Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
1.1 Актуальность исследования 6
1.2. Цель и задачи работы 11
1.3. Научная новизна работы 11
1.4. Научно-практическое значение работы 12
2. Обзор литературы 14
2.1. Введение 14
2.2. Современные представления о механизмах памяти 15
2.3. Данные, противоречащие интерпретации экспериментально вызванных амнезий как нарушений формирования и хранения памяти 23
2.4. Альтернативные гипотезы о механизмах формирования и поддержания долговременной памяти 24
2.4.1. Исследования неирогенеза в мозге птиц и млекопитающих, как возможного механизма долговременной пластичности 25
2.4.2. Исследования участия синтеза ДНК в формировании долговременной памяти 33
2.4.2.1. Амнестические эффекты ингибиторов синтеза ДНК и нуклеотидных аналогов, обладающих антиметаболитными свойствами 33
2.4.2.2. Исследования индукции синтеза ДНК в мозге под влиянием обучения 36
2.4.2.3. Исследования «метаболической ДНК» 38
2.4.2.4. Обратная транскрипция как возможный механизм поддержания долговременной памяти 40
2.4.2.5. Негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ) как возможный механизм долговременной памяти 41
2.4.3. Модификации гистонов и ДНК как возможные механизмы поддержания долговременной памяти 43
2.5. Влияние галогенизированных нуклеотидных аналогов 5'-йодо-2'- дезоксиуридина (Idil) и 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU) на клеточные функции 46
2.6. Раннєє обучение у цыплят и процессы системогенеза 49
2.6.1. Раннее пищевое обучение у цыплят 50
2.6.2. Пассивное избегание м вкусовая аверсия -экспериментальные модели обучения у цыплят,
основанные на пищевой функциональной системе 52
2.6.3. Импринтинг и функциональная система следования за матерью 53
2.7. Резюме и экспериментальные задачи
настоящей работы 55
3. Методика 57
3.1. Объект исследования 57
3.2. Вводимые вещества и способы инъекций 57
3.3. Исследование амнестического действия нуклеотидных аналогов 57
3.3.1. Обучение в модели импринтинга 57
3.3.2. Пространственное обучение в лабиринте 59
3.3.3. Обучение в модели вкусовой аверсии 59
3.3.4. Обучение в модели пассивного избегания 60
3.4. Иммуногистохимическое выявление клеток, включивших 5'-бромо-2'-
дезоксиуридин при обучении 60
3.4.1. Исследование включения BrdU при обучении 60
3.4.1.1. Вкусовая аверсия 60
3.4.1.2. Импринтинг 62
3.4.2. Иммуногистохимическая детекция включения BrdU
клетками мозга 62
3.4.3. Обработка иммуногистохимических данных 64
3.5. Статистическая обработка данных 64
4. Результаты '. 65
4.1. Влияние «антиметаболитов» и ингибиторов синтеза ДНК на формирование долговременной памяти у цыплят при обучении в различных моделях 65
4.1.1. Влияние 5'-йодо-2'-дезоксиуридина на формирование памяти при обучении в различных моделях 65
4.1.1. а) Импринтинг 65
4.1.1. б) Пространственное обучение в лабиринте 67
4.1.1. в) Вкусовая аверсия 68
4.1.1. г) Пассивное избегание 72
4.12. Влияние препаратов, действие которых направлено на нарушение синтеза ДНК или её последующей репликации / транскрипции, на формирование памяти при обучении вкусовой аверсии 73
4.1.2. а) Амнестические эффекты 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU)
при обучении цыплят вкусовой аверсии 73
4.1.2. б) Амнестические эффекты субстратных ингибиторов синтеза ДНК при обучении цыплят вкусовой аверсии 74
4.2. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU) в ДНК клеток мозга цыплят 76
4.2.1. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU) в ДНК клетками мозга, измеренное через 2 ч после обучения 78
4.2.2. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU) в ДНК клеток мозга, измеренное через 24 ч после обучения 85
4.2.3. Качественный анализ фенотипа клеток IMM, включивших BrdU через 2 ч после обучения 90
4.2.4. Влияние импринтинга на включение 5'-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU) в ДНК клетками мозга через 2 ч после обучения 92
5. Обсуждение 94
5.1. Влияние «антиметаболитов» и ингибиторов синтеза ДНК на формирование памяти у цыплят при обучении в различных моделях 94
5.2. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение BrdU в ДНК клеток мозга цыплят через 2 ч после обучения 103
5.3. Влияние обучения вкусовой аверсии на включение BrdU в ДНК клеток мозга цыплят через 24 ч после обучения 108
5.4. Влияние импринтинга на включение BrdU в ДНК
клеток мозга цыплят через 2ч после обучения 114
5.5. Заключение 115
6. Выводы 117
7. Список литературы 118
- Современные представления о механизмах памяти
- Исследования неирогенеза в мозге птиц и млекопитающих, как возможного механизма долговременной пластичности
- Вводимые вещества и способы инъекций
- Влияние «антиметаболитов» и ингибиторов синтеза ДНК на формирование долговременной памяти у цыплят при обучении в различных моделях
Введение к работе
Актуальность исследования
Современные представления о молекулярно-биологических механизмах обучения и памяти основаны на положении о кратковременной и долговременной формах хранения информации в мозге. В основе этой теории лежит открытие Г.Мюллера и А.Пильзекера, обнаруживщих в 1900 г., что переход из кратковременной и легко нарушаемой памяти в долговременную устойчивую память происходит у человека в течение первого часа после получения им новой информации. Они назвали этот процесс консолидацией памяти (Muller, Pilzecker, 1900). Однако существующие в настоящее время критерии для определения принадлежности памяти к кратковременной или долговременной по «временному» признаку достаточно расплывчаты. По мнению одних исследователей, к кратковременной следует относить память, которая удерживается от нескольких секунд до нескольких часов, а к долговременной -память, которая сохраняется от нескольких часов до нескольких дней, после чего переходит в постоянное хранение. Согласно другим представлениям, кратковременной считают память, которая удерживается в течение нескольких секунд, долговременной - память, которая сохраняется от нескольких секунд до нескольких лет (Александров, 2000).
