первостепенную роль в обучении животных и человека. Сложные условные рефлексы, лежащие в основе целостных актов поведения, требуют сохранности корковых структур и участия не только первичных зон корковых концов анализаторов, но и ассоциативных третичных зон, впервые на эволюционной лестнице появляющихся у грызунов. Корковые структуры имеют прямое отношение и к механизмам памяти.
Основной тип прямых и обратных связей новой коры - вертикальные пучки волокон, приносящие информацию из подкорковых структур к коре и посылающие ее от коры в эти же подкорковые образования. Другой тип корковых связей - горизонтальные пучки ассоциативных волокон, проходящих на различных уровнях коры и в белом веществе, обеспечивают обмен информации между участками коры (T.Wooisey, 1978 и др.).
Модель создания белково-энергетической недостаточности
Существуют различные варианты создания экспериментальной модели алиментарной недостаточности (см. раздел 1.4). Для данной работы была выбрана модель белково-энергетической недостаточности, заключающаяся в кормлении животных неполноценной, малобелковой диетой. Эта модель, по нашему мнению, имеет ряд преимуществ в сравнении с другими методами, так как она, во-первых, применима ко всем периодам жизни животного: эмбриональному, раннему и позднему постнатальному; во-вторых, в этом случае недоедание "дозировано", точно определено содержание белка и других питательных веществ, поэтому данную модель легко воспроизвести в разных сериях эксперимента. Кроме того, при использовании этой модели сохраняются нормальные условия кормления животных, не вызывается острых стрессовых реакций, не требуется хирургических вмешательств. Наконец, условия эксперимента наиболее близки к реальной жизни, так как в этом случае недоедание выражается не столько в недостатке пиши, сколько в неполноценном составе, т.е. прежде всего в недостатке животного белка.
В эмбриональный период жизни недостаточное питание плодов создается посредством кормления беременной самки малобелковой диетой.
В сосунковый период молодые животные недоедают при кормлении лактирующей самки неполноценной диетой. Как показано S.Miller (1970), недостаточное питание лактирующей самки приводит к уменьшению количества молока, хотя и не влияет на его состав. Согласно b.Crnic и H.Chase (1978), пищевой статус лактирующих самок снижается только при методах:
1) содержание лактирующих самок на малобелковых рационах;
2) уменьшение количества корма, дававшегося лактирующим самкам на 40-50$ контроля. R. Wiggins (1979) проводил сравнение моделей пищевой депривации в раннем постнатальном онтогенезе и пришел к выводу, что наиболее резкое замедление ми-елинизации и роста веса тела и мозга наблюдается при нарушении питания, лактирующих самок. C.Leuba и Т. Eabinowicz (1979 а, Ъ), напротив, заключили, что режим пищевой депривации, применяемый к самкам, менее существенно сказывался на морфологии коры мозга потомства, чем недостаточное питание самих детенышей при ежедневной отсадке, что связывают с возникающим при этом стрессовым состоянием (A.SLob et al., 1973), оказывающим отрицательный эффект на гормон роста (C.Kuhn et al., 1978). Метод увеличения числа сосунков у кормящих матерей также имеет существенные недостатки, так как при этом растет секреция молока.в связи с более интенсивным раздражением при сосании (J.Edwardson, J.Eayrs, 1967). Некоторые матери способны полноценно вскормить большее, чем обычно, потомство, а кроме того, в связи с естественным соперничеством более сильные животные могут получать достаточное питание, а более слабые - погибнуть.
Постановка эксперимента
Работа, как и в других сериях эксперимента, проводилась на мышах линии СВА»
На основании анализа влагалищных мазков отбирали самок, находящихся в фазе проэструса (Л.М.Кабак, 1968). В конце дня самок подсаживали к самцам (5 $ : 2о ). Наличие влагалищной пробки на утро следующего дня свидетельствовало о начале беременности. От этого дня начинался отсчет дней эмбрионального развития.
Беременных самок отсаживали и с 1-го дня беременности переводили на кормление контрольной или опытной синтетической диетой. На 17-й день беременности в утренние часы самкам вводили внутрибрюшинно 3Н-тимидин. Животных забивали путем декапитации через I, 2, 4, 6, 8, 12, 16 и 24 часа после введения изотопа. Извлекали эмбрионы, головки плодов фиксировали в жидкости Карнуа. После стандартной проводки головки эмбрионов ориентировали и заливали в парафин.
Полученный материал резали фронтально, серийные срезы делали толщиной 6 мкм. Отбирали стекла со срезами, прошедшими через зачаток конечного мозга в области каудальнее зачатка глаза. После обычных радиоавтографических процедур на автографах изучали структуру, параметры клеточной пролиферации и клеточной гибели в стенке мозгового пузыря. Все измерения и подсчеты велись в строго определенном - дорзально-датераль-ном участке стенки бокового желудочка эмбрионального мозга (рис.3).
В целом, в данной серии эксперимента изучен материал, полученный от 23 эмбрионов из опытной и 21 эмбриона из контрольной групп.
Толщину отдельных зон стенки мозга измеряли с помощью окуляр-микрометра. Измерения проводили на несмежных срезах у каждого эмбриона, зафиксированных на сроках от I до 12 часов после введения изотопа, то есть у эмбрионов только 17 дня эмбрионального развития.
В вентрикулярной зоне у каждого эмбриона на всех сроках эксперимента подсчитывали: митотический индекс, процент меченых митозов, пикнотический индекс.
У эмбрионов, зафиксированных через 1-2 часа после введения изотопа, подсчитывали индекс меченых ядер в вентрикулярной зоне.