Основным шагом в понимании биологических механизмов консолидации памяти стало открытие 1960-х гг., показавшее, что переход памяти из кратковременной в долговременную форму требует синтеза новых молекул РНК и белка, т.е. экспрессии генов (Davis, Squire, 1984). Современные представления о молекулярных механизмах формирования долговременной памяти основаны на концепции о зависящей от синтеза белка консолидации памяти, согласно которой приобретение нового опыта сопровождается индукцией синтеза белка в мозге, в том числе экспрессией так называемых «ранних генов» (Анохин, 1997; Clayton, 2000; Guzowski, 2002). Результатом этого процесса является экспрессия широкого спектра новых белков и последующие структурные изменения определенных синаптических контактов между клетками (Rose, 1995; Анохин, 1997; Kandel, Pittenger, 1999; Isquierdo et al., 2006).
Однако в отличие от механизмов формирования долговременной памяти, которые считаются к настоящему времени во многом раскрытыми, механизмы длительного поддержания долговременной памяти все еще остаются неясными (Kandel, Pittenger, 1999). В частности, остается неясным, каким образом в нервных клетках в течение длительного времени сохраняется информация о произошедших при обучении синоптических перестройках, тогда как это время может во много раз превышать время жизни отдельных белковых молекул.
Экспериментальные данные последних лет предполагают, что одним из возможных молекулярных механизмов сохранения вызванных обучением долговременных изменений в нервных клетках может быть реорганизация хроматина и изменение статуса метилирования генов (Weaver et al., 2004; Levenson et al., 2004; Miller, Sweatt, 2007). В то же время, имеются данные, свидетельствующие о том, что механизмы длительного хранения памяти могут вовлекать синтез ДНК. Так, рядом авторов было показано, что обучение может индуцировать в мозге синтез ДНК (Reinis, 1972; Ашапкин и др. 1981, 1983; Giuditta et al, 1986а). Кроме того, в экспериментах с нарушениями памяти ингибиторами синтеза белка и ДНК были получены данные, которые не находят объяснения в теории консолидации памяти. Во-первых, было показано, что память, которая была нарушена блокадой синтеза белка при обучении, может восстанавливаться спонтанно, либо под действием процедуры напоминания или физиологически активных веществ (Quartermain 1970; Squire, Barondes, 1972; Quartermain, Botwinik, 1975; Радюшкин, Анохин, 1997). Во-вторых, было продемонстрировано амнестическое действие ингибиторов синтеза ДНК и антиметаболитов при их введении животным в период около обучения (Reinis, 1972; Анохин с соавт., 1988; Wang et al., 2003). В совокупности, эти данные позволяют предположить, что в мозге могут существовать дополнительные механизмы формирования и поддержания долговременной памяти, вовлекающие синтез ДНК.
Для проверки гипотезы о механизмах памяти, требующих синтеза ДНК, необходимы экспериментальные свидетельства того, что (1) консолидация памяти сопровождается синтезом ДНК в мозге и (2) обнаруженный синтез ДНК критически необходим для формирования или поддержания долговременной памяти. Также принципиальным является вопрос о том, насколько универсален такой механизм, т.е. в какой степени он участвует в формировании/поддержании различных видов памяти.
Известные к настоящему времени данные о синтезе ДНК при обучении достаточно противоречивы и не дают основания для заключения, что обнаруженный авторами синтез ДНК действительно необходим для формирования памяти (Reinis et al., 1972; Guiditta et al., 1986b). Кроме того, в этих работах преимущественно использовали количественный анализ радиоактивного мечения синтезированной ДНК в гомогенатах мозга - недостаточно точный метод, использование которого не позволяет выявить конкретные структуры мозга и клетки, в которых обучение может вызвать синтез ДНК.
В то же время, результаты исследований амнезий, вызванных блокадой синтеза ДНК в определенных моделях обучения, не дают ответа на вопрос, действительно ли данный вид обучения, чувствительный к действию ингибиторов синтеза ДНК, индуцирует в мозге синтез ДНК (Анохин с соавт., 1988; Wang et al., 2003). Также остается неясным, насколько чувствительны другие виды памяти (при обучении в других моделях) к действию ингибиторов синтеза ДНК.
Настоящая работа объединяет эти два прежде разрозненных направления - исследование нарушений памяти, вызванных блокадой синтеза ДНК, и изучение индукции синтеза ДНК в мозге обучением. Это стало возможным благодаря методу иммуногистохимического мечения на срезах мозга клеток, ДНК которых содержит нуклеотидный аналог 5 -бромо-2 -дезоксиуридин (BrdU). BrdU и близкий ему по структуре и функциям 5 -йодо-2 -дезоксиуридин (IdU) являются аналогами тимина и могут встраиваться в ДНК в процессе удлинения её цепи. При этом они изменяют свойства новой ДНК таким образом, что нарушаются её основные функции - репликация, транскрипция и связывание с белками (Morris, Cramer, 1968; Goz, 1978).
BrdU и IdU влияют на функции только той ДНК, которая синтезируется в их присутствии. Поэтому, с одной стороны, введение IdU или BrdU в период около обучения позволяет детектировать именно ту ДНК, которая синтезируется при обучении, с другой стороны, последующее тестирование сохранности памяти дает возможность оценить, насколько необходима новосинтезированная ДНК для формирования/поддержания долговременной памяти. Для доказательства того, что амнестистические эффекты IdU и BrdU обусловлены влиянием на новосинтезированную ДНК, они были подтверждены аналогичными амнестическими эффектами ингибиторов синтеза ДНК (З -амино-З1-дезокситимидина и З -азидо-З -дезокситимидина). Механизмы действия IdU на ДНК изучены более детально (Morris, Cramer, 1966, 1968), кроме того, в предшествующих исследованиях для нарушения памяти были необходимы меньшие дозы 5 -йодо-2 -дезоксиуридина, чем 5 -бромо-2 -дезоксиуридина (Анохин, неопубликованные данные; Reinis, 1972), в связи с этим в исследованиях амнезии преимущественно использовали IdU. Основные амнестические эффекты IdU были подтверждены для 5 -бромо-2 -дезоксиуридина, который использовали преимущественно для мечения синтезирующих ДНК клеток.
Таким образом, использованный в настоящей работе подход позволяет одновременно оценить уровень синтеза ДНК в мозге при обучении и определить, насколько необходим синтез данной ДНК для формирования памяти.
Исследование проводили на новорожденных цыплятах домашней курицы (Gallus gallus). В настоящее время цыплята широко используются для изучения механизмов консолидации и реорганизации памяти (Rose, 2000; Matsushima, 2003). Будучи зрелорождающимися животными, уже через несколько часов после вылупления цыплята готовы активно исследовать окружающую среду. В связи этим у новорожденных цыплят возможен широкий спектр различных видов обучения, таких как импринтинг, зрительная дискриминация пищевых объектов, пространственное обучение и пр. (Rose, 2000; Matsushima, 2003). Отсутствие у новорожденных цыплят индивидуального опыта позволяет предположить, что обучение в первые дни жизни должно вызывать в их мозге значительные пластические перестройки (Rose, 2000).
Модели пассивного избегания и импринтинга в настоящее время активно используются для исследования механизмов долговременной пластичности (Rose, 2000; Horn, 2004). Системные и молекулярные механизмы зрительного импринтинга были детально исследованы в работах Хорна с соавторами (Хорн, 1988; Horn, 2004). Известные к настоящему моменту процессы, лежащие в основе молекулярных механизмов консолидации памяти, были подробно изучены на модели пассивного избегания у цыплят Роузом с соавторами (Rose, 2000) и другими исследователями (Andrew, 1991). Таким образом, одним из преимуществ использования новорожденных цыплят в исследованиях механизмов памяти является большое количество известных экспериментальных фактов о системных и молекулярных механизмах памяти у этих животных.
Другим преимуществом использования цыплят в настоящей работе является то, что в первые дни жизни череп цыплят не оссифицирован, и это позволяет вводить им необходимые препараты непосредственно в мозг без имплантации канюль, анестезии и пр. Кроме того, незамкнутость гематоэнцефалического барьера у цыплят способствует быстрому проникновению в мозг препаратов, вводимых внутрибрюшинно (Rose, 2000).
В работе использовали четыре принципиально различные модели обучения цыплят - импринтинг, пространственное обучение в лабиринте, вкусовую аверсию на бусину и пассивное избегание. В основе импринтинга, вкусовой аверсии и пассивного избегания лежит реализация врожденных предрасположенностей цыплят: в случае импринтинга это формирование реакции следования за матерью, в случае пассивного избегания и вкусовой аверсии используется врожденная склонность клевать небольшие яркие объекты. Эти виды обучения относятся к категории раннего обучения и возможны только в критический период - первые 1-3 дня после рождения (Bolhuis, 1991; Barber et al., 1998; Rose 2000). В этом возрасте у цыплят наблюдается активный синтез ДНК в паренхиме конечного мозга, чувствительный к действию внешних факторов, в том числе обучения импринтингу и пассивному избеганию (Dermon et al., 2003, Nikolakopoulou et al., 2006; Комиссарова, Анохин, 2007). Как было показано ранее, оба вида обучения вызывают повышение числа содержащих BrdU клеток в различных структурах мозга цыплят уже через 24 ч после обучения.
Вкусовая аверсия может быть выработана у цыплят на различные виды пищи (цветная бусинка, зерно, окрашенная вода и пр.) в разном возрасте (Gaston, 1977; Martin, Bellingham, 1979; Barber et al., 1998). В настоящей работе для выработки вкусовой аверсии у новорожденных цыплят использовали цветную бусину. Этот тип вкусовой аверсии также в определенной степени является «ранним» обучением, поскольку отсутствие неофобии и склонность клевать незнакомые объекты проявляется только у новорожденных цыплят. Вкусовая аверсия у цыплят исследована в меньшей степени, чем пассивное избегание и импринтинг, однако было показано, что у млекопитающих формирование памяти в этой модели может быть нарушено введением антиметаболита Ara-C (Wang et al., 2003). В отличие от других трех моделей обучения, пространственное обучение в лабиринте не относится к категории раннего обучения и возможно, начиная с 3-4 дня после рождения (Jakupi, Rickard, 2004). Таким образом, использование широкого спектра моделей обучения для исследования амнестических эффектов IdU, BrdU и ингибиторов синтеза ДНК позволяет определить, насколько универсален описанный ранее феномен нарушения памяти этими препаратами, и, следовательно, насколько универсален может быть ДНК-зависимый механизм формирования и поддержания долговременной памяти. 1.2 Цель и задачи исследования Цель работы: исследовать влияние галогенизированных нуклеотидных аналогов на формирование и поддержание разных видов долговременной памяти у новорожденных цыплят, а также синтез ДНК в мозге при этих воздействиях.
Задачи работы:
1. Выявить возможные амнестические эффекты 5 -йодо-2 -дезоксиуридина (IdU) у цыплят в моделях обучения (1) пассивному избеганию, (2) вкусовой аверсии, (3) импринтингу, (4) при пространственном обучении в лабиринте.
2. В моделях, где введение IdU вызывало амнезию, исследовать влияние
5 -бромо-2 -дезоксиуридина (BrdU) и ингибиторов синтеза ДНК З -амино-З дезокситимидина (АМТ) и З -азидо-З -дезокситимидина (АЗТ) на формирование долговременной памяти.
3. В моделях обучения, где введение IdU, BrdU и ингибиторов синтеза ДНКвызывало амнезию, при помощи метода иммуногистохимической детекции BrdU определить, где и когда под влиянием обучения в мозге цыплят можетиндуцироваться синтез ДНК.
1.3. Научная новизна работы
Было исследовано влияние галогенизированных нуклеотидных аналогов (IdU и BrdU) на формирование памяти у цыплят при обучении в разных экспериментальных моделях, и впервые обнаружено избирательное амнестическое действие 5 -йодо-2 -дезоксиуридина при обучении цыплят в модели вкусовой аверсии. В других использованных моделях обучения -импринтинге, пассивном избегании и обучении в лабиринте, нарушения памяти под влиянием IdU обнаружено не было. Связь амнестического действия IdU в модели вкусовой аверсии с синтезом ДНК было подтверждено эффектами аналога IdU 5 -бромо-2 -дезоксиуридина (BrdU), а также субстратного ингибитора ДНК-полимераз широкого спектра действия З -амино-З -дезокситимидина (АМТ). Впервые было обнаружено нарушение памяти у цыплят при обучении вкусовой аверсии под влиянием ингибитора обратной транскрипции З -азидо-З -тимидина (AZT), что дает основание предполагать вовлечение синтеза ДНК и обратной транскрипции в мозге в механизмы консолидации памяти при обучении вкусовой аверсии. Впервые было исследовано включение BrdU клетками мозга цыплят через короткий срок после обучения - через 2ч. Впервые была продемонстрировано повышение числа BrdU-содержащих клеток уже через 2 ч после обучения вкусовой аверсии в промежуточном медиальном мезопаллиуме (IMM) - структуре, критически необходимой для этого вида памяти, что свидетельствует об индукции синтеза ДНК под влиянием обучения в этой области мозга. После 40-минутной процедуры импринтинга такого повышения включения BrdU не наблюдалось. Показано, что к 24 ч после обучения вкусовой аверсии более высокий уровень включения BrdU в IMM, который наблюдался у обученных животных через 2 ч после обучения, нивелировался повышением числа BrdU-позитивных клеток в данной области у животных контрольной группы. В то же время, через 24 часа после обучения в дорсальном и апикальном гиперпаллиуме обученных цыплят наблюдались более отставленные эффекты обучения вкусовой аверсии -снижение плотности BrdU-позитивных клеток у обученных животных по сравнению с контрольной группой, не получавшей хлорид лития.