Строили кривые меченых митозов для контрольной и опытной групп животных. Графическим методом проводили расчет параметров генерационного цикла вентрикулярных клеток. Рассчитывали теоретическую величину пролиферативного пула и времени клеточного удвоения.
В субвентрикулярной зоне у всех эмбрионов велся подсчет митотического и пикнотического индексов.
В остальных зонах зачатка конечного мозга: промежуточной зоне, корковой пластине и краевой зоне, - анализировалось наличие меченых ядер, пикнотических ядер, особенности морфологии клеток, составляющих данные зоны.
Результаты эксперимента
Изучали субэпендимную зону боковых желудочков головного мозга на фронтальных срезах, прошедших на уровне зрительного перекреста, то есть в области переднего рога бокового желудочка (рис. 12).
К 20 дню постнатальной жизни субэпендимный слой переднего рога боковых желудочков хорошо развит и образует клеточные пласты, прилегающие к эпендиме крыши и латеральной стенки боковых желудочков. Субэпендимная зона распространяется также книзу от желудочка в виде вертикального тяжа клеток. Ядра субэпендимных клеток лежат в 4-5 рядов. Основная масса ядер имеет небольшой размер, неправильную угловатую форму, темно окрашена. Встречаются клетки с более крупными, светлыми ядрами. Цитоплазма субэпендимных клеток выражена слабо.
В пределах субэпендимного слоя нередко наблюдаются ми-тотические фигуры. Митозы расположены в разных рядах клеток, веретено деления не имеет определенной ориентации. Митоти-ческий индекс, подсчитанный в субэпендимной зоне 20-дневных контрольных мышей, ниже, чем индекс митозов в матричных зонах эмбрионального мозга, и составляет в среднем 0,76%.
В субэпендимной слое мозга мышей в норме обнаруживаются клетки с пикнотическими ядрами. Индекс пикнотических ядер у интактных животных, которым не вводился 3Н-тимидин, составляет 0,36%. У контрольных мышей значение пикнотического индекса не зависело от сроков после введения изотопа и по своей величине не отличалось от показателя у интактных животных - 0,40% (табл.- 7, рис. 13). Иногда наблюдались попарно расположенные пикнотические ядра. В целом уровень пикнозов в субэпендимной зоне значительно выше - в 4,4 раза - чем в субвентрикулярной зоне эмбрионального мозга, от которого субэпендимная зона происходит. Анализ распределения пикноти-ческих ядер, включивших 3Н-тимидин, показывает, что первые меченые пикнотические ядра появляются через 4 часа после инъекции 3Н-тимидина, число их нарастает и достигает максимума спустя 16 часов после введения изотопа (рис. 14).
Индекс меченых ядер в субэпендимной зоне у контрольных животных, зафиксированных не позже, чем через 2 часа после введения изотопа, составляет 10,8%.
class5 ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ РЕАБИЛИТАЦИЙ ИЗМЕНЕНИЙ
ГИСТОСТРУКТУРЫ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА МШЕЙ ПОСЛЕ НЕДОСТАТОЧНОГО ПИТАНИЯ В РАННИЙ ПОСТНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД class5
Обсуждение полученных результатов
Как было показано в главе 4, последствиями алиментарной недостаточности в период с 10 по 40 день жизни являются такие изменения в гистоструктуре неокортекса мышей как редукция размеров тел и отростков нейронов, усиление дистрофических процессов в виде хроматолиза, уменьшение численности олигодендроцитов, снижение зрелых форм глиальных клеток, сокращение количества перинейрональной глии.
G целью решения вопроса об обратимости отмеченных морфологических изменений в коре головного мозга был проведен эксперимент по пищевой реабилитации недоедавших мышей. Реабилитация осуществлялась путем кормления мышей полноценной диетой, длительность периода реабилитации составляла месяц, с 40-го по 70-й день жизни.
В этот период, как показывает сравнение соответствующих показателей среди 40-дневных и 70-дневных мышей, процессы . роста и дифференцировки не закончены Продолжается прибавка массы тела, но масса мозга в этот период существенно не увеличивается. В коре головного мозга не завершен рост тел нейронов: хотя объем ядер остается стабильным, происходит нарастание объема цитоплазмы, в результате чего, от 40-го к 70-му дню жизни ядерно-цитоплазматическое отношение в нервных клетках снижается. Происходит дальнейшее развитие нейро-пиля, о чем свидетельствует некоторое увеличение доли объема неокортекса, занятого нейропилем, а также снижение плотности расположения нервных клеток на полутонких срезах.
Сравнение морфометрических показателей, характерных для 40-дневных мышей, содержавшихся на малобелковом рационе, с аналогичными показателями у мышей после периода реабилитации, свидетельствует о том, что в результате полноценного питания наблюдаются высокие темпы роста структурных элементов неокортекса, отстававших в своем развитии после месячного недодеания. У животных за месяц проведения пищевой реабилитации резко возрастает вес тела и мозга, растет толщина коры головного мозга. Значительно увеличивается объем тел крупных нейронов за счет прироста объема цитоплазмы, что находит отражение в изменении ядерно-цитоплазматического отношения. Возрастает относительный объем неокортекса, занятый нейропилем, и уменьшается плотность расположения нейронов на срезе, что подтверждает ускоренный рост отростков нейронов.
При сравнении морфологических параметров развития нео-кортекса у 70-дневных мышей из группы "пищевая реабилитация" с соответствующими показателями 70-дневных контрольных мышей оказывается, что полноценная диета, применяемая в течение месяца после перенесенного недоедания, приводит к восстановлению нормального веса мозга, толщины коры головного мозга, размеров тел нервных клеток.