Полученные данные впервые выявляют отличие механизмов консолидации памяти при выработке вкусовой аверсии от процессов, лежащих в основе формирования памяти при обучении в лабиринте, импринтинге или пассивном избегании. В совокупности, результаты работы указывают на возможность участия синтеза и функционирования новосинтезированной ДНК в поддержании долговременной памяти вкусовой версии.
1.4. Научно-практическое значение работы
Результаты данной работы позволяют расширить представления о молекулярных механизмах, обеспечивающих приобретение и хранение долговременной памяти в нервной системе.
Полученные результаты показали, что в основе обучения вкусовой аверсии могут лежать процессы, принципиально отличные от механизмов консолидации памяти в других исследованных моделях обучения и связанные с de novo синтезом ДНК. Это делает вкусовую версию перспективной моделью для изучения вовлечения синтеза ДНК в процессы долговременной памяти.
Обнаруженные амнестические эффекты ингибитора обратной транскрипции З -азидо-З -тимидина, в совокупности с данными, полученными ранее при обучении мышей активному избеганию (Анохин с соавт., 1988), дают основания для дальнейшего исследования возможного участия обратной транскрипции в механизмах консолидации долговременной памяти, в частности, более тонкого изучения молекулярных механизмов этого процесса.
Современные представления о механизмах памяти
Современные представления о механизмах памяти В 1949 г. Хеббом была выдвинута гипотеза о двойном механизме поддержания следа памяти, которая легла в основу современных представлений о механизмах памяти (Hebb, 1949). Согласно Хеббу, поддержание памяти обеспечивается двумя последовательно сменяющими друг друга фазами синаптических модификаций — кратковременной (до 1 минуты) и долговременной (постоянной). В основе поддержания кратковременной памяти лежит, по мнению автора, образование циклов реверберации в нейронных цепях, а в основе сохранения долговременной памяти - модификация синаптических связей нейронов, активных во время обучения. Предположение Хебба, что «ревербераторный след может взаимодействовать со структурными изменениями и хранить память до тех пор, пока не будут сделаны новообразования долговременной памяти», дало физиологическое основание для различий между последовательными механизмами кратковременной памяти, зависящей от нейрональной активности, и долговременной памяти, зависящей от структурных новообразования (Hebb, 1949).
В то же время, Дунканом было продемонстрировано нарушение формирования навыка активного избегания у крыс, подвергнутых после сеанса обучения воздействию электросудорожного шока (ЭСШ) (Duncan, 1949). Впоследствии было установлено, что и многие другие экспериментальные воздействия обладают амнестическим эффектом: такие агенты как метразол (Palfai and Chillag, 1971), некоторые анестетики (Abt et al., 1961), электростимуляция отдельных зон лимбической системы (Kesner and Doty, 1968), гипотермия (Beitel and Porter, 1968), гипертермия (Misanin et al., 1979), блокаторы синтеза белка (Davis and Squire, 1984) оказались способными вызывать нарушения памяти. Доминирующей интерпретацией данных подобного рода была гипотеза о том, что амнестические агенты нарушают, прерывают, на каком либо этапе процесс консолидации долговременной памяти (McGaugh, 1966).
К настоящему времени накоплено большое количество сведений о молекулярных процессах, специфическое нарушение которых приводит к повреждениям памяти (Gibbs, Ng, 1977; Davis, Squire, 1984; Mondadori et al, 1989; Jerusalinsky et al., 1992, 1994; Burchuladze, Rose, 1992; Scholey et al., 1993; Rickard et al., 1994; Holscher, Rose, 1992, 1994; Izquierdo, Medina, 1997; Mileusnic et al., 1999; Cammarota et al., 2000; Isquierdo, McGaugh, 2000; Bonini et al., 2003; Rossato et al., 2004). На основании этих данных была предложена гипотеза, описывающая молекулярный каскад консолидации долговременной памяти (Goelet et al, 1986; Morgan and Curran, 1986; Rose, 1991; Анохин, 1997). Было показано, что молекулярные механизмы консолидация памяти у животных разных видов и в разных моделях обучения носят принципиально сходные черты, хотя и отличаются в частностях (Allweis, 1991). Так, были получены данные о том, что память может быть нарушена ингибиторами синтеза белка и РНК (Agranoff et al., 1967; Agranoff, 1968; Davis, Squire, 1984). Было также обнаружено, что ингибиторы синтеза РНК и белка нарушают долговременную, но не кратковременную память, кроме того, их введение было эффективно только в ограниченный период времени в течение одного или двух часов после обучения (Dingman, Sporn, 1961;
Agranoff, 1968; Barondes, Cohen, 1968). Этот узкий период, в котором были эффективны ингибиторы синтеза макромолекул, перекрывался с критическим периодом, когда формирование памяти могло быть нарушено нанесением электроконвульсивного шока (Duncan, 1949). Таким образом, возникло предположение, что оба класса воздействий нарушают одни и те же фундаментальные процессы, лежащие в основе консолидации долговременной памяти и базирующиеся на экспрессии генов de novo в нервной системе.
В качестве элементов молекулярного каскада, необходимого для консолидации памяти, выделяют активацию синаптических рецепторов, следующую за этим активацию систем вторичных посредников, активацию протеинкиназ, которые фосфорилируют белки - транскрипционные факторы, запускающие, в свою очередь, экспрессию генов (Isquierdo et al., 2006).
Наиболее детально молекулярные механизмы формирования памяти и долговременной пластичности были исследованы в гиппокампе грызунов при обучении в модели пассивного избегания и в модели условно-рефлекторного замирания (Isquierdo, Medina, 1997; Isquierdo, McGaugh, 2000; McGaugh, 2000; Isquierdo et al., 2006), а также у цыплят при обучении в модели пассивного избегания (Ng et al., 1997; Rose, 2000). Оказалось, что в гиппокампе млекопитающих различные виды однократного обучения вызывают в целом сходные пластические перестройки (Izquierdo, Medina, 1997; Isquierdo, McGaugh, 2000; McGaugh, 2000), которые наблюдаются также и в промежуточном медиальном мезопаллиуме цыплят при обучении в модели однократного пассивного избегания (Rose, 2000). В мозге млекопитающих молекулярные основы долговременной пластичности были также детально исследованы в области СА1 гиппокампа с использованием феномена долговременной потенциации (ДВП) (Malenka, 2003, Isquerdo et al., 2006). Было показано, что последовательность молекулярных процессов при ДВП близка к той, которая наблюдается при консолидации памяти у животных (Bliss, Collingridge, 1993; Roberson 1999; Routtenberg, 2000).
В гиппокампе млекопитающих пластические перестройки при консолидации памяти инициируются активацией глутаматных рецепторов - NMDA-рецепторов (Worley et al., 1990; Ghosh and Greenberg, 1995; Finkbeiner and Greenberg, 1998), метаботропных и АМРА-рецепторов (Isquierdo, Medina, 1997; Martin 2000; Riedel et al., 2003). Активность NMDA-рецепторов необходима в течение 30 мин после обучения, тогда как АМРА-рецепторы вовлечены в пластические перестройки в течение более чем 3 ч после обучения (Jerusalinsky, 1992, Bonini et al., 2003; Rossatto et al., 2004). Дофаминовые рецепторы, адренорецепторы и холинорецепторы также могут участвовать в пластических изменениях в гиппокампе при обучении или выполнять модуляторные функции (Greenberg et al., 1986; Dragunow et al., 1996; Cirelli and Tononi, 2000; Kang et al., 2000; Radulovic et al., 2000). Долговременная потенциация в глутаматэргических синапсах, по-видимому, также индуцируется через NMDA-рецепторы, а поддерживается благодаря АМРА-рецепторам (Collingridge and Singer, 1990). Аналогичным образом, при обучении цыплят пассивному избеганию для формирования памяти необходима активность NMDA-рецепторов в промежуточном медиальном мезопаллиуме в течение первых 30 мин после обучения (Stewart et al., 1992; Steele et al. 1995). Через 5,5 ч после обучения в этой области повышается количество АМРА-рецепторов, и блокада АМРА-рецепторов через 5,5 ч после обучения приводит к амнезии (Steele and Stewart 1995; Salinska et al., 1999).
Активность глутаматных рецепторов приводит к повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция (Murphy et al., 1991; Salinska et al., 1999). В клетки гиппокампа кальций поступает через постсинаптические потенциал-зависимые каналы L-типа (Murphy et al., 1991; Finkbeiner and Greenberg, 1998), причем изменение концентрации Ca2+ может быть как локальным, так и распростаняться в качестве регенеративной кальциевой волны (Berridge, 1998; Hardingham et al., 2001).
Параллельно с процессами в постсинаптическом нейроне, через систему обратных мессенджеров запускаются аналогичные биохимические процессы в пресинаптическом нейроне (Rose, 2000). Наиболее вероятными обратными мессенджерами считаются оксид азота (NO) и арахидоновая кислота, образование которой контролируется кальций-зависимыми ферментами NO-синтазой и фосфолипазой А2 соответственно (Shuman and Madison, 1991; Holscher and Rose, 1992, 1994). Проникая через синаптическую щель к пресинаптическому окончанию, обратные мессенджеры вызывают открытие потенциал-зависимых кальциевых каналов и возрастание концентрации кальция, что вызывает увеличение выброса медиатора в синаптическую щель (Sher and Clementi, 1991). У цыплят кальций-зависимое увеличение высвобождения глутамата связано с активностью N-типа пресинаптических кальциевых каналов, но не каналов L-типа (Clements et al., 1995).
Исследования неирогенеза в мозге птиц и млекопитающих, как возможного механизма долговременной пластичности
Открытие нейрогенеза у млекопитающих Альтманом в 1962 году опровергло одну из центральных физиологических догм о том, что в мозге зрелых млекопитающих не могут рождаться новые нейроны (Altman, 1962). У взрослых млекопитающих нейрогенез происходит в субвентрикулярной зоне (SVZ), которая примыкает к вентрикулярной зоне, и приурочен к нескольким небольшим областям в мозге - это субвентрикулярная зона латеральных желудочков, зубчатая извилина гиппокампа и в раннем постнатальном периоде - наружный гранулярный слой мозжечка (Garcia-Verdugo et al., 2002, Alvarez-Buylla et al., 2001). Также имеются свидетельства о наличии неирогенеза в хвостатом ядре у кроликов (Luzzatti et al., 2006), а также в неокортексе (Gould et al., 2001) и в миндалине (Bernier et а., 2002) приматов. Нейрогенез в субвентрикулярной зоне и зубчатой фасции взрослых животных происходит очень активно, в связи с чем возник вопрос о возможных функциях новорожденных клеток, а также о возможности их участия в пластических перестройках в этих структурах при приобретении нового опыта. В большинстве работ новые клетки выявляют иммуногистохимически по колокализации 5 -бромо-2 -дезоксиуридина (Brdll) и одного из маркеров зрелых (NeuN-позитивных) или незрелых (Tujl-p-позитивных) нейронов (Cooper-Kuhn, Kuhn, 2002). По достижении определенной степени зрелости эти клетки при обучении или судорогах могут экспрессировать ряд «ранних генов», т.е. в них могут происходить процессы, характерные для зрелых нейронов (Jess, Kempermann, 2003; Kee et al., 2007).
В зубчатой извилине взрослой крысы каждый месяц образуется до 15-20% новых клеток. Однако в течение первых 1-2-недель жизни большая часть новообразованных клеток погибает (Gould, Gross, 2002), поэтому их общее число в гиппокампе значительно не меняется. Оставшиеся в живых нейроны могут существовать достаточно долго: у крысы в зубчатой извилине не менее чем 8 месяцев, у обезьяны в зубчатой извилине и неокортексе - более 12 недель, в зубчатой фасции человека - по крайней мере, 2 года (Gould & Gross, 2002). Существует ряд гипотез относительно того, какова функция неирогенеза в зубчатой фасции гиппокампа. Согласно Кемперманну (Kempermann, 2002), поскольку гиппокамп выполняет функцию временного «хранилища» памяти, новые нейроны вряд ли необходимы для сохранения долговременной памяти. По числу вовлеченных клеток и связей между ними гиппокамп можно назвать наиболее «узким местом» при получении новой информации из окружающей среды, т.к. по сравнению с другими структурами (например, разными областями коры), участвующими в этом процессе, в гиппокампе (в зубчатой извилине и поле САЗ) возбуждение проходит через относительное небольшое число клеток (Kempermann, 2002). При обогащении и усложнении среды в зубчатой фасции эта клеточная популяция увеличивается за счет усиленного неирогенеза, что может способствовать более эффективному формированию памяти, усвоению информации и, следовательно, выживанию организма (Kempermann, 2002).
Рядом авторов было показано, что различные внешние воздействия, такие как степень обогащенности среды (Nilsson et al., 1999), в которой обитает животное, или физические нагрузки (Van Praag et al., 1999) усиливают неирогенез в зубчатой фасции гиппокампа. Было показано, что пространственное гиппокамп-зависимое обучение животных в лабиринте Морриса со скрытой платформой, но не гиппокамп-независмое обучение (с видимой платформой), приводит к усилению нейрогенеза (Gould et al., 1999). Впоследствии были получены данные, как подтверждающие, так и противоречащие результатам Гоулд с соавторами (Van Praag et al., 1999; Van de Borght et al., 2005; Erniger, Kempermann 2005). В частности, оказалось, что гиппокамп-зависмое обучение в лабиринте Морриса далеко не всегда приводит к усилению нейрогенеза. Так, если гиппокамп-зависимое обучение в лабиринте Морриса происходит в течение первой недели после инъекции BrdU, то стимулирующий эффект обучения, по-видимому, перекрывается с периодом массовой гибели нейронов, и, таким образом, обучение способствует выживанию большего числа новых клеток (Ambrogini et al., 2000). Если же обучение происходит более чем через неделю (через 8-10 дней) после рождения нейронов, то оно, наоборот, в значительной степени (приблизительно на 50%) снижает число новых клеток в гиппокампе, т.е. препятствует их выживанию (Ambrogini et al., 2004).
Гиппокамп-зависимое обучение, коразоловые и каинатные судороги могут вызывать долговременные пластические перестройки в новых клетках гиппокампа, которые образовались более чем за 2 недели до этого (Jessberg&Kempermann, 2003). Было показано, что обучение в водном лабиринте Морриса через 1,5 месяца после введения BrdU вызывает экспрессию раннего гена c-fos в отдельных клетках-зернах зубчатой извилины, при этом активируется такая же доля (около 4%) новых BrdU-содержащих клеток (Jessberger&Kempermann, 2003). Каинатные и коразоловые судороги также индуцируют экспрессию ранних генов c-fos, zif268 и HomerIA в равной степени (приблизительно 80%) как в старых, так и в новых клетках гранулярного слоя. В то же время, в другом исследовании экспрессии c-fos в BrdU-положительных клетках зубчатой фасции при обучении в лабиринте Морриса было показано, что через 4 недели после введения BrdU вызванные обучением пластические перестройки, которые отражает экспрессия c-fos, происходят преимущественно в «молодых» нейронах гиппокампа, содержащих BrdU (Kee et al., 2007).
Вводимые вещества и способы инъекций
Одним из первых исследований амнестического действия нуклеотидных аналогов была работа Касолы с соавторами (Casola et al., 1968), где исследовалось влияние антиметаболита цитозин-арабинозида (Ага-С), ингибирующего ДНК-полимеразы, на сохранность памяти у золотых рыбок в модели активного избегания. В этом случае у рыбок вырабатывали реакцию избегания одного из отсеков экспериментальной камеры, куда подавался электрический ток. В данной модели обучения у рыбок сохранность памяти зависела не от синтеза ДНК, а от синтеза белка, что подтверждалось амнестическим действием ингибитора синтеза белка пуромицина.
Однако в 1970-72 гг. Рейнисом с соавторами были опубликованы работы, демонстрирующие амнестическое действие разных антиметаболитов и положившие начало линии исследований роли синтеза ДНК в механизмах памяти (Reinis, 1971; Reinis et al., 1972). Рейнисом было показано амнестическое действие различных нуклеотидных аналогов (5 -йодо-2 -дезоксиуридин, йодоурацил, гидроксиламин, диаминопурин) на формирование памяти у мышей при обучении в модели пассивного избегания (светло-темной камере) (Reinis, 1971; Reinis et al., 1972). Наиболее детально им было изучены эффекты антиметаболита 5 -йодо-2 -дезоксиуридина (IdU) (Reinis et al., 1972). Интракраниальное введение мышам IdU приводило к снижению включения радиоактивно меченного тимидина на 20% в течение 2 ч, т.е. ингибировало синтез ДНК, но при этом не оказывало влияния на синтез РНК и на интенсивность клеточного дыхания, отражающего общий уровень метаболизма. Мышам вводили 0,03M IdU интракраниально за 24 ч, за 2 ч до обучения или через 5 мин, 1 ч или 24 часа после обучения. Сохранность памяти тестировали через 24 ч, 48 ч, 72 ч или через неделю после обучения. Введение IdU за 2 часа до обучения приводило к выраженной амнезии, которая развивалась только к третьему дню после обучения и сохранялась в течение первой недели после обучения. Инъекция через 24 ч после обучения вызывала амнезию только в тесте через неделю после обучения. Амнестическое действие IdU полностью снималось одновременным введением тимидина.
Интересно, что в этих экспериментах амнезию вызывали инъекции IdU задолго (не менее чем за 2 ч) до обучения либо через длительное время (не менее, чем через 24 ч) после обучения, когда процесс обучения не попадал на тот период, когда IdU снижал интенсивность синтеза ДНК. Таким образом, амнестические эффекты 5-йодо-2 -дезоксиуридина, по-видимому, были обусловлены не неспецифическим ингибированием синтеза ДНК, а нарушением транскрипции и трансляции новосинтезированной ДНК. Близкие амнестические эффекты в модели пассивного избегания оказывали антиметаболиты диаминопурин и йодоурацил (они вызывали амнезию также при введении через час после обучения) (Reinis, 1971), а для диаминопурина Рейнисом также было продемонстрировано амнестическое действие при обучении мышей в водном лабиринте (Reinis, 1971), причем нарушения памяти наблюдались только когда диаминопурин вводили перед первой сессией обучения, более позднее введение не оказывало эффекта.
Исследования амнестических эффектов ингибиторов синтеза ДНК были продолжены Анохиным с соавторами (Анохин с соавт., 1988). Для этого использовали субстратный ингибитор синтеза ДНК широкого спектра действия -З -амино-З -дезокситимидин (АМТ) и специфический субстратный ингибитор обратной транскриптазы З -азидо-З -дезокситимидин (AZT) (Краевский, Куханова, 1986). Животных обучали в модели пассивного избегания в светло-темной камере («Stephrough») и в камере с приподнятой платформой и электродным полом («Step down»), а за час до обучения внутрибрюшинно вводили AZT или АМТ. Оба ингибитора в дозах от 5 до 80 мг/кг не нарушали формирования навыка пассивного избегания и не влияли на общую двигательную активность и болевую чувствительность животных. Однако к третьим суткам после обучения у мышей развивалась амнезия, которая достигала наибольшей выраженности через 7 суток после обучения. Действие этих ингибиторов отличалось от эффектов известных блокаторов синтеза белка: З -азидо-З -дезокситимидин нарушал память при введении в течение 3 ч после обучения, З -амино-З -дезокситимидин - в течение 5 часов после обучения, а вызванные ими нарушения памяти проявлялись не ранее, чем через 3 суток после обучения (Анохин с соавт., 1988; Белоцерковская 1991). Эти данные хорошо согласуются результатами, полученными Рейнисом с использованием 5-йодо-2 -дезоксиуридина (Reinins et al., 1972), кроме этого, амнестические эффекты AZT дают экспериментальные доказательства гипотезы о роли обратной транскрипции в механизмах формирования памяти (Salganik et al., 1983; см. ниже). Однако к настоящему времени стало известно, что З -азидо-З дезокситимидин, который использовался в экспериментах Анохина с соавторами, обладает не только антиревертазной активностью, но оказывает и другие эффекты, в частности ингибирует митохондриальную ДНК-полимеразу у (Lewis et al., 1994). Тем не менее, полученные Анохиным с соавторами уникальные данные 06 амнестическом действии AZT представляют большой интерес.
В более поздних работах Ванг с соавторами (Wang et al., 2003; Colon-Cesario et al., 2006) были исследованы амнестические эффекты антиметаболита арабинофуранозилцитозина (Ara-С), который в предшествующих исследованиях на золотых рыбках не нарушал формирования памяти (Casola et al., 1968), а также эффекты его трифосфатного производного (Ага-СТР). При интракраниальном введении этих веществ перед обучением крыс вкусовой аверсии у животных было нарушено формирование долговременной памяти, однако инъекция через 1 ч после обучения не оказывала амнестического действия. Авторы также показали, что in vitro Ara-С и Ага-СТР подавляют процесс негомологичного соединения концов ДНК (NHEJ), и полагают, что амнестическое действие этих веществ связано с ингибированием именно этого процесса. Однако известно, что Ага-СТР влияет не только на NHEJ, но и является конкурентным ингибитором ДНК полимераз аир, может встраиваться в ДНК, тем самым препятствуя её синтезу (Wang et al. 1990; Gandhi et al. 1997; Abdel-Aziz et al. 2000; Han et al., 2000).
Влияние «антиметаболитов» и ингибиторов синтеза ДНК на формирование долговременной памяти у цыплят при обучении в различных моделях
Ранее в нашей лаборатории (неопубликованные данные) и другими авторами (Reinis, 1972) были выявлены амнестические эффекты введения 5 -йодо-2 -дезоксиуридина мышам при обучении. В настоящей работе было исследовано влияние IdU на формирование памяти у цыплят в различных моделях обучения (импринтинг, обучение в лабиринте, вкусовая аверсия, пассивное избегание). Цыплят обучали в одной из моделей и вводили им IdU внутрибрюшинно до или после обучения в дозе 10 мг/кг, затем через 24-48 ч после обучения тестировали сохранность долговременной памяти.
Импринтинг Цыплят импринтировали в течение 40 мин на красный вращающийся куб, затем тестировали уровень предпочтения через 48 часов после обучения путем одновременного предъявления импринт-объекта (красного куба) и нового объекта (чучела курицы), для каждой экспериментальной группы подсчитывали значение коэффициента предпочтения (К). Введение IdU ни до, ни после обучения, не влияло на уровень предпочтения куба (Рис. 1). После инъекции IdU за 10 мин до обучения коэффициент предпочтения импринт-объекта был равен 0,60±0,43+ (п=19), тогда как в контрольной группе, подвергавшейся импринтингу и получавшей физиологический раствор за 10 мин до обучения, коэффициент предпочтения составил 0,65±0,37 (n=23, р=0,693, F(1;40)=0.157, ANOVA). При введении IdU через 1 ч после начала обучения коэффициент предпочтения импринт-объекта составил 0,57±0,47 (п=14), тогда как у контрольных животных, которым вводили физраствор через 60 мин после начала обучения, этот показатель был равен 0,69±0,41 (n=13, р=0.458, F(1;25)=0.569, ANOVA). В описанных выше экспериментах цыплята демонстрировали невысокое предпочтение импринт-объекта (К=0,6-0,7), в связи с этим в следующем эксперименте для получения более «сильной» памяти цыплят импринтировали в течение 2ч, тестировали не через 48 ч, а через 24 ч после обучения и в качестве нового объекта предъявляли не чучело курицы, а оранжевый шар. В этом случае IdU вводили за 5-10 мин до обучения в дозе 20 мг/кг. Однако в этом эксперименте введение IdU также не вызвало амнезии: у цыплят, получавших IdU, коэффициент предпочтения импринт-объекта составил 0,89±0,29 (п=10), тогда как у контрольных животных, которым вводили физраствор, этот показатель был равен 0,85±0,35 (n=8, р=0,788, F(1;16)=0.075, ANOVA).
В обоих случаях - как при использовании 40-минутной процедуры импринтинга, так и при 2-часовой процедуре импринтинга двигательная активность в тесте (среднее число оборотов колеса) по направлению к знакомому объекту (на который проводили обучение) и незнакомому объекту у цыплят, получавших физраствор и у цыплят, получавших IdU, не различалась (см. Рис. 1).
Таким образом, введение 5 -йодо-2 -дезоксиуридина ни до обучения, ни после обучения не вызывало достоверных изменений уровня предпочтения импринт-объекта, и, следовательно, не нарушало формирования долговременной памяти при импринтинге.
При обучении вкусовой аверсии цыплятам давали клюнуть белую бусину, а через 40-45 мин после этого внутрибрюшинно вводили хлорид лития, вызывающий болезненное состояние. В дальнейшем вид бусинки, на которую проводилось обучение, ассоциировался у цыплят с этим аверсивным состоянием, и они избегали её. Тестирование через 24 ч или через 48 ч после обучения показало, что в обоих случаях введение IdU в дозе 10 мг/кг до или после обучения приводило к развитию выраженной амнезии по сравнению с контрольными животными, которые получали физ.раствор вместо IdU (Рис. 3.1). Через 24 ч после обучения уровень избегания у контрольных цыплят, получавших физ.раствор за 5 мин до обучения (предъявления бусины), был равен 39% (п=18), а инъекция IdU в дозе 10 мг/кг за 5 мин до обучения приводила к достоверному снижению этого показателя до 7% (п=14, р=0.040, критерий х2. см- Рис- 3.1). Введение IdU через 10 мин после инъекции хлорида лития (т.е. через 50-55 мин после предъявления бусины) также приводило к достоверному снижению уровня избегания в тесте через 24 ч после обучения от 65% в контрольной группе (п=17) до 14% у цыплят, получавших IdU (п=21, р=0.014, критерий %2) При тестировании через 48 ч у животных, получавших IdU, также наблюдалась амнезия: у цыплят, которым вводили IdU через 55 мин после обучения, уровень избегания был равен 22% (п=18), тогда как в контрольной группе он составил 62% (п=16, р=0.017, критерий х2) Таким образом, введение цыплятам IdU при обучении вкусовой аверсии приводило к развитию амнезии.
Поскольку память в модели вкусовой аверсии оказалась чувствительна к действию IdU, обнаруженная амнезия была изучена более детально. Было исследовано влияние разных доз IdU на формирование памяти при вкусовой аверсии.
Вкусовая аверсия. Нарушение воспроизведения реакции избегания у цыплят, которым вводили IdU в дозе 10 мг/кг до или после обучения, тест через 24 ч после обучения. р 0.05, критерий х2 Рис. 3.2. Вкусовая аверсия. Нарушение воспроизведения реакции избегания у цыплят под влиянием различных доз IdU. Тест через 24 ч после обучения. р 0.05, #0.05 р 0.06, критерий х2 Цыплят обучали вкусовой аверсии по стандартному протоколу, а через 55 мин после предъявления бусины внутрибрюшинно вводили IdU в дозах 1, 3, 10 и 20 мг/кг. Введение IdU во всех использованных дозах значительно снижало уровень избегания бусины по сравнению с контрольными животными (Рис. 3.2). В тесте через 24 ч после обучения у контрольных животных, получавших физраствор, избегание бусинки было на уровне 64% (п=14), при введении IdU в дозе 1 мг/кг - 22% (п=18, р=0.016, критерий х2) в дозе 3 мг/кг - 29% (п=17, р=0.052, критерий х2), в дозе 10 мг/кг- 21% (п=14, р=0.022, критерий х2), и в дозе 20 мг/кг - 18% (п=17, р=0.008 критерий х2)- Различия между контрольной группой и группой, получавшей 3 мг/кг IdU, были статистически значимы на уровне тенденции (для остальных доз - достоверны). Таким образом, введение IdU при обучении вкусовой аверсии в диапазоне доз от 1 до 20 мг/кг приводило к развитию амнезии.
Чтобы проверить, как долго после обучения формирование памяти при вкусовой аверсии чувствительно к действию IdU, был проведен эксперимент, где цыплят обучали и внутрибрюшинно вводили IdU через 2 ч после предъявления бусины (т.е. через 1 ч 15 мин после инъекции хлорида лития) в дозе 10 мг/кг. Тестировали животных через 24 ч после обучения, контрольной группе вводили физраствор через 2 ч после предъявления бусины. В качестве дополнительного контроля в эксперимент была добавлена группа цыплят, получавших IdU через 10 мин после инъекции UCI, у которой должна была развиться амнезия, а также соответствующая им контрольная группа, получавшая физраствор. В тесте через 24 ч после обучения уровень избегания у цыплят, получавших IdU через 2 ч после предъявления бусины, не отличался от уровня избегания контрольных животных, получавших физраствор в это же время (Рис. 4.1). У цыплят, получавших IdU, уровень избегания составил 33% (п=16), в контроле - 44% (п=18, р=0.533). В то же время у цыплят, получавших IdU через 10 мин после введения LiCI, развивалась выраженная амнезия: у контрольных животных наблюдалось избегание на уровне 47% (п=19), а у цыплят, получавших IdU - на уровне 6% (п=18, р=0.004, см. Рис. 4.1). Кроме того, у цыплят, которым вводили IdU через 10 мин после инъекции хлорида лития (т.е. через 55 мин после предъявления бусинки), уровень избегания был достоверно ниже, чем у цыплят получавших IdU через 2 ч после обучения (р=0.035). Таким образом, в модели вкусовой аверсии память через 2 часа после предъявления бусины была уже недоступна для нарушения 5 -йодо-2 -дезоксиуридином.
Чтобы определить, насколько быстро после обучения под действием IdU развивается амнезия, были проведены следующие эксперименты. Цыплят обучали по стандартному протоколу, IdU вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг через 10 мин после инъекции хлорида лития (т.е. через 55 мин после предъявления бусины). Однако избегание тестировали не через 24 ч, а через 3 ч или через 6 ч (отдельные группы для каждой временной точки) после обучения. Контролем служили группы цыплят, которым вводили физраствор через 10 мин после инъекции хлорида лития и тестировали через 3 ч или через 6 ч после обучения.
